聴覚弁別学習した後、マウス脳領域の高分解能定量的シナプスプロテオームプロファイリング
December 15th, 2016
シナプスの可塑性と記憶を制御する分子と経路の同定は、神経科学における依然として大きな課題です。ここでは、聴覚学習パラダイムにおける学習および記憶の固定化中にシナプスの分子再編成に関与すると思われるシナプスタンパク質の相対定量化に対処するワークフローについて説明します。
このプロテオミクスアプローチの全体的な目標は、基本的なメカニズムとシグナル伝達経路を理解するために、学習と記憶形成後のシナプスでの分子再編成の特性評価です。この手法の主な利点は、仮説を立てないアプローチであり、シナプスプロテオーム内の翻訳後および修飾の大規模な定量化と特性評価を可能にします。私たちが確立したワークフローは、特定の分子変化と特定の振る舞いとの間の相関関係を可能にします。
学習と記憶形成はシナプスの有効性の変化に基づいているため、プロテオミクス研究では、脳組織からのホモジネートよりもシナプスソームのようなシナプス構造の解析に重点を置く必要があります。プロテオミクスの結果は非常に複雑なデータセットであるため、バイオインフォメティックな処理が必要です。テストマウスを防音チャンバー内の薄暗いシャトルボックスに置くことからトレーニングを開始します。
聴覚弁別学習には、完全にコンピューター制御の学習スケジュールを使用します。トレーニングセッションを開始する前に、3分間の沈黙の慣れ時間から始めてください。囲碁のトライアルでは、動物は音の提示から6秒以内にハードルを越えなければなりません。
ノーゴートライアルでは、動物は6秒間のトーン提示の間、シャトルボックスの現在のコンパートメントに留まらなければなりません。30回の囲碁試行と30回の非行試行を擬似ランダム化の順序で実行し、試行間間隔を20秒にして、1つのセッションが60回の試行で構成され、約25分間続くようにします。すべての試行が実行されたら、訓練されたマウスを生け贄までホームケージに戻します。
マウスを犠牲にして脳を摘出した後、血管や表面の形状などの視覚的なランドマークを使用して聴覚皮質の位置を特定します。次に、メスと針を使用して、聴覚皮質を長方形の組織ブロックとして両側に解剖します。視交叉を目印として、前頭皮質をブレグマ3.56と1.54の間の脳スライスとして解剖します。
線条体をBregma 1.54と0.5の間の脳スライスとして解剖します。そして慎重に皮質組織を取り除きます。小脳を通して針で脳を安定させ、後頭葉から始まる皮質をほどくことにより、海馬を解剖します。
液体窒素中で解剖した脳サンプルを衝撃凍結します。解剖した脳組織を1ミリリットルの氷冷バッファーAを含む均質化容器に移すことにより、シナプトソームの精製を開始します。次に、約12回のストロークを使用して900RPMで組織を均質化します。サンプルを1, 000倍Gで10分間遠心分離します。
遠心分離後、上清を保持します。前と同じようにペレットを再均質化し、上清を混ぜ合わせます。12, 000回G.Re-dropingで1ミリリットルの均質化緩衝液でペレットを20分間20分間、結合した上清を回し、900RPMで6ストロークで均質化し、続いて20分間Gの1,200倍で遠心分離します。
遠心分離中にP2ペレットを製造し、超遠心チューブでショ糖ステップ勾配を調製します。2.5ミリリットルの1.0モルスクロース緩衝液から始めて、次にガラスパスツールピペットを使用して1.5ミリリットルの1.2モルスクロース緩衝液をサブレイヤー化します。遠心分離後、0.5ミリリットルの0.32モルスクロース緩衝液をP2ペレットに加えます。
その後、6 ストロークを使用して再均質化します。均質化されたフラクションをグラジエントの上にロードします。ロードされた勾配をスイングバケットローターに置き、超遠心分離機でGの85、000倍で2時間回転させます。
遠心分離が完了したら、1.0モルスクロースバッファーへの界面の材料を含む、上部の0.32モルスクロース層を廃棄します。1〜1.2モルのスクロースバッファー界面でシナプトソームを収集します。0.32モルのスクロース緩衝液をシナプトソーム画分に1.1の比率で添加します。
慎重に混合し、150, 000倍Gで1時間回転させます。シナプトソームはペレット内にあり、さらなる処理のためにバッファーに再懸濁することができます。超音波浴で氷上で1時間インキュベートすることにより、動物の各脳領域のシナプトソームを20〜50マイクロリットルの8モル尿素に溶解します。
取り外し可能な洗剤の1%で希釈して、最終濃度が2モル尿素になるようにします。SDS-PAGEピペットを使用して相対的なタンパク質量を決定した後、各サンプルの残りの3分の1を新しいチューブに入れます。2ミリモルのDTTと25ミリモルの重炭酸アンモニウムを加えて溶液中消化を行い、サンプルを穏やかにボルテックスします。
サンプルを摂氏20度で45分間減らします。カルバミドメチル酸システイン残基に10ミリモルイオタアセドミドを加えて混合します。20°Cの暗闇で30分間インキュベートします。
最後に、1マイクロリットルのトリプシンストック溶液を加え、摂氏20度で12時間インキュベートします。酸切断性界面活性剤を除去するには、トリフルオロ酢酸を最終濃度1%まで添加し、摂氏20度でさらに1時間インキュベートします。サンプルを16, 000倍Gで10分間遠心分離した後、上清を慎重に収集します。
固相抽出カラムをラックに置き、マトリックスを2ミリリットルのメタノールで平衡化します。洗浄後、さらに2ミリリットルのバッファーBを加え、サンプルをロードします。バッファーBで3回洗浄した後、200マイクロリットルの70%アセトニトリルと0.1%のトリフルオロ酢酸を加えてペプチドを溶出します。
その後、精製したサンプルを真空遠心分離機で乾燥させます。この例では、FM トーン弁別タスクでトレーニングされた動物は、トレーニング セッションの過程でヒット率が増加し、誤警報率が減少することを示しています。第4セッションから重大な差別が発生します。
選択したタンパク質の相対的なシナプス存在量を、FMトーン弁別課題で訓練したマウスと、最初の訓練セッションの24時間後にナイーブコントロールマウスで比較します。トレーニング後、CYFP2タンパク質のレベルは、調査したすべての領域で変化します。動物はしばしば個体内変動を示すことを忘れないでください。
したがって、よく適合した動物群の少なくとも5つ以上の生物学的複製を研究に含めることを強くお勧めします。一度確立されると、この技術は他の種にも簡単に適用できます。例えば、単一のショウジョウバエの脳における学習依存的なタンパク質発現変化のモニタリングに使用されています。
概要
この研究は聴覚学習と記憶固定中のシナプスにおける分子再編成を特徴づけることを目的としたプロテオミクスワークフローを説明します。このアプローチは、これらのプロセスに関与するシナプスタンパク質の定量化に焦点を当てています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- プロテオミクス
- シナプス可塑性
背景
- シナプス可塑性の理解は記憶形成の洞察に不可欠です。
- プロテオミクス研究はシナプス構造の変化を明らかにすることができます。
- 大規模な定量化により仮説に依存しない分析が可能になります。
- 複雑なデータセットを扱うためにバイオインフォマティクス処理が不可欠です。
研究の目的
- 学習後のシナプスにおける分子変化を特徴づける。
- 分子変化を特定の行動と関連付ける。
- 記憶に関与するシグナル伝達経路の理解を深める。
使用された方法
- マウスの聴覚識別学習。
- 脳組織からのシナプトソームの精製。
- SDS-PAGEと溶液内消化を用いたプロテオミクス分析。
- トレーニングを受けたマウスと未トレーニングのマウスの間のタンパク質レベルの統計的比較。
主要な結果
- トレーニング後にタンパク質レベルの有意な変化が観察されました。
- CYFP2タンパク質レベルは様々な脳領域で変化しました。
- トレーニングを受けたマウスで行動の改善が見られました。
- いくつかのトレーニングセッション後に識別能力が大幅に向上しました。
結論
- この研究は学習に関連するシナプス変化に関する洞察を提供します。
- プロテオミクスアプローチは分子変化を行動と効果的に関連付けることができます。
