Name: マウス内耳に標的薬の配布方法の比較研究：Bullostomy対 Transtympanicインジェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶマウス内耳への局所薬物投与法としてbullostomyと鼓膜穿刺注射を比較検討する方法。聴性脳幹反応と蝸牛細胞構造を評価し、難聴治療研究に応用可能な低侵襲技術を解説します。

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著者は、彼らの技術サポートのためのゲノミクスおよび非侵襲性の神経機能評価施設（IIBM、CSIC-UAM）を感謝したいです。この作品は、スペインの「MINISTERIOデエコノミアのy Competitividad」（フェーダー-SAF2014-53979-R）と欧州連合（FP7-AFHELOとFP7-PEOPLE-TARGEAR）IVNへの助成金によってサポートされていました。

動物の取り扱い手順は、国際および国内の規制に従っていることを確認してください。プロトコルはそれぞれ、欧州共同体63分の2010 / EUとスペイン語RD 2013分の53のガイドラインに従っています。 1.一般的な動物の取り扱い<ol><li>標準食や飲料水でマウスを自由にフィード。実験動物学協会のための連合（FELASA）の勧告に従うことによって制御の健康と幸福。 </li></ol> 2.聴覚評価注：このようなABR 9などの非侵襲的処置で（この作業2、7、14および28日のpostmicrosurgeryに）手術後の前にテストの公聴会によって顕微手順の機能的影響を追跡し、何度も。 <ol><li> ABR試験のため、10（腹腔内ケタミン注射（100 mg / kg体重（BW）とキシラジン、すなわち短期間効果プロトコルでマウスを麻酔ミリグラム/キログラム、BW）。また、吸入麻酔下で聴力検査を行います。 注：ABRパラメータは麻酔プロトコル28によって影響を受ける可能性があるので、実験を通じて同じものを使用します。 </li><li>つま先ピンチ反射をテストすることによって、麻酔の深さを確認してください。 注：引っ込め反射が消えると、動物が聴覚テストを実行するために、麻酔の適切な深さに達しています。 </li><li>そのようなヒドロキシプロピルメチルセルロースベースのゲルなどの涙サプリメント、の局所投与により乾燥し、二次乾性角結膜炎から目を保護します。 </li><li>全体の手順の間に生理的温度（37.5から38℃）で、マウスを保管してください。電気的な干渉を避けるために、暖かい水ポンプと加熱パッドを使用してください。直腸プローブを用いて体温を監視します。常に動物が過熱しないように注意してください。 注：我々は、マウスとの間の表面消毒剤で加熱パッドをクリーニングすることをお勧めします。0は、麻酔導入および回収、電気加熱パッド、白熱灯または赤外光を用いることができます。 </li><li> ABR手順 注：ABRの登録については、波形作成するために、船内サウンドカードとコンピュータ・ワークステーションを使用します（アナログとデジタルを、DA出力、変換）や電気応答波形をデジタル化するためには、減衰器、オシロスコープと（デジタル、AD入力にアナログ）低インピーダンス増幅器。現代聴覚ワークステーション（ すなわちタッカーデービスTechonologies）は、単一のコンパクトなシステムでは、これらすべてのコンポーネントが含まれています。 <ol><li>周囲のノイズ干渉や残響（ 図1）を回避するために、音減衰チャンバー内の加熱パッドの上にうつ伏せに麻酔をかけたマウスを置きます。 </li><li>外耳道に音​​響刺激を提供します。プリセットの刺激や適切なソフトウェアに設計された新しい信号を使用してください。選択したスピーカーにDAワークステーションの出力を接続します。 注：FRE外耳道に挿入された電界または閉じた磁界のスピーカを使用することができます。なぜなら閉鎖系におけるプローブ挿入と音キャリブレーションの難しさのマウスで作業する場合、前者が好ましいです。フリーフィールドスピーカーは両耳を刺激し、バイノーラル応答を誘発します。自由音場スピーカーと、主にモノラル応答を得るためには、反対側の活動は、（耳栓とIE）やノイズをマスクすることにより閉塞することによって排除されなければなりません。 <ol><li>外耳道に整列し、スピーカーの中心とヘッドまたは選択した耳に直面して一定の距離（通常は5〜20センチメートル）で自由音場スピーカーを配置します。障害物がスピーカーと耳の間と耳介が完全に開放されていることではないことを確認してください。 </li></ol></li><li>次のようにステンレス鋼皮下針電極を配置した：i）頭蓋骨の頂点の上に耳の間の頭皮に積極的に（正）極（）、ⅱ）参照（負）極を、耳下腺に耳介の下の領域、およびiii）背中、尾または後肢地域の接地電極（ 図1）。 <ol><li>正極と負極に電気インピーダンスを確認してください。インピーダンスが3未満キロオーム（理想的には1キロオーム）であることを確認してください。それが高い場合は、アルコールできれいに、再配置または電極を交換してください。 </li></ol></li><li> ABRの記録のために、ブロードバンドをクリックすると、純粋なトーン周波数5〜10 dBのSPLは27、29、30ステップにおける音圧レベル（SPL）に90〜10デシベルから強度を低下させるに存在を生成します。 <ol><li>現在の簡単なクリックまたは音が刺激（1-5ミリ）高レベル（ すなわち 80または90デシベルSPL）で始まるし、5〜10 dBのSPLの段階で強度を低下させるバースト。刺激後の最初の10ミリ秒での電気的応答を登録する（ABR応答が6-8ミリ秒で表示される誘発）。 注：このため、刺激率50刺激/秒（通常レート20-50）よりも大きくすべきではありません。 </li></ol></li><li>増幅し、記録し、各刺激と強度に誘発電気的応答を平均します。低ノイズと良好な信号対雑音比を持つアンプを使用し、AD入力に接続します。 注：のABRは、典型的には、（ピーク・ツー・ピーク）1μVの下に、非常に低い振幅を持っており、非常に低ノイズでアンプを使用して記録しておく必要があります。しかし、高品質の録音を得るために、200応答、または聴覚障害の場合には、以上の繰り返しは（750-1,000）27を推奨している-健聴マウスでは、明確なABR波は100を平均した後に出てきます。 </li><li>視覚テスト中にABR閾値を決定します。 