Name: 聴覚弁別学習した後、マウス脳領域の高分解能定量的シナプスプロテオームプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学ぼう、マウスの聴覚弁別学習後のシナプスプロテオーム解析手法。シナプトソーム精製とプロテオーム解析により、学習依存性の分子変化と行動の相関を明らかにする。

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私たちは、優れた技術支援をしてくださったYvonne Ducho氏とKathrin Pohlmann氏に感謝します。この研究は、ドイツ研究振興協会(SFB 779)と、行動脳科学センター(CBBS)を通じてザクセン・アンハルト州/ヨーロッパ地域開発基金(ERDF)の支援を受けました。

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<li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal Chem. 68 (5), 850-858 (1996).</li>
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<li>Carmona-Saez, P., Chagoyen, M., Tirado, F., Carazo, J. M., Pascual-Montano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENECODIS%3A+a+web-based+tool+for+finding+significant+concurrent+annotations+in+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">GENECODIS: a web-based tool for finding significant concurrent annotations in gene lists.</a> Genome Biol. 8 (1), 3(2007).</li>
<li>Bonn, S., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+alpha-+and+gamma-protocadherins+alters+their+presenilin-dependent+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of alpha- and gamma-protocadherins alters their presenilin-dependent processing.</a> Mol Cell Biol. 27 (11), 4121-4132 (2007).</li>
<li>Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+post-translational+modifications+on+synaptic%2C+nuclear%2C+and+histone+proteins+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain.</a> J Proteome Res. 8 (11), 4966-4982 (2009).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+hippocampal+phosphoproteome+of+Apodemus+sylvaticus+paralleling+spatial+memory+retrieval+in+the+Barnes+maze%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The differential hippocampal phosphoproteome of Apodemus sylvaticus paralleling spatial memory retrieval in the Barnes maze.</a> Behav Brain Res. 264, 126-134 (2014).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

研究では、マウスの異なる脳領域における学習と記憶の統合時のシナプスタンパク質の発現の変化の正確な定量的プロファイリングのために最適化された方法論的なワークフローを提供します。セットアップは、質量分析用の試料につき少なくとも3つの技術の反復の必要なアプリケーションのにもかかわらず、単一の動物のレベルでのタンパク質発現を研究する機会を提供します。 方法論は、アカウントに高分子量の足場タンパク質からなる前およびpostsynapseの特定のタンパク質組成を取るだけでなく、媒体や低い分子量をもつ重要なメディエーター蛋白質の。シナプトソーム調製物の溶液内消化物は、効率的な世代になると、それゆえ、足場由来ペプチドの過剰表現。これは、順番に、より小さなまたはより低い豊富なタンパク質の解析を抑制することができます。からSDS-PAGE画分の推奨調製並行してゲル内消化手順と組み合わせて、各試料のアリコートは、中、低存在量タンパク質の分析を容易にし、強くお勧め補完的な方法を表しています。試料由来の全ての画分の別個の質量分析適用後（ 例えば 、溶液内消化、ゲル内消化、合成リンに富む画分）に対応するMS / MSデータセットは、PEAKSで合成し、タンパク質同定および定量するためのさらなる計算することができます。ソフトウェアまたは代替の一般的なソフトウェアパッケージ。 また、溶液内消化されたサンプルの生成、ゲル内消化由来試料の分画（サンプルレーンの別々に処理ゲルエリア）、画分の個々のアプリケーションを増加させることができる質量分析（イオン交換クロマトグラフィーによって）分析の深さ。しかしながら、この拡張ワークフローは劇的にLS-MS / MSデータ取得に必要な時間を増加させます。 GENERATIOのためプロテオームプロファイリングの指定された時間のコースを学習し、記憶形成時のシナプスタンパク質の再編成の詳細な分子配列のNが必要です。この時間経過は直後に、あるいは最初のトレーニングセッション中に開始し、動物のパフォーマンスは約後学習曲線の漸近レベルに達するまでクローズ噛み合っ時間枠をカバーすることができます。 8 -訓練の10日間（詳細は図2を参照）。 シナプスのタンパク質のリン酸化の変化の分析は、FMTD学習時に選択した時間枠に特に焦点を当てが必要です。一方で、タンパク質のリン酸化と脱リン酸化によってトリガーされることが知られているシナプスタンパク質の再編成を開始するシグナル伝達カスケードは、動物の訓練の非常に初期の段階で期待されています。一方、S内の接続およびアセンブリを調節呼ばれる複数のリン酸化されたシナプスのタンパク質の長期的な修正がありますynapticアーキテクチャ19、20。これらの翻訳後修飾があっても、メモリの統合の後の時点で予想されています。 このプロテオミクスワークフローによって生成された複雑なデータセットは、分子経路と重要な分子を、参加識別するために、バイオインフォマティクスの処理を必要とします。メタアナリシスは、学習と記憶のプロセスにおいて役割を果たしている重要な過剰出現経路を示しています。

