Name: げっ歯類脳における細胞内ユビキチンプロテアソーム活性の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶ、げっ歯類脳のシナプス・細胞質・核内におけるユビキチンプロテアソーム活性の定量化法。同一個体内での比較が可能で、学習や疾患におけるタンパク質分解動態を効率的に解析できます。

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この研究は、農業生命科学部とバージニア工科大学の理学部のスタートアップファンドによって支援され、バージニア工科大学のジョージ・ワシントン・カーバー・プログラムによって支援されています。

<ol><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li>
<li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).</li>
<li>Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+roles+of+k63-linked+ubiquitin+chains+in+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking.</a> Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).</li>
<li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ubiquitin+chains%3A+NF-kappaB+signalling%2C+cell+death+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).</li>
<li>Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ubiquitination%3A+a+newly+discovered+regulator+of+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).</li>
<li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Logic+of+the+26S+Proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li>
<li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li>
<li>Ezhkova, E., Tansey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasomal+ATPases+link+ubiquitylation+of+histone+H2B+to+methylation+of+histone+H3%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3.</a> Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).</li>
<li>Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+system+as+a+critical+regulator+of+synaptic+plasticity+and+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).</li>
<li>Hegde, A. N., Upadhya, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+pathway+in+health+and+disease+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system.</a> Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).</li>
<li>Adori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+distribution+of+components+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+non-diseased+human+and+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).</li>
<li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li>
<li>Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+distribution+of+proteasomes+implicates+a+major+location+of+protein+degradation+in+the+nuclear+envelope-ER+network+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast.</a> EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).</li>
<li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII%2C+but+not+protein+kinase+A%2C+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115(2013).</li>
<li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349(2011).</li>
<li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li>
<li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavior+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150(2013).</li>
<li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li>
<li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li>
<li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li>
<li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li>
<li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li>
<li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li>
<li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li>
<li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

ここでは、同じ動物の異なる細胞内区画間のユビキチン-プロテアソーム活性の変化を定量化するための効率的な方法を示す。現在、ユビキチン・プロテアソーム系の活性における細胞内変化の測定のほとんどの試みは、サンプル当たり1つのコンパートメントに限定されており、実験を繰り返す必要がある。これは、多大なコストと動物の生命の損失につながります。私たちのプロトコルは、半球を分割することによって、この問題を緩和し、同じ動物の各半球から異なる細胞画分を収集できるようにします。このプロトコルを用いて、我々は、同じ動物のユビキチン-プロテアソーム活性において、学習21に応答して核、細胞質およびシナプス画の分画が差異的に変化することを初めて示すことができた。
ここで説明するプロトコルの主な制限は、得られる脳組織(サンプル)の量に依存している。例えば、上記で説明したように、このプロトコルは、所定の脳領域の半球を分割する必要があります。ただし、1 つの半球にのみ存在する特定の領域の場合など、これは常に可能であるとは限りません。これらの場合、このバッファーはすべての...