注：ABR閾値は、私が2 SD平均バックグラウンドアクティビティ31以上のIVはっきりと見えると中程度のピーク・ツー・ピーク電圧に音波を記録する信頼性の高いABRを誘発させる最低音刺激強度です。このデータは、デュを確認しなければなりませんピークとinterpeak待ち時間を含む他のパラメータと共に、オフライン分析を鳴らし、および振幅を振ります。 </li><li>手動または自動でデータ分析を実行します。 <ol><li>手動分析のために、4-5 ABR波識別（I、II、III ... など 。）とピークをマーク（P1、P2、P3 ...）と谷（N1、N2、N3 ...）各波のため。分析は、スプレッドシートやテキストファイルに、エクスポートデータを完了します。 注：電気的応答を記録するための具体的なソフトウェアは、通常は自動的に解析を行います。追加の測定は、一定の強度（ すなわち 70または80デシベルSPL）または個々のクリックのしきい値（閾値を超えるすなわち 15デシベルSPL）に対する相対強度で応答してABR記録で決定することができます。 </li></ol></li></ol></li><li>適切なソフトウェアを使用して、ABRデータの統計解析を実行します。実験計画に応じて、使用する規格は、主ABRのパラメを比較するt検定または分散分析（ANOVA）をペアリング異なるグループ26、30でメータ。 注：縦断的研究では、多くの機能データ（ すなわち前と顕微手術後の）異なる時間点で、同じ動物から採取されています。この場合、一般線形モデル反復測定試験は、詳細な差異分析を提供します。 </li></ol> 3.車両の準備<ol><li> 準備し、無菌条件下で車両のソリューションを使用しています。 注：液体溶液は、通常、耳管を通ってすぐにクリアされます。別の注射可能な送達系は、ハイドロゲルおよびナノ粒子32を含む中耳、薬物の滞留時間を増加させるために使用することができます。 <ol><li> 、CGP-ヒドロゲルを調製1.5-2％（重量/重量）キトサン溶液を得た0.2M酢酸中の75％脱アセチル化キトサンを溶解します。この液7に9％のグリセロリン酸（重量/重量）を追加します。溶液を調製します投与直前、使用するまで4℃でヒドロゲルを保存します。 注：CGP-ヒドロゲルはこの温度で適度に粘性が、それでも注射可能です。 4℃以下では、そのアプリケーションをブロックし、固相に変化します。適用後、CGPは、37℃で約15分で半固体ゲルへの相転移を受けます。 </li><li>使用するまで4℃でアリコート（0.5mL）を商業RLバッファとストア。 </li></ol></li></ol> 4.顕微手続き<ol><li> 吸入薬（ すなわちイソフルラン）に続いて、鎮静剤や鎮痛薬のケタミンベースの組み合わせで（ すなわち、ケタミンを100mg /キログラム、メデトミジンは0.05mg / kg及び0.025ミリグラム/キログラムphentanile）の腹腔内注射により全身麻酔を誘導します。 <ol><li>注射用薬剤を投与した後、マウスの鼻に麻酔フェイスマスクを調整し、イソフルラン蒸気にO 2供給を接続してください。中に吸入麻酔を維持顕微手術とは、つま先ピンチ反射と呼吸パターンと麻酔面を監視します。反射が全廃され、マウスは、通常の呼吸を提示したときに外科手術の準備を開始します。 </li><li>全体の手順の間に加熱パッドと体温を維持し、ヒドロキシプロピルメチルセルロースベースのゲルで角膜角膜炎から目を保護します。 </li></ol></li><li>滅菌ドレープを使用して、きれいな手術領域を準備します。手術前にガラスビーズ滅菌器で顕微楽器を滅菌します。全体の外科的処置中の無菌状態（滅菌手袋、ドレープ、手術器具など ）を維持します。 </li><li> マイクロサージェリー <ol><li> Bullostomy 注：Bullostomyは一方的な手順です。マウスの片方の耳を操作し、コントロールとして反対側の耳を使用しています。 <ol><li>褥瘡仰臥位でマウスを置きます。にバリカンを使用して、首の腹側表面に手術領域を準備します毛皮を削除します。ポビドンヨード基づく消毒液で皮膚をきれいにし、滅菌ドレープでそれをカバーしています。 </li><li>メスを使用して、鎖骨の下顎骨から2センチメートル縦切開を行います。 </li><li>手術用顕微鏡で拡大して、顎下腺を識別し、鉗子で両方を区切ります。顎下腺を撤回し、二腹筋や顔面神経の起源をローカライズします。 </li><li>鼓室胞の基礎となる劣る-内側面を露出させ、はさみで二腹筋の起源の切開を行い、腹側にそれを撤回。 </li><li> 27 G針（ 図2A）と、それに穿孔することによって水疱に開口部を作ります。それにあぶみ骨動脈およびRW膜尾側（ 図2B）をローカライズします。吸収性ゼラチンスポンジと掘削領域から血液をきれいにしてください。 </li><li> 34 Gカテーテル及びガラスマイクロシリンジを用いてゆっくり3-5μを注入RWのニッチへの直接bullostomyを介して車両用溶液（CGP-ヒドロゲルまたはRL）のL、それ（ 図2C）を満たします。組織接着剤の1〜2滴でbullostomyを封印。 </li><li>彼らの初期位置に顎下腺を返し、5-0絹縫合糸で皮膚切開を閉じます。クロルヘキシジンベースの切開部の周り防腐創傷感染を避けるためにを適用します。注：吸収性および非吸収性縫合糸を使用することができます。非吸収性縫合糸は2週間後に除去されなければなりません。その使用は切開感染と局所組織反応と関連しているので、シルクは、皮膚閉鎖のために推奨されません。 </li></ol></li><li>二国間transtympanic注射<ol><li> 側臥位でマウスを置き、4.3.1.1で説明したように外耳道以下無菌手術領域を準備します。 </li><li>耳珠とsに近い外側の外耳道の垂直部分で0.5センチメートル縦切開を行います耳介（オプション）の内部皮膚倍ection。 </li><li>手術用顕微鏡（ 図2E）を使用して、外耳道の終わりに鼓膜を見つけて、槌骨の柄によって前部と後部のセクションに分割され、上部PARS flaccidaと劣るPARS tensaを識別する（ 図2F） 。 </li><li> PARS flaccidaの尾の部分に小さなmyringostomyしてください。注射33の間に空気の排出を可能にするために、鼓膜の扁平部tensaに追加の切開を行います。静かに車両の10〜15μL（CGP-ヒドロゲルまたはRL）中耳は明らかに一杯になるまでRWのニッチに近いPARS flaccida、34〜Gカテーテルに接続されたガラスマイクロシリンジで溶液を注入します。 </li><li> 4.3.1.7で説明したように5-0絹縫合糸で皮膚切開を閉じて、きれい。 </li><li>その反対側およびoper上でマウスを置きます反対側の耳を食べた（4.3.2.5 4.3.2.1-にステップ）。 </li></ol></li></ol></li><li>それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで加熱パッド上でマウスを保管してください。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。 </li><li>身体状態、活動と痛みやストレスの兆候の有無を監視します。 （ すなわち、ブプレノルフィンは0.05mg / kgで、カルプロフェンは5〜10mg / kg）を必要に応じて鎮痛剤を提供します。毎日の手術創を確認し、傷が治癒したことを確認した後、術後7~14日皮膚の閉鎖を削除します。 </li></ol>蝸牛細胞構築の5形態学的評価<ol><li>手術の長期の効果を研究するために腹腔内ペントバルビタールの過剰投与（100mg / kg）で、（このワーク28日postmicrosurgeryで）実験の終了時に、マウスを安楽死させます。 </li><li>冷たい0.1 Mリン酸緩衝でtranscardial灌流を行います生理食塩水（PBS）、pH7.5で、26は、説明したように0.1 M PBS、pH7.5中の4％（重量/体積）パラホルムアルデヒド（PFA）が続きます。 注意：パラホルムアルデヒドは非常に有毒です。皮膚、目や粘膜との接触を避けます。測定し、準備中に粉末の吸入を避けます。 </li><li>前庭と内耳の蝸牛成分を分離することなく、34、35に記載されているように 、側頭骨から内耳を分析する実体顕微鏡を使用してください。 </li><li>穏やかに振盪しながら12時間、4℃で0.1 M PBS、pH7.5中4％（重量/体積）PFAで孤立した内耳を修正しました。 0.1MのPBS、pH7.5で5分間の洗浄3回。 </li><li> EDTA溶液を3日毎に変え、一定の振とうしながら10日間4℃で0.1 M PBS、pHを6.5に調製した10％エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を有する試料を脱灰。 </li><li>蝸牛がソフト一貫性を獲得すると、EDTAを除去し、0.1 M PBS、pHが7.5、ウィスコンシン州で5分間、3回洗浄RTで振盪番目。 </li><li>説明34としてパラフィンワックスでサンプルを埋め込み、厚さ7μmの蝸牛のセクションでは、蝸牛軸に平行にします。 </li><li>蝸牛細胞構築、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）30で染色切片を評価し、4Xおよび20Xレンズで画像をキャプチャするデジタルカメラに接続した光学顕微鏡を使用します。 </li></ol> 6.蝸牛遺伝子発現<ol><li> RNアーゼ除染液と作業面と手術器具を清掃してください。 </li><li> 5.1で説明したように、マウスを安楽死させるとすぐに顕微鏡を用いて、側頭骨から内耳を解剖します。リボ核酸（RNA）プロテクタおよび安定化試薬を含むガラス皿の中の内耳を浸し。 </li><li>宝石商の鉗子で残りの錐体骨を外し、そっとヴァンナアイはさみ35を使用して、前庭から蝸牛を分離します。 </li><li>すぐにTRANSFえー80μLRNAプロテクターと安定剤溶液2 mLのマイクロ遠心チューブに蝸牛、ドライアイスでチューブを配置することによって、組織を凍結します。使用するまで-70℃で蝸牛のサンプルを保持します。 </li><li> 35に記載されているように蝸牛RNAを分離し、分光光度的にその質と量を決定します。 </li><li>逆転写市販のキットを用いて、全マウスRNAの等量から蝸牛のcDNAを生成します。 </li><li>遺伝子転写物35、36を測定するために三重に相補デオキシリボ核酸（cDNA）を増幅するためのqRT-PCRを実行します。 注：この作業プロとIL1B、IL6、TGFB1、TNFA、IL10およびDUSP1の抗炎症性遺伝子の転写産物で測定しました。 </li><li>正規化基準遺伝子レベルの算術平均及び相対的定量化対象転写サイクル閾値（Ct）のレベルを正規化し、相対発現比を計算します問題のグループキャリブレータ群37の算術平均に転写レベル。 </li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

内耳への局所薬物送達は、中耳4、19、39に薬剤を配置すること、蝸牛内注射によって、または間接的に鼓室内投与によって直接行うことができます。管理蝸牛内耳管を通って窓膜、基礎ツー頂端濃度勾配との隙間を通って拡散するのを避け、蝸牛に制御され、正確な薬物送達を提供します。しかし、複雑で繊細な顕微7、39を必要とする高度に侵襲的な手順が通常です。この文脈では、業界では、薬物徐放40、41のための新しい、コーティングされた、移植可能な装置を開発しています。一方、鼓室内投与がdの大容量の注入を可能にする低侵襲性と実行するのは簡単な手順であります中耳への敷物、薬物動態を制御することは容易ではないですが。薬剤の大部分は、耳管を通ってクリアされ、残りの部分は、蝸牛18に到達するためにRW膜を通って拡散することがあります。 RWは、蝸牛7の外リンパで満たされた鼓膜ダクトへの中耳からの物質の最大吸収部位です。その透過性は、薬物の特性（サイズ、濃度、溶解性および電荷）および膜貫通輸送システム（拡散、能動輸送または食作用）で42に依存するが、それは、半透過性の三層構造です。楕円形の窓と耳のカプセルは、蝸牛43、44への代替が、あまり効果的な入り口です。 ここでは、実証し、マウスの中耳への標的化薬物送達のための2つの顕微方法比較：bullostomyとtranstympaをNICの注入手順。これらの手順に共通する重要なステップは次のとおりです。ⅰ）聴力の評価前と顕微後、ii）の無菌条件下で均質な車両用溶液の調製、ⅲ）麻酔処置と動物の体温と定数の監視の注意深い監督、IV分子と形態素解析を完了するために、蝸牛のサンプルを取って）遅いRWをターゲット車両の適切なボリュームの配置、およびiv）。 bullostomyための耳介と腹側のアプローチは7、45に記載されています。私たちの経験では、それが少ない罹患率をもたらし、RW 46へのより良いアクセスを提供してきたので、我々は腹近似を使用しました。 Transtympanic注射は通常、PARS鼓膜のtensaを通じて行われ、槌骨の胸骨柄12の前方または後方。にこの作品は、私たちはPARSを通じて注入は注入中の空気の排出を可能にするために、PARS tensaの前の追加の穿刺と槌骨を超えてflaccida、技術の改良を行いました。 