学習は、メモリトレースおよびそれらのメンテナンスの形成に基づきます。広く1根底にあるメカニズムは、ニューロン間の既存のシナプスの連絡先の新規および/または再配置の活性依存形成を表してもよいことが認められています。分子レベルでは、様々なタンパク質修飾、細胞内relocalizationsおよびシナプスタンパク質の代謝回転の変化は1-4（ランプレヒトを、2004＃8）に記載されています。しかし、ほとんどの研究は、これまでに選択されたタンパク質ではなく、グローバルが、複雑なシナプスのプロテオーム組成に焦点を当てました。本発明のアプローチは、学習実験後のマウスの脳領域におけるシナプスプロテオームの変更のための公正なスクリーニングを可能にします。シナプスアーキテクチャの学習誘発性の再編成の時点依存性分子のスナップショットをレンダリングするのに適しています。説明ワークフローは、特定の動物の行動の異なる専門家のチームワーク、タンパク質生化学、質量分析およびbioiが必要ですnformatics。 選択された学習パラダイム、 すなわち周波数変調音の弁別（FMTD）は、げっ歯類5でよく特徴付け聴覚弁別課題です。学習と、このシャトルボックスゴー/ノー・ゴー・タスクでの長期記憶の形成は、増加した皮質ドーパミンシグナル伝達およびタンパク質合成に依存の機構を持っています。したがって、スナネズミおよびマウスに関する最近のプロテオミクス研究は、皮質ではなく、おそらくFMTD学習とメモリ6-8の間に相互作用し、より基礎的な脳領域におけるシナプスのコンポーネントのドーパミンと学習誘発性プラスチックの再配列を明らかにしました。これは、メモリの形成は、種々の脳領域の複雑な相互作用に関与し、従って、示差的プロテオームレベルで、これらの領域内で調節されるかもしれないことを示しています。したがって、選択された皮質と皮質下のマウスの脳領域の解剖は、ワークフローに含まれています。 また、信頼性の高いcharacterizatiでも、シナプスタンパク質組成物中の弱変化の上で前とシナプス後コンパートメントの濃縮ではなく、ホモジネートまたは粗膜画分9の分析が必要です。したがって、前のプロテオーム解析に確立されたプロトコルを利用シナプトソームの調製は、検出レベルとシナプス特異的タンパク質10,11のためのダイナミック・レンジを増加させるために記載されています。 定量的な目的のためのラベルフリーの高分解能質量分析を使用するための必須の前提条件は、タンパク質試料の類似度が高いです。ではなくシナプスタンパク質組成の小さな変化を学習した後に発生することが予想され、ラベルフリーのアプローチは、訓練を受けたから得られた対応するタンパク質試料と未処理マウスを比較することが適切であろう。また、安定同位体（ 例えば TMT、のiTRAQ、ICPLとSILAC）と同様にMS2ベースのラベルフリーの資格を使用して、タンパク質/ペプチドの条件-特定のラベル戦略ntification（SWATH）は有用であるが、彼らが選択したラベルフリーのアプローチよりも高価であるか、特別な質量分析のハードウェアを必要としています。 プロテオミクス上映は、多くの場合、複雑なデータセットを得ているため、バイオインフォマティクス処理が適切なデータ解釈のために推奨されます。追加のメタアナリシスは、パラダイムに関連した変化と関係する主要な細胞プロセスおよびシグナル伝達経路の特定の根底にある潜在的な分子メカニズムのより良い理解をサポートすることができます。適切な方法は、以下に記載されています。