ユビキチンプロテアソーム系(UPS)は、細胞1のほとんどの短命タンパク質の分解を制御する相互接続されたタンパク質構造およびリチウムの複雑なネットワークである。このシステムでは、タンパク質は、小さな修飾子ユビキチンによって分解または他の細胞プロセス/運命のためにマークされます。標的タンパク質は、7つのリジン(K)部位(K6、K11、K27、K29、K33、K48およびK63)またはN末端メチオニン(M1;線形として知られている)のいずれかで一緒にリンクすることができる1-7ユビキチン修飾を獲得することができる。これらのポリウビキチンタグのいくつかは、分解特異的(K48)3であり、他のものはタンパク質分解プロセス(M1)4、5、6とは大きく独立している。したがって、タンパク質ユビキチン化プロセスは非常に複雑であり、特定のポリウビキチンタグの変化を定量化する能力は、細胞機能における与えられた修飾の役割を最終的に理解するために重要である。さらにこのシステムの研究を複雑にし、UPS7の触媒構造であるプロテアソームは、いずれもタンパク質を分解するが、他の非タンパク質分解プロセス8、9にも関与しうる。当然のことながら、その最初の発見以来、正常かつ異常なユビキチンプロテアソーム活性は、長期記憶形成および多くの神経学的、神経変性および精神医学的な疾患状態に関与している。障害10,11.その結果、脳内のUPS活性を効果的かつ効率的に定量化できる方法は、このシステムが疾患状態でどのように調節されるか、およびユビキチンおよび/またはを標的とする治療オプションの最終的な開発を最終的に理解するために重要である。プロテアソーム機能。
ラットやマウスから脳組織のユビキチン・プロテアソーム活性を定量化する上で多くの問題があり、これはUPS機能の研究に使用される最も一般的なモデルシステムであり、1)ユビキチン修飾の多様性、および2)分布および細胞外コンパートメント12、13、14を横切って機能するUPSの差分規制。例えば、記憶形成中の脳におけるユビキチン・プロテアソーム機能の初期のデモンストレーションの多くは、全細胞のライサーションを使用し、タンパク質ユビキチン化およびプロテアソーム活性の両方における時間依存性の増加を示した15、16歳,17歳,18歳,19歳,しかし、最近、ユビキチン・プロテアソーム活性は、学習に応じて細胞内の区画全体で大きく変化し、一部の地域では同時に増加し、他の地域では減少し、大きく異なるパターンであることがわかった。以前に報告されたものから全細胞は21をlysates.これは、異なる細胞内区画間でのUPS活性の変化の寄与を解離できないため、細胞全体のアプローチの制限と一致しています。より最近の研究は、学習22、23、24に応答してシナプスで特にUPSを研究するためにシナプス画分プロトコルを採用しているが、使用される方法は、測定する能力を閉塞する同じ動物における核および細胞質のユビキチン・プロテアソーム変化。その結果、実験を何度も繰り返す必要が不要で、それぞれに異なる細胞分画が収集されます。これは動物の生命の損失を大きくするだけでなく、特定の事象に応答するか、特定の疾患状態の間に異なる細胞内区間でUPS活動を直接比較する能力を排除します。ユビキチンおよびプロテアソームのタンパク質標的が細胞全体で大きく異なっていることを考慮すると、ユビキチン-プロテアソームシグナル伝達が異なる細胞内接画においてどのように異なるかを理解することは、記憶形成と神経学的、神経変性および精神疾患の間の脳。
このニーズに対処するために、我々は最近、同じ動物21から所定の脳領域に対して核、細胞質およびシナプス画分を収集することができる手順を開発した。さらに、同じサンプルから複数の細胞分画を収集して得ることができるタンパク質の限られた量を考慮して、我々はインビトロプロテアソーム活性およびリンケージ特異的なアッセイに以前に確立されたプロトコルを最適化したげっ歯類の脳組織から採取した細胞のタンパク質ユビキチン化。このプロトコルを使用して、ラットの横扁桃体における核および細胞質におけるプロテアソーム活性、K48、K63、M1および全体的なタンパク質ポリユービキチン化レベルにおける学習依存的変化を収集し、直接比較することができた。ここでは、UPSが長期記憶形成や様々な疾患状態にどのように関与しているのかについての理解を大幅に改善する可能性のある手順(図1)を詳細に説明します。しかしながら、我々のプロトコルで議論されるインビトロプロテアソーム活性は、広く使用されている一方で、完全な26Sプロテアソーム複合体の活性を直接測定しないことに留意すべきである。むしろ、このアッセイは20Sコアの活性を測定し、26Sプロテアソーム複合体全体とは対照的に、コア自体の活動を理解するプロキシとしてのみ役立つことができる。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>フィッシャー</td><td>15575020</td><td>他のさまざまなベンダー</td></tr><tr><td>20S プロテアソーム アクティビティキット</td><td>ミリポアシグマ</td><td>APT280</td><td>他のベンダーは異なるバージョンを扱っています</td></tr><tr><td>ATP</td><td>フィッシャー</td><td>FERR1441</td><td>さまざまな他のベンダー</td></tr><tr><td>ベータアクチン抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>4967S</td><td>さまざまな他のベンダー</td></tr><tr><td>ベータチューブリン抗体</td><td>細胞シグナリング</td><td>2128T</td><td>他のさまざまなベンダー</td></tr><tr><td>BioTek Synergy H1 プレートリーダー</td><td>BioTek</td><td>VATECHH1MT3</td><td>他のベンダーは異なるバージョンを運びます</td></tr><tr><td>B-メルカプトエタノール</td><td>フィッシャー</td><td>ICN19024280</td><td>さまざまな他のベンダー</td></tr><tr><td>クラストラクタシスチン