両方microsurgeriesが急速であったがtranstympanic注入が短い術後の回復時間と無罹患率で、（それぞれbullostomyとtranstympanicアプローチの耳あたり20および5分）bullostomyより低侵襲性でした。最も重要なことは、両方の手順は、聴力維持し、ABRパラメータは、マイクロサージェリーの前に決定されたものと同一でした。 transtympanicアプローチはbullostomy未満の時間がかかり、同じ介入の間、同じ動物の両耳で行うことができます。 transtympanic注入の利点は、必要な場合には、左右行い、繰り返すことができること、従ってあります。一方、bullostomyはRW膜への直接の視覚的なアクセスを提供し、filliを可能にしますRWのニッチのngの。これとは対照的に、transtympanic注入はRWのニッチにおける車両の配置の制御を許可していません。 この作品で報告された手順は、このような難聴で耳毒性と有効性の評価の評価として前臨床応用のための中耳への局所薬物車両の配信を実行する方法について説明します。二つの顕微手順は、特定の利点と欠点を持つ別の方法を提供することが記載されています。どちらの聴力維持し、形態学的変化を引き起こしません。地元の炎症がbullostomyの潜在的な合併症として記載されています。補完的な技術のセットはまた、聴覚、形態学的および炎症マーカー発現の評価を含む術後の手順について記載されています。これらの技術のための将来のアプリケーションは、動物モデルでは、遺伝的な細胞および薬理学的アプローチを含む損失を、聴覚のための新しい治療法の前臨床評価を含みます。鼓室内のadministratイオンは明らか蝸牛損傷を与えることなく、外リンパへの通路を促進する、丸い窓膜に接触して、中耳における治療の配信を保証します。

聴覚障害は、（最も頻繁に人間の感覚欠損であり、世界中の人口の5.3％に影響を及ぼし、65歳以上の個人の30％ <a href="http://www.who.int/topics/deafness/en">http://www.who.int/topics/deafness/en</a> 、2016を更新します）。難聴は子供の言語習得に影響を与え、高齢者における認知機能低下を加速します。したがって、それは驚異的な社会経済的影響のある重大な医療問題です。最終的に蝸牛内有毛細胞及び神経細胞の損傷および死を誘導する、遺伝的欠陥、環境因子または両方1の組み合わせによって引き起こされ得ます。これらの細胞は、そのための細胞損失および付随する難聴を逆にすることができない、哺乳動物では再生しません。臨床オプションは、補聴器や人工内耳、中耳と骨伝導インプラント2を含む補綴装置、に基づいています。残念ながら、特定の医療修復トリートメントルームはありません聴覚障害のためtmentsので、いくつかの研究ラインは予防と修復治療法の開発に焦点を当てています。新たな治療オプションは、薬理学的療法2の遺伝子と細胞治療だけでなく、小分子の開発が含まれています。 蝸牛の薬理学的治療において最も重要な課題の一つは、薬物送達です。全身治療が原因で血液迷路関門3に蝸牛内の効力が限られているので、内耳への薬物の通過を制限する、内耳液の恒常性を維持するために、物理的および生化学的障壁として作用する蝸牛血管と接触している連続的な内皮細胞。透過性は、利尿剤または浸透剤を使用しても、蝸牛炎症時に増加することができるが、これは、わずかな脂溶性分子に対して透過性です。最終的には全身投与後の蝸牛に到達する薬物の量が減少します。したがって、有機毒性を引き起こす可能性が高い用量が必要とされています。また、薬物の肝代謝、毒性または不活性代謝物4、5、6、7を生成することができます。対照的に、局所的介入は、望ましくない副作用4、7、8、9せずに中間または内耳への薬物の既知の限られた量の配置を可能にします。現在の臨床診療では、鼓室内投与は、このようなメニエール病でゲンタマイシン10、突発性難聴でコルチコステロイド、メニエール病、免疫媒介及び音響外傷、11、12、13、1のような特定の蝸牛の病理が、これらに限定されています突発性難聴4、16、17 4、15およびインスリン様成長因子1（IGF1）。 局所投与のための製剤は蝸牛流体の微妙な恒常性（pH及び浸透圧）を維持する必要があります。また、脳脊髄液の細菌汚染を避けるために、プロセス全体を通して無菌性を維持することが非常に重要です。薬物送達のために使用される賦形剤は、生体適合性nonototoxic、適切な一貫性のものであるべきです。液体溶液が原因耳管を通して隙間に蝸牛内注射のためにお勧めしますが、鼓室内経路に適したものではありません。この場合には、薬物は、通常、中耳4、18、19にそれらの永続性を高めるために半固体ゲルによって行われます。代替配達systeCGPとRLソリューション：内耳への薬物の通過を増加させるために担体として使用MSは、ナノ粒子20と、我々は2台を比較した。ここで21をアデノウイルスです。 CGPは、キトサンにより形成されるヒドロゲル、D-グルコサミンおよび甲殻類の殻から得られたN-アセチル-D-グルコサミンで構成される線状多糖類、およびβグリセロリン酸、キトサンチェーンの周りの水のシールドを形成し、それを維持するポリオールであります液体の形。 CGPは、感熱性であり、中耳22、23、24、25の持続的な薬物放出を可能にする、リゾチームによって分解することができます。キトサンベースのヒドロゲルは、このような原因で免疫原性および局所炎症反応23、24の活性化の欠如の欠如への薬物送達などの臨床応用に適しビヒクルです。 OTH上えー手は、RLバッファは、特に血液の損失、外傷で、水と電解質の供給源として、ヒトにおける静脈内投与を目的とする非発熱性の等張液（273ミリオスモル/ LおよびpH 6.5）であるか、または乳酸代謝の副産物ので火傷します肝臓でアシドーシスを打ち消します。 ここでは説明し、マウスの内耳への局所薬物送達のための洗練された2つの外科的方法を比較します。両方の技術の安全性プロファイルは、機能的な形態学的および分子の試験を用いて評価しました。聴力は異なる時間に顕微手術の前後に行わ聴性脳幹反応（ABR）26,27を使用して評価しました。終点手順は蝸牛を切開し、これら二つの顕微手順の解剖学的、細胞および分子の影響を比較しました。

