聴覚弁別学習した後、マウス脳領域の高分解能定量的シナプスプロテオームプロファイリング

このプロテオミクスアプローチの全体的な目標は、基本的なメカニズムとシグナル伝達経路を理解するために、学習と記憶形成後のシナプスでの分子再編成の特性評価です。この手法の主な利点は、仮説を立てないアプローチであり、シナプスプロテオーム内の翻訳後および修飾の大規模な定量化と特性評価を可能にします。私たちが確立したワークフローは、特定の分子変化と特定の振る舞いとの間の相関関係を可能にします。

学習と記憶形成はシナプスの有効性の変化に基づいているため、プロテオミクス研究では、脳組織からのホモジネートよりもシナプスソームのようなシナプス構造の解析に重点を置く必要があります。プロテオミクスの結果は非常に複雑なデータセットであるため、バイオインフォメティックな処理が必要です。テストマウスを防音チャンバー内の薄暗いシャトルボックスに置くことからトレーニングを開始します。

聴覚弁別学習には、完全にコンピューター制御の学習スケジュールを使用します。トレーニングセッションを開始する前に、3分間の沈黙の慣れ時間から始めてください。囲碁のトライアルでは、動物は音の提示から6秒以内にハードルを越えなければなりません。

ノーゴートライアルでは、動物は6秒間のトーン提示の間、シャトルボックスの現在のコンパートメントに留まらなければなりません。30回の囲碁試行と30回の非行試行を擬似ランダム化の順序で実行し、試行間間隔を20秒にして、1つのセッションが60回の試行で構成され、約25分間続くようにします。すべての試行が実行されたら、訓練されたマウスを生け贄までホームケージに戻します。

マウスを犠牲にして脳を摘出した後、血管や表面の形状などの視覚的なランドマークを使用して聴覚皮質の位置を特定します。次に、メスと針を使用して、聴覚皮質を長方形の組織ブロックとして両側に解剖します。視交叉を目印として、前頭皮質をブレグマ3.56と1.54の間の脳スライスとして解剖します。

線条体をBregma 1.54と0.5の間の脳スライスとして解剖します。そして慎重に皮質組織を取り除きます。小脳を通して針で脳を安定させ、後頭葉から始まる皮質をほどくことにより、海馬を解剖します。

液体窒素中で解剖した脳サンプルを衝撃凍結します。解剖した脳組織を1ミリリットルの氷冷バッファーAを含む均質化容器に移すことにより、シナプトソームの精製を開始します。次に、約12回のストロークを使用して900RPMで組織を均質化します。サンプルを1, 000倍Gで10分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を保持します。前と同じようにペレットを再均質化し、上清を混ぜ合わせます。12, 000回G.Re-dropingで1ミリリットルの均質化緩衝液でペレットを20分間20分間、結合した上清を回し、900RPMで6ストロークで均質化し、続いて20分間Gの1,200倍で遠心分離します。

遠心分離中にP2ペレットを製造し、超遠心チューブでショ糖ステップ勾配を調製します。2.5ミリリットルの1.0モルスクロース緩衝液から始めて、次にガラスパスツールピペットを使用して1.5ミリリットルの1.2モルスクロース緩衝液をサブレイヤー化します。遠心分離後、0.5ミリリットルの0.32モルスクロース緩衝液をP2ペレットに加えます。

その後、6 ストロークを使用して再均質化します。均質化されたフラクションをグラジエントの上にロードします。ロードされた勾配をスイングバケットローターに置き、超遠心分離機でGの85、000倍で2時間回転させます。

遠心分離が完了したら、1.0モルスクロースバッファーへの界面の材料を含む、上部の0.32モルスクロース層を廃棄します。1〜1.2モルのスクロースバッファー界面でシナプトソームを収集します。0.32モルのスクロース緩衝液をシナプトソーム画分に1.1の比率で添加します。

慎重に混合し、150, 000倍Gで1時間回転させます。シナプトソームはペレット内にあり、さらなる処理のためにバッファーに再懸濁することができます。超音波浴で氷上で1時間インキュベートすることにより、動物の各脳領域のシナプトソームを20〜50マイクロリットルの8モル尿素に溶解します。

取り外し可能な洗剤の1%で希釈して、最終濃度が2モル尿素になるようにします。SDS-PAGEピペットを使用して相対的なタンパク質量を決定した後、各サンプルの残りの3分の1を新しいチューブに入れます。2ミリモルのDTTと25ミリモルの重炭酸アンモニウムを加えて溶液中消化を行い、サンプルを穏やかにボルテックスします。

サンプルを摂氏20度で45分間減らします。カルバミドメチル酸システイン残基に10ミリモルイオタアセドミドを加えて混合します。20°Cの暗闇で30分間インキュベートします。

最後に、1マイクロリットルのトリプシンストック溶液を加え、摂氏20度で12時間インキュベートします。酸切断性界面活性剤を除去するには、トリフルオロ酢酸を最終濃度1%まで添加し、摂氏20度でさらに1時間インキュベートします。サンプルを16, 000倍Gで10分間遠心分離した後、上清を慎重に収集します。

固相抽出カラムをラックに置き、マトリックスを2ミリリットルのメタノールで平衡化します。洗浄後、さらに2ミリリットルのバッファーBを加え、サンプルをロードします。バッファーBで3回洗浄した後、200マイクロリットルの70%アセトニトリルと0.1%のトリフルオロ酢酸を加えてペプチドを溶出します。

その後、精製したサンプルを真空遠心分離機で乾燥させます。この例では、FM トーン弁別タスクでトレーニングされた動物は、トレーニング セッションの過程でヒット率が増加し、誤警報率が減少することを示しています。第4セッションから重大な差別が発生します。

選択したタンパク質の相対的なシナプス存在量を、FMトーン弁別課題で訓練したマウスと、最初の訓練セッションの24時間後にナイーブコントロールマウスで比較します。トレーニング後、CYFP2タンパク質のレベルは、調査したすべての領域で変化します。動物はしばしば個体内変動を示すことを忘れないでください。

したがって、よく適合した動物群の少なくとも5つ以上の生物学的複製を研究に含めることを強くお勧めします。一度確立されると、この技術は他の種にも簡単に適用できます。例えば、単一のショウジョウバエの脳における学習依存的なタンパク質発現変化のモニタリングに使用されています。