円窓膜を介してマウスインナーイヤーにウイルスにより媒介遺伝子送達のための手術方法

説明されている耳介後の外科的アプローチは、失血と動物の死亡率を最小限に抑えながら、マウスの蝸牛スカラティンパニへの迅速かつ直接的な送達を可能にします。この方法は、丸い窓の膜を介して出生後のマウスに分子、薬理、およびウイルスを送達する蝸牛療法に使用できます。

この手順の全体的な目標は、丸い窓の膜を介してマウスの蝸牛 S スケールのtimiにウイルスを迅速かつ直接送達することを可能にする耳介後外科的アプローチを説明することです。これは、最初に鼓膜の水疱を露出させることによって達成されます。2 番目のステップでは、組織に穿孔し、食道と丸い窓の膜を視覚化します。

次に、丸い窓の膜に穴を開け、ウイルスをスポンに注入します。最後のステップでは、穴が塞がれます。最終的に、導入遺伝子タンパク質の発現と動物の聴力の回復は、それぞれ免疫蛍光顕微鏡法と聴覚脳幹反応の測定によって評価できます。

この技術がコッホ、オストミー、腹側アプローチなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、丸窓膜注入後が比較的低侵襲で、より大量の注入を可能にし、蝸牛全体のさまざまな細胞の広範なトランスフェクションを促進することです。一般に、この技術に不慣れな人は、この手順が蝸牛の解剖学的構造の完全な理解に大きく依存しているため、苦労するでしょう。足指で麻酔を確認した後、左耳介後部をピンチシェービングし、生後日、10〜12匹マウスの皮膚を70%エタノールとポビドンヨウ素で消毒します。

次に、保護用の眼科用軟膏で目を覆い、首を伸ばした状態で動物を加熱パッドの上に置きます。手術の準備が完了したら、小さなハサミで皮下組織を切開して耳介後筋を露出させます。脂肪組織を切開部の後側に引っ込めた後、切開部に垂直な左右に筋肉を分離します。

側頭骨を露出させるには、25ゲージの針を使用して鼓膜を穿孔し、必要に応じて鉗子で骨を剥がして穴を広げ、蝸牛の基底回転にアクセスできるようにします。次に、穴を十分に広げて、汚れた動脈と丸い窓の膜が視覚化できるようにします。丸い窓の膜の中央に、ブロケイ酸塩の毛細血管ピペットで優しく穴を開けます。

丸い窓の膜を滅菌済みの濾紙で乾かします。次に、このステップで流体のeフラックスが安定するまで5〜10分待ちます。ピペットを保持したり進めたりするときは、丸い窓の膜のミシン目をできるだけ小さくするように注意してください。

顕微鏡の用途に応じて、ピペットは手で保持することも、マイクロマニピュレーターで保持することもできます。ここでわかるように、顕微鏡がマウスに近すぎてマイクロマニピュレーターができないため、ピペットを手で保持します。次に、直径15マイクロメートルの先端が付いた引っ張られたガラスピペットにウイルスの1〜2マイクロリットルを引き出し、丸い窓の膜に以前に開けたのと同じ穴からウイルスをティモニのスケールにマイクロ注入します。

次に、ピペットを引き出し、丸い窓のニッチを筋肉の小さなプラグですばやく密封し、少量のティッシュ接着剤で固定します。聴覚水疱の穴を脂肪組織で覆い、耳介後筋と脂肪組織を正常な位置に戻します。次に、6.0以下の吸収性クロム縫合糸を使用して、傷口を閉じ、切開部をポビドンヨードで消毒します。

次に、マウスを温かいケージに入れ、毎日の監視で完全に回復した後、ポップを母親に戻します。ウイルス送達の4日後という早い時期に蝸牛の機能を評価するには、鎮静剤を投与したトランスフェクション動物を加熱パッドの上に配置し、次に左耳の耳介の下と反対側の耳の下の頂点に皮下針電極を配置します。最後に、前述のように防音チャンバーで聴覚脳幹反応またはBRの記録を開始し、ウェーブ1を測定して、蝸牛ホールマウントに見られる蝸牛神経の活動を分析します。

このアプローチは、内有毛細胞、外有毛細胞、および支持細胞内での導入遺伝子発現が成功し、蝸牛の穴でGFPを発現する異なる細胞タイプが観察できるという重大なCOR T損傷の器官を伴わないことを示しています。Mountは、アデノ関連ウイルス血清型の選択が、形質導入する細胞タイプに適合しなければならないことを示しています。トランスフェクションされる細胞の数は、ウイルスが注入した濃度と量によって異なります。

この場合、0.6マイクロリットルから1マイクロリットルへの増加は、野生型V臀部に匹敵するレベルまでトランスフェクションされた細胞の数の増加をもたらし、注入されたKOマウスでは、これらの画像に見られるように、V GL3ノックアウトマウスの内耳へのV GL3ウイルスの眼索後丸窓膜送達の効果が聴力救助に実証される。グラフ。A BRの痕跡はVLUで復元され、3匹のレスキューされたノックアウトマウスは、野生型マウスに見られるものに匹敵する閾値に達しました。この手順を試みるときは、内耳と中耳の構造、および首の筋肉の損傷を防ぐために、各ステップに時間をかけることを忘れないでください。

このビデオを見た後、分子薬理学的ウイルス実験治療を丸い風膜を介してMAの骨格パンに送達するための術後アプローチを実行する方法をよく理解しているはずです。