<table><tbody><tr><td>ケタミン(Imalgene)</td><td>Merial</td><td>#2529</td><td>注意:皮膚や目との薬物の接触や偶発的な自己注射</td></tr><tr><td>Xylacine(Xilagesic)&nbsp;</td><td>Calier</td><td># 6200025225</td><td></td></tr><tr><td>Lubricant Eye gel (Artific)</td><td>Angelini</td><td># 784710</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターポンプ&nbsp;</td><td>Gaymar</td><td>#TP472</td><td></td></tr><tr><td>表面消毒剤</td><td>Jos&eacute;Collado SA</td><td># CR-36</td><td></td></tr><tr><td>皮下針電極&nbsp;</td><td>Spes Medica</td><td>#MN4013D10SM</td><td></td></tr><tr><td>低インピーダンスヘッドステージ&nbsp;(RA4LIの)</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スピーカー(MF1マルチフィールド磁気スピーカー)</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>システム3誘発ポテンシャルワークステーション</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td>システムは、RP2プロセッサ、RA16基地局、PA5減衰器、SA1アンプ、MA3マイクアンプ、RA4LIインピーダンスヘッドステージ、RA4Aメデューサプリアンプで構成されています。</td></tr><tr><td>SigGenRPソフトウェア</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warming pads (TP pads)</td><td>Gaymar</td><td># TP3E</td><td></td></tr><tr><td>Statistics software (SPSS)</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chitosan (deacetylated)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># C3646</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid (glacial)</td><td>VWR</td><td># 20103.295</td><td>注意:可燃性液体、皮膚腐食、呼吸器および皮膚増感剤</td></tr><tr><td>グリセロリン酸</td><td>シグマ</td><td>#SLBG3671V</td><td></td></tr><tr><td>リンガー&acute;sの乳酸緩衝液</td><td>ブラウン</td><td>#1520-ESP</td><td></td></tr><tr><td>メデトミジン(Domtor)</td><td>エステベ</td><td>#02400190</td><td></td></tr><tr><td>フェンタニル(フェンタネスト)</td><td>カーンファーマ</td><td>#756650.2</td><td>注意:&nbsp;&nbsp;開いた傷や偶発的な自傷注射との薬物の接触を避け</td></tr>てください <tr><td>イソフルラン (IsoVet)</td><td>Braun</td><td># 469860</td><td>注意: 1時間を超えないサンプリング期間にわたって、ハロゲン化麻酔薬の上限濃度が2 ppmを超える濃度での曝露は避けてください。</td></tr><tr><td>手術用顕微鏡(OPMI pico)</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌ドレープ(フォリオドレープ)</td><td>Hartmann</td><td>#277546</td><td></td></tr><tr><td>滅菌器&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>#18000-45</td><td></td></tr><tr><td>メスブレード</td><td>Swann Morton</td><td>#0205</td><td>CAUTION</td></tr><tr><td>メスハンドル</td><td>Fine Science Tools</td><td>#91003-12</td><td></td></tr><tr><td>ポビドンヨウ素系消毒剤(ベタジン)</td><td>メダファーマ SAU</td><td># M-12207</td><td></td></tr><tr><td>アドベンティシアハサミ(SAS18-R8)</td><td>S&T</td><td># 12075-12</td><td></td></tr><tr><td>湾曲ハサミ</td><td>CM Instrumente</td><td>#AJ023-18</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>CM Instrumente</td><td>#BB019-18</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチンスポンジ(スポンジ)</td><td>ProNaMAc</td><td>#MS0001</td><td></td></tr><tr><td>Microlance 27 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>#302200</td><td></td></tr><tr><td>Microliter syringe(701 RN