マウス内耳に標的薬の配布方法の比較研究：Bullostomy対 Transtympanicインジェクション

この研究の全体的な目標は、聴覚パラメーターと蝸牛細胞構造マーカーへの影響の観点から、内耳への局所薬物送達のための 2 つのマイクロ サージェリー アプローチを説明および比較することです。これらの手順は、聴覚分野、特に動物化学研究の発展における重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、侵襲性が最小限であることです。

そしてこれにより、物質は教訓的に内耳に到達することができます。これらの技術の適用は、その顕微手術が中耳での乾式送達に適しているため、難聴の治療にまで及びます。この方法の平和的なデモンストレーションは、水疱瘻造設術と経鼓室注射を学ぶのが難しく、解剖学的知識と外科的訓練を必要とするため、非常に重要です。

まず、麻酔をかけたマウスの反対側の耳に耳栓を装着して、主に単耳反応を得ます。次に、マウスを防音チャンバー内の加熱パッドに腹臥位に置きます。正のステンレス鋼の皮下針電極を頭蓋骨の頂点の上の耳の間の頭皮に配置します。

参照電極を耳介の下の耳下腺領域に配置します。次に、接地電極を背中、尾、または後肢の領域に配置します。正極と負極の電気インピーダンスを確認してください。

インピーダンスが3キロオーム未満であることを確認してください。事前に充填されたスピーカーを、選択した耳に面した一定の距離に置き、スピーカーの中心を外耳道に合わせます。スピーカーと耳の間に障害物がないこと、および耳介が完全に開いていることを確認してください。

選択したスピーカーにデジタル-アナログワークステーション出力を接続します。ここではフリーフィールドスピーカーを使用します。低ノイズで信号対雑音比が良好なアンプをアナログ/デジタル入力に接続します。

次に、プリセットされた刺激または適切なソフトウェアで設計された新しい信号を使用して、音響刺激を外部耳道に送達するプロセスを開始します。刺激を高強度から開始し、5〜10デシベルの音圧レベルステップで強度を下げます。刺激後の最初の10ミリ秒の電気的反応を記録し、誘発されたABR反応は6〜8ミリ秒で現れます。

ソフトウェアを使用して、プロトコルの記述部分に記載されているABRしきい値を決定します。承認されたプロトコルに従って麻酔を投与した後、つま先のつま先つまみに対する反応がなく、定期的な呼吸が提示されることにより、麻酔の手術面に到達したことを確認します。クリッパーを使用して首の腹面の毛皮を取り除き、ヒドロキシ-プロピル-メチル-セルロースベースのゲルで角膜角膜炎から目を保護します。

マウスを滅菌手術領域の褥瘡の仰臥位に置きます。ポビドンヨードベースの消毒液で皮膚をきれいにし、滅菌ドレープで覆います。メスを使用して下顎骨から鎖骨まで縦に2センチメートルの切開を行った後、手術用顕微鏡を覗いて顎下腺を特定します。

鉗子で両方の顎下腺を分離し、それらを引っ込めて、顔面神経の二腹筋の起源を特定します。次に、ハサミで顎筋の起点を切開し、腹側に引っ込めて、鼓膜の根底にある下内側の側面を露出させます。次に、27ゲージの針を使用してブラにドリルで穴を開け、開口部を作ります。

吸収性ゼラチンスポンジで穴を開けた部分から血液をきれいにします。丸い窓の膜にアブミ骨動脈を見つけます。34ゲージのカテーテルとガラス製のマイクロシリンジを使用して、3〜5マイクロリットルのビヒクル溶液を水疱瘻から丸い窓のニッチに直接ゆっくりと注入して充填します。

1〜2滴の組織接着剤で水疱瘻を密封します。顎下腺を初期位置に戻し、5-0シルク外科用縫合糸で皮膚切開を閉じます。創傷感染を避けるために、切開部の周りにポビドンヨードまたはクロルヘキシジンベースの消毒剤を塗布します。

マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを加熱パッドの上に置いておきます。動物は完全に回復した後にのみ、動物をホームケージに戻してください。マウスを側褥位に置き、前に示したように、外耳道の下の敗血症性手術領域で準備します。

外耳道の垂直部分に0.5センチメートルの縦方向の切開を行った後、手術用顕微鏡の助けを借りて鼓膜を見つけます。くるぶしのハンドルによって前部と後部に分かれている下部の弛緩部の上部の弛緩体を特定します。次に、弛緩部の尾側部分に小さな脊髄腔瘻造設術を行い、鼓膜のテンス部に追加の切開を行って、注射中の空気の排出を可能にします。

34ゲージのカテーテルに接続されたガラスマイクロシリンジを使用して、丸い窓のニッチに近い弛緩部から10〜15マイクロリットルの車両を、中耳がはっきりといっぱいになるまで静かに注入します。5-0シルク外科用縫合糸で皮膚の切開部を閉じ、前述のようにきれいにします。このグラフは、手術前とマイクロサージャリーの7日後、14日後、28日後に、8週齢の雄C57BL/6Jマウスのクリック刺激に対する反応のABR閾値を示しています。

水疱瘻造設術のデータはオレンジ色、経鼓室注射のデータは青色、手術を受けていない動物のデータは灰色で示されています。このグラフは、マイクロサージェリー後の同じ期間に8〜40キロヘルツの範囲のトーンバースト刺激に応答するABR閾値を示しています。ここでも、水疱瘻造設術と鼓膜貫通型アプローチとの間に有意差は観察されませんでした。

形態学的研究は、スカラ培地が水疱瘻造設術または経鼓膜注射によるビヒクル送達後に変化を示さないことを示しており、どちらの手順も単独では損傷を引き起こさないことを示しています。水疱瘻造設術を試みる際には、げっ歯類の中耳と内耳を取り巻く重要で解剖学的構造を見直すことを忘れないでください。これらの手順に従って、他の手法を実行することができます。

例えば、薬物動態研究のためのベルリンサンプリング その開発後、これらの技術は、聴覚神経科学の分野の研究者が、主にげっ歯類の動物モデルで潜在的な局所療法を探求するための道を開きます。このビデオを見た後、中耳に薬を投与する方法とげっ歯類の聴力を評価する方法についてよく理解しているはずです。