b-ラクトン</td><td>ミリポア シグマ</td><td>L7035</td><td>さまざまな他のベンダー</td></tr><tr><td>極低温カップ</td><td>フィッシャー</td><td>033377B</td><td>その他各種ベンダー</td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td>DMSO D8418</td><td>その他各種ベンダー</td></tr><tr><td>DTT</td><td>ミリポアシグマ</td><td>D0632</td><td>その他各種ベンダー</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>G5516</td> その他<td>各種ベンダー</td></tr><tr><td>H3抗体</td><td>アブ</td><td>カム ab1791</td><td>その他各種ベンダー</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ミリポアシグマ</td><td>H3375</td><td>その他各種ベンダー</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャー</td><td>SA48</td><td>その他各種ベンダー</td></tr><tr><td>IGEPAL (NP-40)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>I3021</td><td>その他各種ベンダー</td></tr><tr><td>K48 ユビキチン抗体</td><td>アブカム</td><td>ab140601</td><td>その他各種ベンダー</td></tr><tr><td>K63 ユビキチン抗体</td><td>アブカム</td><td>ab179434</td><td>その他各種ベンダー</td></tr><tr><td>KCl</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P9541</td><td>各種その他</td></tr><tr><td>KONTES(コンテス) ティッシュグラインダー</td><td>VWR</td><td>KT885300-0002</td><td>その他各種ベンダー</td></tr><tr><td>Laemmli sample buffer</td><td>Bio-rad</td><td>161-0737</td><td>その他各種ベンダー</td></tr><tr><td>リニアユビキチン抗体</td><td>生命センサー</td><td>AB-0130-0100</td><td>M1抗体のみ</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>ミリポアシグマ</td><td>442611</td><td>他各種ベンダー</td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>2231000213</td><td>他のさまざまなメーカー/モデル</td></tr><tr><td>myr-AIP</td><td>エンツォライフサイエンス</td><td>BML-P212-0500</td><td>ミリポアシグマ</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S3014</td><td>他のさまざまなベンダー</td></tr><tr><td>オデッセイ FC イメージングシステム</td><td>LiCor</td><td>2800-02</td><td>他のベンダーは、異なるバージョンを運びます</td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤</td><td>ミリポアシグマ</td><td>524625</td><td>他のさまざまなベンダー</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standard</td><td>Bio-rad</td><td>161-0373</td><td>他のさまざまなベンダー</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8340</td><td>他のさまざまなベンダー</td></tr><tr><td>PSD95抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>3450T</td><td>他のさまざまなベンダー</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3771</td><td>他のさまざまなベンダー</td></tr> 水<tr><td>酸化ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td>SS255</td><td>その他各種ベンダー</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S0389</td><td>その他各種ベンダー</td></tr><tr><td>TBS</td><td>アルファ アエサル</td><td>J62938</td><td>その他各種ベンダー</td></tr><tr><td>トリス</td><td>ミリポアシグマ</td><td>T1503</td> その他<td>各種ベンダー</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP337-100</td> その他<td>各種ベンダー</td></tr><tr><td>ユビキチン抗体</td><td>エンツォライフサイエンス</td><td>BML-PW8810</td><td>他のさまざまなベンダー</td></tr></tbody></table>