SYR)</td><td>Hamilton</td><td>#80330</td><td></td></tr><tr><td>カテーテル(マイクロフィル34G)</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>#MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュ接着剤(Vetbond)</td><td>3M</td><td>#1469SB</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー(丸ハンドルニードルホルダー)&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>#12075-12</td><td></td></tr>シルク<tr><td>外科用縫合糸(編組シルク5/0)</td><td>アラゴ</td><td>#990011</td><td></td></tr><tr><td>クロルヘキシジン(クリスタルミナ)</td><td>サルバット</td><td>#787341</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタール&nbsp;(ドール)</td><td>ベントキノール</td><td>#VET00040</td><td>注意:&nbsp;&nbsp;開いた傷や偶発的な自傷注射との薬物の接触を避けてください</td></tr><tr><td>Stereomicroscope (Leica)</td><td>Meyer Instruments</td><td># MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Micro-dissecting (Eye) はさみ スプリングアクション</td><td>Harvard Apparatus</td><td># 28483</td><td></td></tr><tr><td>Jeweller'鉗子(デュモン)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>#11252-00</td><td></td></tr><tr><td>RNase除染液&nbsp;(RNaseZap)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># R2020</td><td></td></tr><tr><td>RNA安定化ソリューション&nbsp;(RNAlater)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># R0901</td><td></td></tr><tr><td>Purification RNA kit (RNeasy)</td><td>Qiagen</td><td># 74104</td><td></td></tr><tr><td>cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># 4368814</td><td></td></tr><tr><td>Gene expression assay (TaqMan probes)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10:Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1</td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCRシステム (7900HT)</td><td>Applied Biosystems</td><td># 4329001</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Merck</td><td># 1040051000</td><td>TOXIC: PFAは可能性&nbsp;発がん性物質</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>Merck</td><td>#405491</td><td>注意:&nbsp;吸入すると有害で、 を吸入すると、長期または反復暴露により気道に損傷を与える可能性があります。</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># E4382</td><td>危険性:深刻な眼の炎症を引き起こす</td></tr></tbody></table>

マウス内耳に標的薬の配布方法の比較研究：bullostomy対 transtympanicインジェクション

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

それは内耳に到達することができるように、私たちは、中耳への具体的な薬物送達のための齧歯類における2低侵襲性顕微手法を提示します。最初の手順は、bullostomyと呼ばれる、鼓膜ブラの穿孔で構成されています。第1はtranstympanic注射です。両方とも、ヒトの臨床鼓室内手順をエミュレートします。 キトサン - グリセロリン酸（CGP）とリンゲル乳酸緩衝液（RL）は、局所薬物送達のための生体適合性のビヒクルとして使用しました。 CGPは、広く医薬用途に使用される非毒性の生分解性ポリマーです。これは、室温で粘性の液体であるが、体温で半固相に凝固します。 RLは、ヒトにおける静脈内投与に使用等張液です。この車両の少量を正確bullostomyによって正円窓（RW）ニッチ上に配置されます。 transtympanic注入は中耳を満たし、より少ない制御が、内耳へのより広範なアクセスを可能にします。 <p classが= &quot;jove_content&quot;&gt;両方の技術の安全性プロファイルは、機能的および形態学的試験を用いて検討し、比較しました。聴覚は、顕微手術後の聴性脳幹反応（ABR）の前に数回を登録することによって評価しました。蝸牛の構造体の細胞構築と保全レベルはパラホルムアルデヒド固定し、脱灰蝸牛試料中の従来の組織学的技術によって研究されました。並行して、未定着蝸牛のサンプルを採取し、直ちに定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）により、炎症マーカーの遺伝子発現プロファイルを分析するために凍結しました。 transtympanic噴射bullostomyに比べて低侵襲性であることが判明したが、両方の手順は、マウス中耳内への薬物の送達方法として適しています。