<table><tbody><tr><td>3 M Empore 固相抽出フィルター</td><td>3M Bioanalytical Technologies</td><td>4245SD</td><td>7 mm/3 ml</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td>164564</td><td>100 & micro;m x 2 cm、C18</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td>164569</td><td>75 & マイクロ;m x 25 cm, C18</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3738.1</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル (ACN)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE70.2</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド (30%)</td><td>AppliChem</td><td>A0951</td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素アンモニウム&nbsp;&nbsp;</td><td>フルーカ</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム&nbsp;</td><td>フルカ&nbsp;</td><td>44273</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム&nbsp;(APSの)</td><td>AppliChem</td><td>A2941</td><td></td></tr><tr><td>Biofuge pico</td><td>Heraeus GmbH</td><td>75003280</td><td></td></tr><tr><td>Blue R-250&nbsp;</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>17525</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>17132901</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6Jマウス</td><td>Charles River&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cantharidin</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3322.1</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 用遠心分離管</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>TLA 100.1 ローター用遠心分離管</td><td>ベックマン・コールター</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ 5417R 遠心分離機</td><td>VWR</td><td>22636138</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ A-8-11 ローター</td><td>VWR</td><td>5407000317</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Fluka</td><td>14265</td><td></td></tr><tr><td>GeneCodis</td><td>http://genecodis.cnb.csic.es/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gephi</td><td>https://gephi.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>HALT ホスファターゼインヒビターカクテル&nbsp;</td><td>Pierce /Thermo Scientific</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>HEPES緩衝液&nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>S11-001</td><td></td></tr><tr><td>均質化容器 2 ml</td><td>ザルトリウス AG</td><td>854 2252</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>創意工夫経路分析</td><td>キアゲン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド (IAA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>ラボ用掘削ドライブ &nbsp;K-ControlTLC 4957&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>カルテンバッハ&Vogt GmbH</td><td>182997</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos Pro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macs-mix チューブローテーター</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Magic Scan 4.71</td><td>UMAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE71.2</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>オプティマMAX 超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>364300</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler 染色済みタンパク質ラダー</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS 7.5</td><td>バイオインフォマティクスソリューション&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤カクテル3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>PhosphoRS 3.1</td><td>IMP / IMBA / GMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>ロシュ</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>PTFE製プランジャー/乳棒</td><td>ザルトリウスAG</td><td>854 2651</td><td></td></tr><tr><td>PotterSホモジナイザー</td><td>ザルトリウスAG</td><td>853 3024</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤完全なミニ</td><td>ロシュ</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>数量1 4.5.1</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Waters</td><td>186002122</td><td></td></tr><tr><td>シャトルボックス</td><td>Coulbourne Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>AppliChem</td><td>A1112</td><td></td></tr><tr><td>モリブデン酸ナトリウム</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>274.2</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム酒石酸二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>SONOREX RK 156 超音波浴</td><td>BANDELIN electronic GmbH & Co. KG</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>防音室</td><td>Industrial Acoustics Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>カールロス GmbH</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルエチレン-1,2-ジアミン (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサー basic</td><td>CallMedia</td><td>111000</td><td></td></tr><tr><td><a name="RANGE!A60インチ>タイタンスフィアTiO 5&micro;m</a></td><td>GL Sciences Inc. Japan</td><td>502075000</td><td></td></tr><tr><td>TLA 100.1 ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸&nbsp;(TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS)</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Gold</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Ultra HPLC&nbsp;</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>ユニジェット II 冷蔵吸引器</td><td>ユニエキップ ラボラジャーVertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UNIVAPO 100 H濃縮器遠心分離機&nbsp;</td><td>ユニイップ・レイバーガー&auml;Te- und Vertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>AppliChem</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>水(高品質精製)</td><td></td><td></td><td>抵抗率:> 18.2 M&Omega;*cm at 25 &deg;C&nbsp;発熱物質: <0.02 EU/ml&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;目次: <10 ppb</td></tr><tr><td>Xcalibur 3.0.63</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18 ピペットチップ</td><td>MILLIPORE</td><td>ZTC18S960</td><td></td></tr></tbody></table>