- 将来の研究はこれらの発見を基に記憶メカニズムを探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-resolution quantitative synaptic proteome profiling enables discovery-stage teams to map molecular changes underlying learning and memory, directly informing target validation and mechanistic de-risking in CNS drug discovery. By correlating synaptic protein dynamics with behavioral outcomes, this workflow enhances predictive confidence for early portfolio decisions in neuropsychiatric and neurodegenerative research. The approach supports enterprise R&D by providing scalable, hypothesis-free proteomic data for cross-functional evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables unbiased identification of synaptic protein changes linked to behavioral phenotypes.
- Supports mechanistic de-risking by mapping post-translational modifications in disease-relevant brain regions.
- Facilitates functional target validation through quantitative comparison of trained versus control cohorts.
- Provides a foundation for prioritizing molecular targets based on learning-dependent regulation.
Screening & Assay Development
- Delivers validated synaptosome preparations for downstream proteomic and biochemical assays.
- Establishes reproducible workflows for quantitative protein and phospho-peptide measurement.
- Enables assay standardization across multiple brain regions and experimental conditions.
- Supports scalable screening of candidate modulators affecting synaptic proteome signatures.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular findings with behavioral endpoints for translational biomarker development.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking synaptic changes across learning stages.
- Supports risk-adjusted advancement by linking proteomic shifts to functional outcomes.
- Provides mechanistic insights for preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This proteomic workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in CNS pipelines.
- Discovery Biology: Quantitative synaptic profiling clarifies pathway engagement and molecular adaptation after behavioral training.
- Screening: Standardized synaptosome and peptide fractionation enable reproducible, quantitative readouts for compound evaluation.
- Analytics: Label-free quantification and statistical analysis provide robust comparative outputs across experimental groups.
- Translational Research: Correlation of molecular and behavioral data supports biomarker alignment and translational continuity.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable to other species and learning paradigms, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible proteomic workflows for cross-team adoption.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by linking molecular changes to functional outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on quantitative synaptic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, proteomics, and bioinformatics for data acquisition and analysis.
- Demands access to high-resolution mass spectrometry and robust computational infrastructure.
- Necessitates standardized protocols for synaptosome isolation and peptide fractionation across teams.
- Adaptable to various species and behavioral paradigms with appropriate validation.
- Biological variability mandates sufficient replicates and rigorous statistical analysis for reliable interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Auditory Discrimination Learning in the Shuttle Box (FMTD Paradigm)
2:28
Brain Dissection
3:43
Purification of Synaptosomes from Crude Brain Membrane Fractions
6:29
Sample Preparation for Mass Spectrometry Using In-solution Digest
9:02
Results: Synaptic Abundance of selected Proteins After FMTD Task Training
9:53
Conclusion