げっ歯類脳における細胞内ユビキチンプロテアソーム活性の定量化

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

ユビキチンプロテアソーム系は、真核生物におけるタンパク質分解および他の様々な細胞プロセスの主要な調節剤である。脳では、ユビキチンプロテアソーム活性の増加は、シナプス可塑性および記憶形成のために重要であり、このシステムの異常な変化は、様々な神経学的、神経変性および精神疾患に関連している。脳内でユビキチンプロテアソームが機能する研究における問題の1つは、タンパク質標的、機能的役割および調節機構が大きく異なる可能性があるすべての細胞コンパートメントに存在することです。その結果、同じ動物内の異なる細胞内の異なる細胞内の脳ユビキチンタンパク質ターゲティングおよびプロテアソーム触媒活性を直接比較する能力は、UPSがシナプス可塑性にどのように寄与するかを完全に理解するために重要であり、記憶と病気。ここで説明する方法は、同じげっ歯類(ラット)脳からの核、細胞質および粗シナプス画分の収集を可能にし、続いてプロテアソーム触媒活性の同時定量化(間接的に、プロテアソームコアの活性を提供する)のみ)およびリンケージ特異的ユビキチンタンパク質タグ付け。したがって、この方法は、シナプス可塑性、記憶形成および異なる疾患状態の間に同じ動物における異なる脳領域におけるユビキチン-プロテアソーム活性の細胞内変化を直接比較するために使用することができる。この方法は、同じ動物内の他のタンパク質の細胞内分布および機能を評価するためにも使用することができる。

ここで説明する手順を用いて、ラット脳の横扁桃体から核、細胞質およびシナプス画画を採取した(図1)。個々の分画の純度は、ウェスタンブロッティングを介して確認され、リサート中で濃縮または枯渇させるべきタンパク質に対する抗体を調べた。粗シナプス画分が収集された最初の半球では、シナプス密度タンパク質95(PSD95)はシナプス中に存在していたが、核、画分、細胞質の低いレベルで存在した(図2A)。これは、シナプス分画調製がシナプス前成分およびポストシナプス成分25の両方を分離することを実証する以前の研究と一致している。逆に、核タンパク質ヒストンH3は核中に存在していたが、細胞質のレベルが低いシナプス分率は存在しなかった(図2B)。細胞質におけるPSD95およびH3の存在は、細胞質翻訳と一致する。細胞質タンパク質β-チューブリンは、我々の細胞質画画に存在してい...

このプロトコルは、げっ歯類の脳の異なる細胞区画におけるユビキチンプロテアソーム系(UPS)活性を効率的に定量するように設計されている。ユーザーは、同じ動物の核、細胞質およびシナプス画のUPS機能を調べることができ、これらの複雑な分析を行うために必要な時間と動物の数を減らすことができます。