聴覚弁別学習した後、マウス脳領域の高分解能定量的シナプスプロテオームプロファイリング

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

聴覚学習と記憶の根底にある分子シナプスのメカニズムは、ほとんど知られていません。ここでは、マウスの聴覚弁別学習に関するプロテオミクス研究のワークフローについて説明します。この学習パラダイムでは、マウスはシャトルボックスのGo/NoGoタスクで訓練され、軽度の電気フットショックを避けるために、周波数変調トーンの上昇と下降を区別する。このプロトコルでは、聴覚皮質、前頭皮質、海馬、線条体の 4 つの脳領域からシナプトソームを濃縮します。これは、トレーニングのさまざまな段階で行われます。訓練されたマウスから得られたシナプスタンパク質の発現パターンを、プロテオミクスアプローチを用いてナイーブコントロールと比較します。十分な分析深度を達成するために、質量分析の前に、1D SDS-PAGE/ゲル内消化、溶液内消化、リン酸化ペプチド濃縮の3つの異なる方法でサンプルを分画します。
質量分析計での高分解能プロテオミクス分析とラベルフリー定量化を使用して、シナプトソームタンパク質サンプルのリン酸化ペプチド枯渇画分およびリン酸化ペプチド濃縮画分中のシナプスタンパク質プロファイルを調べます。市販のソフトウェアパッケージを利用して、シナプスの存在量が相対的に大幅に制御されているタンパク質とリン酸化ペプチドを明らかにします(訓練済み/ナイーブコントロール)。学習後のマウスの脳領域におけるシナプスプロテオームの共通調節モードと差動制御モードが観察されました。その後、いくつかのデータベースを利用したメタアナリシスを用いて、根底にある細胞機能と生物学的経路を同定します。

