プロシージャおよび自動キャピラリー電気泳動を用いた免疫測定法のためのキーの最適化戦略

この手順の全体的な目標は、市販のプラットフォームを使用してキャピラリー電気泳動イムノアッセイを実証することです。このプラットフォームは、細胞培養組織や生体液から得られる生体サンプルからタンパク質ターゲットを区別し、定量します。このプロセスでは、2キロダルトンから440キロダルトンの範囲のサイズに基づいてタンパク質を検査します。

ウェスタンブロットなどの従来の手順に対するこの自動手順の利点は、キャピラリー電気泳動イムノアッセイにより、ゲル、転写装置、および手動洗浄が不要になることです。また、必要なタンパク質の絶対量は約10分の1であるため、希少な細胞タイプや限られたサンプルに最適です。さらに、自動化システムを使用してわずか3時間で結果が得られ、従来のウェスタンブロット手順よりも定量的で再現性が高いことが示されています。

サンプルバッファー、ジチオスレイトール、蛍光マスターミックス、ビオチン化ラダーなどのサンプルと試薬を、メーカーの製品添付文書に従ってキットから調製します。お好みの方法でタンパク質サンプルを調製します。ここでは、BEAS-2B細胞培養物から全細胞抽出物を単離しました。

タンパク質サンプルをサンプルバッファーで希釈します。5-X蛍光マスターミックス1部と希釈したサンプル4部を混合して、目的の最終タンパク質濃度を達成します。計算例は、1マイクロリットルあたり1.2マイクログラムのタンパク質ストック濃度をマイクロリットルあたり1.2マイクログラムのタンパク質ストック濃度から始めて、マイクロリットルあたり0.2マイクログラムの最終タンパク質濃度を70マイクロリットルにするための方法を示しています。

マスターミックスは総容量の1/5で、この場合は14マイクロリットルです。必要なタンパク質ストックの量を計算するには、目的の最終濃度に総量を掛け、タンパク質ストック濃度で割ります。総容量からマスターミックスとストックの容量を差し引いて、サンプルバッファーの容量を計算します。

調製したサンプルとはしごを、摂氏95度で5分間加熱して変性させます。一部のタンパク質は、より穏やかな変性条件を必要とする場合があることに注意してください。たとえば、タンパク質の凝集を防ぎ、移動を改善するために、70度で10分間です。

高分子量で重い汚れがある場合は、このオプションを検討してください。提供された希釈液で目的の抗体希釈液を調製します。抗体は、一般に、従来のウェスタンブロッティングよりもキャピラリーベースのイムノアッセイに高濃度で使用されます。

ルミノールと過酸化物の1対1の混合物を、使用するたびに新鮮に調製します。サンプルと試薬をテンプレートに示されている容量を使用してアッセイプレートにピペットで移します。色分けは、試薬とサンプルをアッセイプレートに適切にロードすることを表します。

ビオチン化ラダーをA1ウェルにピペットで固定し、A2からA25までのウェルにサンプルを調製します。抗体希釈剤をウェルB1〜B25およびウェルC1に提供した。C2からC25までのウェルに対する一次抗体。ストレプトアビジンHRPからD1まで。ウェルD2からD25への二次抗体。

そして、ルミノール-過酸化物混合物をウェルE1〜E25に混合します。大きい方のミッドプレートウェルの最初の3列に洗浄バッファーを追加します。キャピラリーイムノアッセイ装置の電源を入れ、付属のソフトウェアを開きます。

製造元の指示に従ってキャピラリーカートリッジとアッセイプレートをマシンにロードし、実行を開始します。分析が完了したら、蛍光標準物質が正しく同定され、必要に応じて正しいことを確認します。さらに、ビオチン化ラダーが、使用したキットの正しいサイジングピークを示していることを確認します。

