聴覚弁別学習した後、マウス脳領域の高分解能定量的シナプスプロテオームプロファイリング

このプロテオミクス的アプローチの全体的な目的は、学習および記憶形成後のシナプスにおける分子再編成を特性解析し、その基本的なメカニズムとシグナル伝達経路を解明することです。この手法の主な利点は、仮説に依存しないアプローチであることであり、シナプスプロテオーム内における翻訳後修飾の大規模な定量化および特性解析を可能にします。確立された当社のワークフローにより、特定の分子変化と特定の行動との相関関係を明らかにすることが可能です。

学習と記憶の形成はシナプス伝達効率の変化に基づいているため、プロテオーム解析では、脳組織のホモジネートよりも、シナプトソームなどのシナプス構造の分析に重点を置くべきである。プロテオーム解析の結果は非常に複雑なデータセットとなるため、バイオインフォマティクスによる処理が必要となる。遮音室内の薄暗いシャトルボックスにテストマウスを入れ、トレーニングを開始する。

聴覚識別学習には、完全にコンピュータ制御された学習スケジュールを使用します。トレーニングセッションを開始する前に、3分間の静寂による馴化期間を設けます。ゴー試行において、動物がヒットとして記録されるには、トーン提示から6秒以内にハードルを越える必要があります。

no-go試行中、動物は6秒間のトーン提示の間、シャトルボックスの現在のコンパートメントに留まらなければなりません。go試行30回とno-go試行30回を擬似ランダムな順序で実施し、試行間インターバルを20秒とすることで、1セッションを60試行とし、約25分間で完了させます。すべての試行が完了した後、訓練したマウスを安楽死までホームケージに戻します。

マウスを安楽死させて脳を取り出した後、血管や表面の形状などの視覚的な指標を用いて聴覚皮質を特定します。次に、メスと針を使用して、聴覚皮質を長方形の組織ブロックとして両側から切り出します。視交叉を指標とし、Bregma 3.56から1.54の間の前頭皮質を脳スライスとして切り出します。

Bregma 1.54から0.5の間で脳切片として線条体を摘出します。そして、皮質組織を慎重に除去してください。小脳から針を通して脳を固定し、後頭葉から皮質を剥がすことで海馬を摘出します。

摘出した脳サンプルを液体窒素で急速凍結させます。摘出した脳組織を1 mLの氷冷Buffer Aを含むホモジナイズ容器に移し、シナプトソームの精製を開始します。次に、約12回ストロークし、900 RPMで組織をホモジナイズします。サンプルを1,000 ×gで10分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を回収します。ペレットを前述と同様に再度ホモジナイズし、上清を合わせます。合わせた上清を12,000 ×gで20分間遠心分離します。ペレットを1 mLのホモジナイズバッファーで再懸濁し、900 RPMで6回ストロークしてホモジナイズした後、1,200 ×gで20分間遠心分離します。

P2ペレットを作製するための遠心分離を行う間に、超遠心管にショ糖ステップ勾配を準備します。まず1.0 Mのショ糖バッファーを2.5 mL入れ、次にガラス製パステールピペットを用いて1.2 Mのショ糖バッファー1.5 mLを積層します。遠心分離後、P2ペレットに0.32 Mのショ糖バッファー0.5 mLを加えます。

その後、6回ストロークして再度ホモジナイズします。ホモジナイズした分画をグラジエントの上に載せます。グラジエントをロードしたものをスイングローターにセットし、超遠心機を用いて 85,000 ×g で2時間遠心分離します。

遠心分離が完了したら、1.0 molar sucrose bufferとの界面にある物質を含め、上層の0.32 molar sucrose層を廃棄します。1.0から1.2 molar sucrose bufferの界面からシナプトソームを回収します。シナプトソーム画分に0.32 molar sucrose bufferを1.1の比率で加えます。

注意深く混合し、150,000 ×gで1時間遠心分離します。シナプトソームはペレットに含まれており、さらなる処理のためにバッファーで再懸濁することが可能です。動物の各脳領域のシナプトソームを、超音波バスを用いて氷上で1時間インキュベートし、20〜50 µLの8 M ureaに溶解させます。

除去可能な界面活性剤を1%添加して希釈し、最終的な尿素濃度を2 Mにします。SDS-PAGEを用いてタンパク質の相対量を決定した後、各サンプルの残量の3分の1を新しいチューブにピペッティングします。2 mM DTTと25 mM 重炭酸アンモニウムを添加し、サンプルを軽くボルテックスして溶液内消化を行います。

サンプルを20°Cで45分間還元します。システイン残基をカルバミドメチル化するため、10 mMのiota acedomideを添加して混合します。20°Cの暗所で30分間インキュベートします。

最後に、1 µLのトリプシンストック溶液を加え、20 °Cで12時間インキュベートします。酸分解性界面活性剤を除去するため、最終濃度が1 %になるようにトリフルオロ酢酸を加え、20 °Cでさらに1時間インキュベートします。サンプルを16,000 ×gで10分間遠心分離した後、上清を注意深く回収します。

固相抽出カラムをラックにセットし、2 mLのメタノールでマトリックスを平衡化させます。洗浄後、さらに2 mLのBuffer Bを加え、サンプルをロードします。Buffer Bで3回洗浄した後、200 µLの70%アセトニトリルおよび0.1%トリフルオロ酢酸を加えてペプチドを溶出させます。

次に、精製したサンプルを真空遠心機で乾燥させます。この例では、FMトーン識別タスクで訓練された動物は、訓練セッションが進むにつれてヒット率が上昇し、偽アラーム率が低下することを示しています。有意な識別は第4セッションから認められます。

FMトーン識別課題のトレーニングを受けたマウスとナイーブな対照マウスの間で、選択したタンパク質の相対的なシナプス存在量を、初回トレーニングセッションの24時間後に比較しています。トレーニング後、研究したすべての領域においてCYFP2タンパク質のレベルが変化しています。動物には個体内変動がしばしば見られることに留意してください。

したがって、本研究では十分にマッチングされた動物群から、少なくとも5つ以上の生物学的レプリケートを含めることが強く推奨されます。この手法が確立されれば、他の種へも容易に適応させることができます。例えば、単一のショウジョウバエの脳における学習依存的なタンパク質発現の変化をモニタリングするために使用されています。