図1は、聴覚弁別学習後のマウスの脳領域の定量的なシナプスプロテオームプロファイリングの完全なワークフローをまとめました。これは、シャトルボックス内の動物のトレーニングを開始します。 図2に示す例では、マウスは、効率的な学習を示し、4 番目のトレーニングセッションの有意FMトーン識別を示し始めました。動物は、脳領域の解剖のために選択された時点で屠殺されます。シナプスの必要な濃縮はどちらシナプトソーム調製することによって達成することができるか、PSD-濃縮方法は、低組織量のために開発された代替的PSD濃縮画分を調製することにより、両者が図3に詳細に記載さ、 例えば、1 -ラット脳12、18から2海馬スライス。それは、小さなチューブ、これらのチューブにフィッティングのPTFE乳棒、および乳棒に電力を供給するための実験室の掘削ドライブが必要です。シナプトソームの特定のタンパク質組成物に、強く2の異なるが補完的な方法で試料調製を実行することをお勧めします。 PSDの足場は、多くの場合、高い化学量論に発生する非常に高分子量のタンパク質です。で-ソリューションダイジェストは、それらを効率的に抽出するための最良の方法ですが、生成されたペプチド混合物のオーバーサンプリングにつながる可能性があります。ゲル内これらの高分子量タンパク質を排除し、培地と低分子量を有するタンパク質の分析を支持することができ、並列に同じ試料の実行消化します。総合的な分析のためのタンパク質分解消化物の両方のタイプをお勧めします。 脳領域の組織の異なる量は、より良い比較のために適用された材料の調整を必要とする調査しました。 4調べた脳領域の中で聴覚野は一般的に制限する事実でありますまたは。他のすべての脳領域の材料は慎重にシナプトソームまたはPSDに富む画分の調製後に聴覚皮質の量に調整されなければならない（3.1.1を参照します。）。聴覚皮質（AC）：マウスから調製したばかりの脳領域の典型的な重量は、次の通りである〜50ミリグラム。海馬（HIP）：〜90ミリグラム。線条体（STR）：〜120ミリグラムと前頭皮質（FC）：〜100ミリグラム。 2.3節で説明したPSD-濃縮方法は、約1500種類のタンパク質と1匹の動物（ 表1）のレベルでの脳領域ごとに約250の異なるリン酸化ペプチドの同定を可能にしました。 24時間の最初のトレーニングセッションの後のプロテオーム解析は、同定されたタンパク質の7.3％及びリン酸化ペプチドの5.8％は、有意（P &lt;0.05）ナイーブ対照（ 表1）と比較して、それらのシナプス発現の定量的変化を示したことを明らかにしました。ダウンレギュレーションのために目立つ傾向シナプス足場の化はFMTD学習の初期段階でシナプスアーキテクチャの顕著な再配置を指すことがあります。わずか22％が、二つ以上の脳の領域で調節されることが見出されたのに対し、調節タンパク質の大部分は、脳領域特異的な様式で変化しました。六選択された例は、 図4に示されています。 、「RhoAのシグナリング」、「Notchシグナル伝達」クラスリン依存性エンドサイトーシスシグナル伝達」、「軸索誘導シグナリング」、「カルシウムシグナル伝達」：IPAによる複雑な結果のメタ分析では、次の標準的な経路の特定の参加/操作のための証拠を提供します上皮アドヘレン接合の &quot;、&quot;改造 &quot;、&quot;グルタミン酸受容体シグナル伝達」、「GABA受容体シグナル」、「ドーパミン受容体シグナル」と「シナプス長期増強」。 図5）を明らかにしました。イオン輸送を含む聴覚皮質の生物学的プロセスでは、翻訳、mRNA輸送、タンパク質輸送および学習が目立ちました。海馬のタンパク質画分の分析は、イオン輸送、細胞周期、翻訳、リン酸化および神経系の発達に関連する著しく富化プロセスを検出します。線条体では、mRNA輸送を含む生物学的プロセスを過剰出現し、小胞媒介輸送、axonogenesis、タンパク質分解、タンパク質輸送およびエンドサイトーシスが見つかりました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig1.jpg" /> 図1： 系統的のWorkFlo方法論的アプローチのワットこの図は、模式的に脳領域の特定のシナプスタンパク質組成物の高分解能定量的プロファイリングのワークフローをまとめたものです。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig2.jpg" /> 図2：FM トーン弁別課題のマウスの性能の例。動物は、ヒットの増加率（青線）とトレーニングセッションの過程で誤警報（黒色の曲線）の減少率を示しています。重要な差別は、第四セッションから発生します。エラーバーは、SEMとして提供されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig2large.jpg" target="_blank">LARを表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図のGERバージョン。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig3.jpg" /> 図3： シナプトソームとPSDに富む画分の調製。 A：シナプトソームの準備。 B：PSD-濃縮分画製剤。どちらの図も、脳組織からのシナプトソームまたは代わりにPSDに富む画分の製造の詳細なワークフローを説明します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig4.jpg" /> 図4： 選択した定量的プロテオミクスの結果。選択されたタンパク質の相対的なシナプスの存在量は、マウスのTRA間で比較しますFMTDタスク（AV、N = 6）およびナイーブ対照マウス（NV、n = 6）が24時間最初のトレーニングセッションの後にINED。存在量の値は、タンパク質の三最も強いペプチドのピーク面積の中央値として計算しました。重要な存在量の変化（AV / NV; t検定）を有するタンパク質は、プロット内でマークされている：* P &lt;0.05、** P &lt;0.01、*** P &lt;0.005。エラーバーはSDとして提供されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig5.jpg" /> 図5：GeneCodis / Gephiによって前頭葉のための生物学的経路の可視化。 