詳細については、製造元のクイックリファレンスガイドまたは製品マニュアルを参照してください。曝露時間、タンパク質濃度、抗体希釈などのアッセイ条件の最適化は、正確で再現性のある結果を得るために重要です。これらの条件は、各モデルシステムの抗体の組み合わせに特異的であるため、新しいアッセイごとに経験的に決定する必要があります。

定量的な結果を生成する能力は、ルミノール基板が急速に枯渇していない露光時間の解析に依存します。基板の枯渇はシグナルの損失やシグナルのバーンアウトにつながります。これは、図2に示すように、さまざまな化学発光曝露時間でデータを調べることで決定できます。使用した機器での露光は、5秒から480秒の範囲でした。

レーンビューでは、p53 DO-1抗体でプローブしたBEAS-2B抽出物のタンパク質濃度が1〜500希釈で減少していることが示されました。装置ソフトウェアでピーク高さとして報告された化学発光シグナル係数が重ね合わされます。視覚バンドの強度は機器によって自動的に調整され、パネル間で比較することはできません。

ここで見られるように、ルミノールが枯渇すると、信号係数は順次長時間露光すると減少します。信号が消え始め、ピークは最も長い2つの露光で分裂します。このため、データ分析には15秒の短い露光時間が選択されました。

また、総タンパク質インプットは、特定のアッセイおよびモデルシステムごとに最適化する必要があります。定量的評価のためには、各アッセイの線形ダイナミックレンジ内で測定を行う必要があります。ここで、ピーク面積で測定されるシグナルの変化は、サンプル中のタンパク質量の変化に比例します。

ライセート滴定は、1〜500 p53 DO-1または1〜50 α-チューブリン抗体でプローブしたときのBEAS-2Bライセートのレーンビューを示しています。線形回帰分析により、アッセイがテストされた全範囲にわたって線形であることが確認されます。線形範囲の中央にある総タンパク質濃度は、どちらの方向でも潜在的な標的タンパク質の変動に対応するように選択しました。

最終的な最適化の考慮事項として、一次抗体の適切な希釈率を評価する必要があります。縫合濃度で抗体を使用することで、測定されたシグナルの変化がタンパク質量の変化のみによるものであることを確認できます。青とオレンジの点で示されている2つのBEAS-2Bタンパク質サンプルを、段階希釈したα-チューブリン抗体でプローブしました。

ピーク面積として測定された化学発光シグナルを、抗体希釈に対してプロットしました。飽和度は1〜50希釈付近で観察され、曲線は顕著なプラトーを開始します。したがって、この抗体の最適な希釈液として1〜50が選択されました。

このビデオを見れば、ProteinSimple Wes キャピラリーベースのイムノアッセイ装置でサンプルの調製、サンプルのロード、分析の実行に慣れることができるはずです。この手順をマスターすると、25個のサンプルを使用して3時間ですべての分析を実行できます。分析を行う際には、各キャピラリーとサンプルの品質管理を行うことが重要です。

これには、ビオチン化ラダーでの蛍光標準物質の検証が含まれます。ピークが誤って同定された場合は、分析ソフトウェアを使用して、主に正しいピークを特定し、誤って同定されたピークを排除する必要があります。研究室のすべての分子生物学技術と同様に、自分自身とサンプルを保護するために適切な個人用保護具を着用してください。

これには、白衣、手袋、安全ゴーグル、つま先が閉じた靴が含まれます。最適化は、測定される新しいターゲットごとに、または異なるサンプルソースが使用される場合に実行する必要があることに留意することが重要です。バリデーションとフォローアップのステップには、精製されたタンパク質またはエピトープを使用した抗体の特異性とシグナルの評価が含まれます。

一連のサンプル希釈液を使用してアッセイのダイナミックレンジをテストし、抗体濃度範囲にわたるシグナル飽和度を評価することにより、抗体希釈を最適化します。最適化されると、この毛細血管免疫法は、ウェスタンブロットなどの従来の方法と比較して、生体サンプルの標的タンパク質を測定するためのより迅速で定量的な方法を提供するはずです。