聴覚が聴覚機能（ 図1A）への影響を評価するために、顕微手術後の前にABRによって数回で試験しました。 ABRレジスタは、動物の動きや電圧アーチファクトを避けるため、その再現27を改善するために、麻酔下で行いました。腹腔内に投与ケタミンベースの組み合わせまたは吸入イソフルランは通常、ABRテスト中に動物を麻酔するために採用されました。 ABRレジスタの実行中にケタミン/キシラジンの組み合わせは、短時間作用型（2-3分）誘導および安定した、安全な維持期を提供します。イソフルランがABR測定感度38に影響を与えることができることに留意すべきです。 ABRレジスタについては、皮下電極は、特定の位置（ 図1B）に配置され、電気インピーダンスが測定されます。インピーダンスが3キロオーム以上であれば、電極の位置は、ALTを避けるためにチェックしなければなりませんABR波振幅で機能編。 鼓室内送達は、二つの顕微手術手順（ 図2）によりマウスにおいて行われます。 bullostomy中の水疱の暴露は、顎下腺と顎二腹筋の筋肉の収縮を伴います。頸動脈及び迷走神経が（ 図2A）非常に接近しているため、この手順は、細心の注意を払って行われます。次に、 水疱はあぶみ骨動脈とRW膜（ 図2B）をローカライズするために穿孔されます。骨を割れないようにするには、小さな0.5ミリメートルの開口部は、掘削前に27 G針で作られています。 34 GカテーテルはRW膜に向かってbullostomyを通して導かれ、車両の小さなボリュームが窓の隙間（ 図2C）に配信されます。 transtympanic注入は27 G針でPARS鼓膜のflaccidaの切開を介して行われます。で誘発することができ、より大きな1膜中の耳。注射の前に、我々は、車両（ 図2F）の注入時に空気の流出を可能にするために、PARS tensaに追加の切開を行うことをお勧めします。生命を脅かす出血につながるあぶみ骨動脈、内頸動脈の枝の損傷を避けるために重要です。 非操作コントロール（ 図3）と同様の実験、全体で公聴会を保存bullostomyまたはtranstympanic手術を有するマウス。クリックとトーンバーストに応答して、ABR閾値は、ベースライン値と比較して、顕微後に有意な変化は認められませんでした。有意差はbullostomyとtranstympanicアプローチの間で観察されませんでした。形態学的研究は、中耳への正しい車両の配信を確認すると、蝸牛細胞構築の手順によって引き起こされる潜在的な変化を評価するために実施しました。メイン蝸牛領域Sのなし両方の手順からhowed形態学的な変化や動物は、すべての蝸牛の構造（ 図4A）の同様の形態を提示しました。また、プロおよび抗炎症性サイトカインの遺伝子発現のための蝸牛プロフィールも調べました。 2つの手順の間でABRデータ内の機能の違いの欠如にもかかわらず、bullostomyはtranstympanicアプローチ（ 図4B）よりも強い炎症反応を引き起こしました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54951/54951fig1.jpg"> 図1.実験計画と聴覚の評価。実験手順の（A）図。聴覚は、顕微手術前後のABRで評価しました。蝸牛サンプルは28日顕微手術後に得られました。 （B） 皮下electrodと音減衰チャンバ内の加熱パッドの上にうつ伏せで麻酔マウス、頭蓋骨（アクティブ、正）の頂点の上に耳の間の頭皮に配置されたエス。耳介（参照、負の）下の耳下腺地域で、バック（地面）インチ自由音場スピーカーが右耳に直面して一定の距離（5センチ）に配置されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54951/54951fig2.jpg"> 車両アプリケーション図2.マイクロサージャリ。 （A）鼓室胞の腹ビュー。 bullostomyは27 G針で顔面神経に尾行われます。 （B）RWNとあぶみ骨動脈を穿孔を通して観察することができます。 （C）34 GカテーテルがRWのニッチに向けbullostomyを通して導かれます。 （D）bullostomy 1ヶ月後に、小さな骨瘢痕は、開口部位（矢印）に存在します。外耳道や鼓膜（正方形）の切開部を示す耳の（E）側面図、。鼓膜の（F）の詳細。穿刺（PARS flaccidaで、黒アスタリスク）27 G針を使用して、鼓膜の尾側腹部で行われました。注射は34 Gカテーテルを使用して、この穿孔を介して行われました。追加の穴は鼓膜の圧力のバランスをとるために、注射の前に（PARS tensaで、白アスタリスク）膜の頭蓋劣る象限で行われました。鼓膜の穿刺を介して、34 Gカテーテルの（G）を表示。 （H）24時間顕微後の蝸牛地域の眺め。 RWNは、車両用溶液（アスタリスク）を充填しました。横方向、緯度、 Roの、吻側。 、背を行います。馬、槌骨。株式会社、蝸牛。 OW、オーバルウィンドウ。 RWN、丸い窓の隙間。スケールバー= A、D、Fで200ミクロン;スケールバー= B、C、Hが100μm;スケールバー= E 1,000ミクロン、G.は、 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54951/54951fig3.jpg"> 3.聴覚アセスメント図。 （A）をクリックする応答におけるABR閾値の進化（デシベルSPLで、平均±SEM）とトーンバースト（B）の刺激、前と7、14および28日のオス8週齢のC57BL / 6Jにおけるマイクロ手術後マウス。 Bullostomy（オレンジ; N = 11）。 transtympanic注射（青色であり; n = 6）。非操作（灰色であり; n = 11）、 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> JPG "/&gt; 図4.蝸牛形態と遺伝子発現解析。蝸牛のベースの主要な蝸牛構造の（A）形態。 1ヶ月bullostomyまたはtranstympanic注射による顕微介入後の半ばmodiolarパラフィン非操作マウスからの耳のセクション（7ミクロン）、およびマウスのヘマトキシリン - エオシン染色。 スカラ・メディア・コンパートメント（a、b、c）は、すべての主要なコンポーネントを示します。らせん神経節（1）、コルチ器官（2）、らせん靭帯（3）および血管条（4）：これらの構造（番号ボックス）のそれぞれの詳細は、後続の画像に示されています。内有毛細胞（アスタリスク）。外有毛細胞（矢印の頭）。スケールバー= A、B、Cが100μm;スケールバー=-1,2,3,4で50μmです。 （B）28日顕微後の炎症マーカーの蝸牛表現。 bullostomy（オレンジ）とtranstympanic注射（青）の間と非手術マウス（白）との比較。 *：非操作対運営基; ^：操作群間比較。 ΔΔCT、または非操作group.Valuesへのn倍の差相対は、条件あたり3匹のマウスのプールサンプルから三連の平均±SEMとして提示されている-遺伝子発現レベルを2として表されています。統計的有意性：** P≤0.01。 *** P≤0.001。 ^^ P≤0.01。 ^^^ のp≤0.001。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