3の最小タンパク質番号に「生物学的プロセス」に関連する遺伝子オントロジー（GO）データベース（http://geneontology.org）の唯一の重要な用語<html>ここに示されています。ノードがGOタームを表し、ノードのサイズ、特定のノードの接続の線幅と数が他のノードと、このGOタームを共有するタンパク質の数を示しています。 Gephiの「フォースアトラス」方式に、関連するノードは、一緒に密接にクラスタリングされています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 脳の領域 </td><td> 交流 </td><td> FC </td><td> HIP </td><td><html> 000 &quot;顔=&quot; Calibri &quot;サイズ=&quot; 3 &quot;&gt; STR </td><td> Σ </td></tr><tr><td> 同定されたタンパク質 </td><td> 1435 </td><td> 1758 </td><td> 1572 </td><td> 1507 </td><td> 6272 </td></tr><tr><td> 調節タンパク質（P &lt;0.05） </td><td> 59 </td><td> 130 </td><td> 162 </td><td> 108 </td><td>顔= &quot;Calibri&quot;サイズ= &quot;3&quot;&gt; 459 </td></tr><tr><td> ↑AV / NV </td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 76 </td><td> 35 </td><td> 123 </td></tr><tr><td> ↓AV / NV </td><td> 51 </td><td> 126 </td><td> 86 </td><td> 73 </td><td> 336 </td></tr><tr><td> 識別さphosphomoti<html> FS </td><td> 197 </td><td> 361 </td><td> 273 </td><td> 278 </td><td> 1109 </td></tr><tr><td> 規制phosphomotifsた（p &lt;0.05） </td><td> 8 </td><td> 22 </td><td> 21 </td><td> 14 </td><td> 65 </td></tr><tr><td> ↑AV / NV </td><td> 4 </td><td>00000 &quot;顔=&quot; Calibri &quot;サイズ=&quot; 3 &quot;&gt; 17 </td><td> 5 </td><td> 9 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> ↓AV / NV </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 16 </td><td> 5 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> 表1：プロテオーム結果のまとめ。このテーブルには（NV、n = 6）が、それらのナイーブ対照と比較して、代表的なプロテオミクス訓練を受けたマウスの実験（AV、n = 6）が24時間最初のトレーニングセッションの後をまとめました。ザ459規制タンパク質の合計は重複規制を含んでいます。 283別の規則は、脳の特定のように決定しました。具体的には、57のタンパク質は、2つの脳領域に規定され、18タンパク質の規制は3脳領域で検出されたとわずか2タンパク質は、4つのすべての調べた脳領域に規制されています。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 許容誤差 </td></tr><tr><td>前駆体の質量（フーリエ変換質量分析法） </td><td> 10 ppmの</td></tr><tr><td>フラグメントイオン質量（リニアイオントラップ） </td><td> 0.6ダ</td></tr><tr><td> ペプチドあたりの最大切れ残り </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 修正された修正 </td></tr><tr><td>ゲル内消化のサンプルについて</td><td>システインのカルバミドメチル化</td></tr><tr><td>溶液内消化のサンプルについて</td><td> Methylthiolatioシステインのn個</td></tr><tr><td> 変数の変更 </td><td>メチオニンの酸化</td></tr><tr><td></td><td>アスパラギンおよび/またはグルタミンの脱アミド</td></tr><tr><td> データベース </td><td> UNIPROT / SPROT </td></tr><tr><td>分類</td><td>マウス</td></tr><tr><td> 統計的識別受け入れ設定 </td></tr><tr><td> デノボ平均地元の信頼（ALC） </td><td> &gt; 50％ </td></tr><tr><td>ペプチド偽発見率（FDR、ESTに基づく。デコイ融合） </td><td> &lt;1％ </td></tr><tr><td>タンパク質の重要性（-10logPは、修飾されたT検定に基づきます） </td><td> &gt; 20 </td></tr><tr><td>ユニークなペプチド/タンパク質</td><td> ≥1 </td></tr><tr><td> 定量化の設定： </td></tr><tr><td>次の場合、定量化のために使用されるペプチド</td></tr><tr><td>ペプチドの意義（-10logP） </td><td> &gt; 30 </td></tr><tr><td>におけるペプチド同定</td><td>サンプルの≥50％ </td></tr><tr><td>ペプチドの信号品質</td><td> &gt; 1 </td></tr><tr><td>ペプチド平均面積</td><td> &gt; 1E5 </td></tr><tr><td>ペプチドの保持時間公差</td><td> &lt;5分</td></tr><tr><td>正規化</td><td>全イオン電流（TIC）によって</td></tr></tbody></table> 表2：タンパク質同定のための設定（ステップ4.2.2）。