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

このプロトコルは、げっ歯類の脳における細胞内タンパク質ユビキチン化レベルおよびプロテアソーム活性を測定し、ユビキチン-プロテアソーム活性が細胞活動、学習、または疾患に応答してどのように変化するかを被験者内で比較することを可能にする。このプロトコルは、同じげっ歯類の脳からシナプス、細胞質、核分画の収集を可能にする。損失を最小限に抑え、少量の組織と基本的な実験室設備で行うことができる。この手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の大学院生であるテイラー・マクファデンです。テキストプロトコルに記載されているようにげっ歯類の脳組織の収集と解剖でこの手順を開始します。使用する半球が各実験グループの抽出条件全体でカウンターバランスされていることを確認します。マイナス80°C冷凍庫から関心領域の1つの半球を含む1.5ミリリットル遠心分離機マイクロチューブを取り除きます。メスを使用して、凍結した脳組織を2ミリリットルガラスのテフロンホモジナイザーに移す。テフロンチューブに500マイクロリットルのリシスバッファーを加えます。害虫Bを用いて、同じ組織を15ストロークで均質化し、可視量の固体材料が存在しなくなるまで。各ストロークの間に回転動作を使用します。1,000マイクロリットルピペットを使用して、均質化サンプルを新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移します。チューブを湿った氷の上に置き、30分間インキュベートします。チューブをマイクロ遠心分離機に入れ、摂氏4度で845倍gで10分間回転させます。完成後、慎重にピペットで上清を除去し、新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに入れ。これは細胞質画分です。得られたペレットに50マイクロリットルの抽出バッファーを加え、ピペット処理により再中断します。ペレットを渦出させないでください。再懸濁したペレットを含むチューブを氷の上に置き、30分間インキュベートします。その後、チューブを21で20分間遠心し、4°Cで456倍のグラムを行います。遠心分離後、ピペットで上清を慎重に取り除き、新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れる。これが核の一部です。リシスバッファーの代わりに TEVP バッファーの 500 マイクロリットルを使用することを除いて、以前と同様に関心領域の 1 つの半球を均質化します。1,000マイクロリットルピペットを使用して、均質化されたサンプルを新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。摂氏4度で10分間1,000倍gでサンプルを遠心する。上清を集め、1,000マイクロリットルピペットを使用して新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移します。サンプルを摂氏4度で10分間10,000倍に遠心する。核と大きな破片を含む元のペレットを捨てます。上清を新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。これは、サイトソリック分数です。50マイクロリットルの均質化バッファーをペレットに加え、固体材料が見えなくなるまでピペッティングして再中断します。サンプルを摂氏4度で10分間20,000倍gで遠心する。上清を新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。これは、粗シナプトソーム膜画分です。アッセイを設定するには、プレートリーダーを摂氏37度に予熱し、ランを通して保持します。励起を360ナノメートルに、放出を460ナノメートルに設定します。使用される96ウェルプレートが透明な場合は、光学の位置を底部に設定します。暗い96ウェルプレートを使用する場合は、光学の位置を上に設定します。30分ごとに2時間スキャンの時間で運動走行をプログラムします。キットに用意されている20S 10Xアッセイバッファーを13.5ミリリットルの超純水で再構成します。100 ミリモル ATP の 14 マイクロリットルを現在の 1X バッファーに追加します。これにより、サンプル中のプロテアソーム活性が著しく向上し、アッセイの信頼性が向上します。100マイクロリットルのDMSOでキットに提供されるAMC規格を再構成してください。AMC規格を暗い状態または低照度条件下で使用して、標準が光に敏感であるため、手順を実行します。一連の高いAMC濃度から低いAMC濃度までのAMCの標準曲線を作成します。この曲線は、均質化されたサンプル中のプロテアソーム活性のプレートリーダー校正および分析に使用されます。キットに提供されるプロテアソームを65マイクロリットルのDMSOで再構成します。また、基板が光に敏感であるように暗い状態または低照度条件下でこのステップを行う。次に、20Sアッセイバッファーを使用して、新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにプロテアソーム基質を1~20希釈して作成します。96ウェルプレートに目的のサンプルの正規化された量を追加します。各サンプルを重複して実行します。必要なサンプルの量は、組織の調製に基づいて変化します。一般的に、10〜20マイクログラムは、任意の細胞内分画に対して十分である。サンプルの十分な量を80マイクロリットルに超純水で持って来なさい。追加される量は、追加したサンプルの量によって異なります。2つの別々の井戸に、80マイクロリットルの水を単独で加えます。これらはアッセイブランクになります。アッセイブランクを含む各ウェルに20Sアッセイバッファーの10マイクロリットルを追加します。リピータまたは自動ピペットを使用して、ウェル全体で一貫したアッセイ量を確保します。照明を消すか暗い部屋に入ります。希釈されたAMC規格の100マイクロリットルをすべて新しい井戸に加え、各規格に対して単一のウェルを使用します。暗闇の中で、リピータまたは自動化されたピペットを使用して、サンプルとアッセイブランクを含むウェルに10マイクロリットルの希釈プロテアソーム基質を追加しますが、AMC規格は使用できません。プレートリーダーにプレートを入れ、運動走行を開始します。ユニークなリンケージ特異的ポリウビキチン抗体と組み合わせて様々な標準的な西洋ブロッティングプロトコルを使用して、げっ歯類の脳組織から採取された異なる細胞内分画の多様なポリウビキチンタグの定量を行います。一部のユビキチンウエスタンブロット画像は、明確なバンドの列を提供し、他の人は明確な線がほとんどまたはまったくないスミアのようなパターンを生成します。イメージ化されたユビキチンウエスタンブロットの定量化については、分子標準のはしご全体を伸ばす柱の周りにボックスを描きます。ユビキチン染色がはしご全体を通って伸びる場合は、ボックスを調整します。これはリジン48修飾に共通し、細胞内区画全体で大きく異なります。最後に、すべての辺の列を直ちに囲む背景の平均光学密度として計算される背景を差し引く。ここに示されているのは、同じ動物の横扁桃体から採取された異なる画分におけるプロテアソーム活性の定量である。インビトロプロテアソーム活性アッセイの間、検出された相対的な蛍光単位はシナプス画分、細胞質画分、および核画分においてアッセイの最初から終わりまで増加した。プロテアソーム阻害剤β-lacは、セッション全体でRfUSが変化するのを防いだ。同じ動物の横扁桃体におけるプロテアソーム活性において細胞内差異が認められた。核プロテアソーム活性の増加は、シナプス分画内の活性の低下に対応するコントロールに対して訓練された動物で検出された。細胞質プロテアソーム活性はベースラインに残った。ここに示されているのは、学習後の同じ動物の横扁桃体におけるリンケージ特異的タンパク質ユビキチン化における細胞内差である。細胞質画分の減少と相関する学習後の核分率の全体的なユビキチン化の増加があった。学習後、線形ユビキチン化は核分率で増加したが、細胞質またはシナプス分画は増加しなかった。興味深いことに、K63ユビキチン化は、シナプス分率の減少と相関する学習後の核分率で増加した。一方、K48ユニキチン化は、学習後の核および細胞質画分では増加したが、シナプス画分では増加しなかった。このプロトコルは、同じ動物内の他のタンパク質の細胞内分布および機能を理解するためにも使用することができる。