>jove_content<ここでは、内耳への局所的な薬物送達のための2つのマイクロサージェリーアプローチについて説明し、聴覚パラメータ、蝸牛細胞構造、および炎症マーカーの発現への影響の観点から比較します。

マウス内耳に標的薬の配布方法の比較研究：Bullostomy対 Transtympanicインジェクション

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

この研究の全体的な目標は、聴覚パラメーターと蝸牛細胞構造マーカーへの影響の観点から、内耳への局所薬物送達のための 2 つのマイクロ サージェリー アプローチを説明および比較することです。これらの手順は、聴覚分野、特に動物化学研究の発展における重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、侵襲性が最小限であることです。そしてこれにより、物質は教訓的に内耳に到達することができます。これらの技術の適用は、その顕微手術が中耳での乾式送達に適しているため、難聴の治療にまで及びます。この方法の平和的なデモンストレーションは、水疱瘻造設術と経鼓室注射を学ぶのが難しく、解剖学的知識と外科的訓練を必要とするため、非常に重要です。まず、麻酔をかけたマウスの反対側の耳に耳栓を装着して、主に単耳反応を得ます。次に、マウスを防音チャンバー内の加熱パッドに腹臥位に置きます。正のステンレス鋼の皮下針電極を頭蓋骨の頂点の上の耳の間の頭皮に配置します。参照電極を耳介の下の耳下腺領域に配置します。次に、接地電極を背中、尾、または後肢の領域に配置します。正極と負極の電気インピーダンスを確認してください。インピーダンスが3キロオーム未満であることを確認してください。事前に充填されたスピーカーを、選択した耳に面した一定の距離に置き、スピーカーの中心を外耳道に合わせます。スピーカーと耳の間に障害物がないこと、および耳介が完全に開いていることを確認してください。選択したスピーカーにデジタル-アナログワークステーション出力を接続します。ここではフリーフィールドスピーカーを使用します。低ノイズで信号対雑音比が良好なアンプをアナログ/デジタル入力に接続します。次に、プリセットされた刺激または適切なソフトウェアで設計された新しい信号を使用して、音響刺激を外部耳道に送達するプロセスを開始します。刺激を高強度から開始し、5〜10デシベルの音圧レベルステップで強度を下げます。刺激後の最初の10ミリ秒の電気的反応を記録し、誘発されたABR反応は6〜8ミリ秒で現れます。ソフトウェアを使用して、プロトコルの記述部分に記載されているABRしきい値を決定します。承認されたプロトコルに従って麻酔を投与した後、つま先のつま先つまみに対する反応がなく、定期的な呼吸が提示されることにより、麻酔の手術面に到達したことを確認します。クリッパーを使用して首の腹面の毛皮を取り除き、ヒドロキシ-プロピル-メチル-セルロースベースのゲルで角膜角膜炎から目を保護します。マウスを滅菌手術領域の褥瘡の仰臥位に置きます。ポビドンヨードベースの消毒液で皮膚をきれいにし、滅菌ドレープで覆います。メスを使用して下顎骨から鎖骨まで縦に2センチメートルの切開を行った後、手術用顕微鏡を覗いて顎下腺を特定します。鉗子で両方の顎下腺を分離し、それらを引っ込めて、顔面神経の二腹筋の起源を特定します。次に、ハサミで顎筋の起点を切開し、腹側に引っ込めて、鼓膜の根底にある下内側の側面を露出させます。次に、27ゲージの針を使用してブラにドリルで穴を開け、開口部を作ります。吸収性ゼラチンスポンジで穴を開けた部分から血液をきれいにします。丸い窓の膜にアブミ骨動脈を見つけます。34ゲージのカテーテルとガラス製のマイクロシリンジを使用して、3〜5マイクロリットルのビヒクル溶液を水疱瘻から丸い窓のニッチに直接ゆっくりと注入して充填します。1〜2滴の組織接着剤で水疱瘻を密封します。顎下腺を初期位置に戻し、5-0シルク外科用縫合糸で皮膚切開を閉じます。創傷感染を避けるために、切開部の周りにポビドンヨードまたはクロルヘキシジンベースの消毒剤を塗布します。マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを加熱パッドの上に置いておきます。動物は完全に回復した後にのみ、動物をホームケージに戻してください。マウスを側褥位に置き、前に示したように、外耳道の下の敗血症性手術領域で準備します。外耳道の垂直部分に0.5センチメートルの縦方向の切開を行った後、手術用顕微鏡の助けを借りて鼓膜を見つけます。くるぶしのハンドルによって前部と後部に分かれている下部の弛緩部の上部の弛緩体を特定します。次に、弛緩部の尾側部分に小さな脊髄腔瘻造設術を行い、鼓膜のテンス部に追加の切開を行って、注射中の空気の排出を可能にします。34ゲージのカテーテルに接続されたガラスマイクロシリンジを使用して、丸い窓のニッチに近い弛緩部から10〜15マイクロリットルの車両を、中耳がはっきりといっぱいになるまで静かに注入します。5-0シルク外科用縫合糸で皮膚の切開部を閉じ、前述のようにきれいにします。このグラフは、手術前とマイクロサージャリーの7日後、14日後、28日後に、8週齢の雄C57BL/6Jマウスのクリック刺激に対する反応のABR閾値を示しています。水疱瘻造設術のデータはオレンジ色、経鼓室注射のデータは青色、手術を受けていない動物のデータは灰色で示されています。このグラフは、マイクロサージェリー後の同じ期間に8〜40キロヘルツの範囲のトーンバースト刺激に応答するABR閾値を示しています。ここでも、水疱瘻造設術と鼓膜貫通型アプローチとの間に有意差は観察されませんでした。形態学的研究は、スカラ培地が水疱瘻造設術または経鼓膜注射によるビヒクル送達後に変化を示さないことを示しており、どちらの手順も単独では損傷を引き起こさないことを示しています。水疱瘻造設術を試みる際には、げっ歯類の中耳と内耳を取り巻く重要で解剖学的構造を見直すことを忘れないでください。これらの手順に従って、他の手法を実行することができます。例えば、薬物動態研究のためのベルリンサンプリング その開発後、これらの技術は、聴覚神経科学の分野の研究者が、主にげっ歯類の動物モデルで潜在的な局所療法を探求するための道を開きます。このビデオを見た後、中耳に薬を投与する方法とげっ歯類の聴力を評価する方法についてよく理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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