シナプスの可塑性と記憶を制御する分子と経路の同定は、神経科学における依然として大きな課題です。ここでは、聴覚学習パラダイムにおける学習および記憶の固定化中にシナプスの分子再編成に関与すると思われるシナプスタンパク質の相対定量化に対処するワークフローについて説明します。

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

このプロテオミクス的アプローチの全体的な目的は、学習および記憶形成後のシナプスにおける分子再編成を特性解析し、その基本的なメカニズムとシグナル伝達経路を解明することです。この手法の主な利点は、仮説に依存しないアプローチであることであり、シナプスプロテオーム内における翻訳後修飾の大規模な定量化および特性解析を可能にします。確立された当社のワークフローにより、特定の分子変化と特定の行動との相関関係を明らかにすることが可能です。学習と記憶の形成はシナプス伝達効率の変化に基づいているため、プロテオーム解析では、脳組織のホモジネートよりも、シナプトソームなどのシナプス構造の分析に重点を置くべきである。プロテオーム解析の結果は非常に複雑なデータセットとなるため、バイオインフォマティクスによる処理が必要となる。遮音室内の薄暗いシャトルボックスにテストマウスを入れ、トレーニングを開始する。聴覚識別学習には、完全にコンピュータ制御された学習スケジュールを使用します。トレーニングセッションを開始する前に、3分間の静寂による馴化期間を設けます。ゴー試行において、動物がヒットとして記録されるには、トーン提示から6秒以内にハードルを越える必要があります。no-go試行中、動物は6秒間のトーン提示の間、シャトルボックスの現在のコンパートメントに留まらなければなりません。go試行30回とno-go試行30回を擬似ランダムな順序で実施し、試行間インターバルを20秒とすることで、1セッションを60試行とし、約25分間で完了させます。すべての試行が完了した後、訓練したマウスを安楽死までホームケージに戻します。マウスを安楽死させて脳を取り出した後、血管や表面の形状などの視覚的な指標を用いて聴覚皮質を特定します。次に、メスと針を使用して、聴覚皮質を長方形の組織ブロックとして両側から切り出します。視交叉を指標とし、Bregma 3.56から1.54の間の前頭皮質を脳スライスとして切り出します。Bregma 1.54から0.5の間で脳切片として線条体を摘出します。そして、皮質組織を慎重に除去してください。小脳から針を通して脳を固定し、後頭葉から皮質を剥がすことで海馬を摘出します。摘出した脳サンプルを液体窒素で急速凍結させます。摘出した脳組織を1 mLの氷冷Buffer Aを含むホモジナイズ容器に移し、シナプトソームの精製を開始します。次に、約12回ストロークし、900 RPMで組織をホモジナイズします。サンプルを1,000 ×gで10分間遠心分離します。遠心分離後、上清を回収します。ペレットを前述と同様に再度ホモジナイズし、上清を合わせます。合わせた上清を12,000 ×gで20分間遠心分離します。ペレットを1 mLのホモジナイズバッファーで再懸濁し、900 RPMで6回ストロークしてホモジナイズした後、1,200 ×gで20分間遠心分離します。P2ペレットを作製するための遠心分離を行う間に、超遠心管にショ糖ステップ勾配を準備します。まず1.0 Mのショ糖バッファーを2.5 mL入れ、次にガラス製パステールピペットを用いて1.2 Mのショ糖バッファー1.5 mLを積層します。遠心分離後、P2ペレットに0.32 Mのショ糖バッファー0.5 mLを加えます。その後、6回ストロークして再度ホモジナイズします。ホモジナイズした分画をグラジエントの上に載せます。グラジエントをロードしたものをスイングローターにセットし、超遠心機を用いて 85,000 ×g で2時間遠心分離します。遠心分離が完了したら、1.0 molar sucrose bufferとの界面にある物質を含め、上層の0.32 molar sucrose層を廃棄します。1.0から1.2 molar sucrose bufferの界面からシナプトソームを回収します。シナプトソーム画分に0.32 molar sucrose bufferを1.1の比率で加えます。注意深く混合し、150,000 ×gで1時間遠心分離します。シナプトソームはペレットに含まれており、さらなる処理のためにバッファーで再懸濁することが可能です。動物の各脳領域のシナプトソームを、超音波バスを用いて氷上で1時間インキュベートし、20〜50 µLの8 M ureaに溶解させます。除去可能な界面活性剤を1%添加して希釈し、最終的な尿素濃度を2 Mにします。SDS-PAGEを用いてタンパク質の相対量を決定した後、各サンプルの残量の3分の1を新しいチューブにピペッティングします。2 mM DTTと25 mM 重炭酸アンモニウムを添加し、サンプルを軽くボルテックスして溶液内消化を行います。サンプルを20°Cで45分間還元します。システイン残基をカルバミドメチル化するため、10 mMのiota acedomideを添加して混合します。20°Cの暗所で30分間インキュベートします。最後に、1 µLのトリプシンストック溶液を加え、20 °Cで12時間インキュベートします。酸分解性界面活性剤を除去するため、最終濃度が1 %になるようにトリフルオロ酢酸を加え、20 °Cでさらに1時間インキュベートします。サンプルを16,000 ×gで10分間遠心分離した後、上清を注意深く回収します。固相抽出カラムをラックにセットし、2 mLのメタノールでマトリックスを平衡化させます。洗浄後、さらに2 mLのBuffer Bを加え、サンプルをロードします。Buffer Bで3回洗浄した後、200 µLの70%アセトニトリルおよび0.1%トリフルオロ酢酸を加えてペプチドを溶出させます。次に、精製したサンプルを真空遠心機で乾燥させます。この例では、FMトーン識別タスクで訓練された動物は、訓練セッションが進むにつれてヒット率が上昇し、偽アラーム率が低下することを示しています。有意な識別は第4セッションから認められます。FMトーン識別課題のトレーニングを受けたマウスとナイーブな対照マウスの間で、選択したタンパク質の相対的なシナプス存在量を、初回トレーニングセッションの24時間後に比較しています。トレーニング後、研究したすべての領域においてCYFP2タンパク質のレベルが変化しています。動物には個体内変動がしばしば見られることに留意してください。したがって、本研究では十分にマッチングされた動物群から、少なくとも5つ以上の生物学的レプリケートを含めることが強く推奨されます。この手法が確立されれば、他の種へも容易に適応させることができます。例えば、単一のショウジョウバエの脳における学習依存的なタンパク質発現の変化をモニタリングするために使用されています。

high-resolution-quantitative-synaptic-proteome-profiling-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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げっ歯類脳における細胞内ユビキチンプロテアソーム活性の定量化

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マウス海馬と前頭前野における二重細胞外記録

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聴覚弁別学習した後、マウス脳領域の高分解能定量的シナプスプロテオームプロファイリング

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