quantifying-subcellular-ubiquitin-proteasome-activity-rodent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、蛍光ペプチドアッセイを使用して、恐怖条件付けおよび制御ラットの脳から外側扁桃体の異なる細胞内コンパートメントにおけるプロテアソーム活性を測定する方法を示しています。プロテアソームは蛍光ペプチド基質を切断して蛍光分子を放出し、プレートリーダーを使用して定量化し、核およびシナプスタンパク質画分のプロテアソーム活性を評価します。核活性の増加は遺伝子発現の変化を示唆し、シナプス活性の低下は長期記憶の維持に必要なタンパク質の安定化を示しています。...

ラット脳の異なる細胞内コンパートメントにおけるプロテアソーム活性の測定

出典: Kimmelmann-Shultz, B., et.al. }近赤外蛍光と高解像度スキャンを使用して、げっ歯類の脳内のタンパク質発現を測定します。J. Vis. Exp. (2019)...

近赤外蛍光と高分解能スキャニングを用いたげっ歯類脳におけるタンパク質発現の測定

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細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法

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げっ歯類の脳におけるタンパク質発現を測定するために近赤外蛍光と高解像度走査を用いること

このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。...

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

ここでは、ラットの実質的なニグラ・パルス・コンパクでのドーパミン作動性ニューロン数の半定量的決定のための自動化された方法を提示する。...

自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチングニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定

我々は、哺乳動物細胞における特定の基質およびE3ユビキチンリガーゼのユビキチル化アッセイのための詳細なプロトコルを提供する。HEK293T細胞株をタンパク質過剰発現に使用し、ポリユビキチル化基質を免疫沈降によって細胞溶解物から精製し、SDS−PAGEで分解した。イムノブロッティングを用いて、この翻訳後修飾を可視化した。...

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

このプロトコルでは、組換えタンパク質精製とユビキチン鎖切断アッセイを組み合わせることにより、神経発達障害に関連する遺伝的変異が脱ユビキチン化酵素活性に及ぼす影響を測定する方法を説明しています。...

In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

学ぶ、げっ歯類脳のシナプス・細胞質・核内におけるユビキチンプロテアソーム活性の定量化法。同一個体内での比較が可能で、学習や疾患におけるタンパク質分解動態を効率的に解析できます。

げっ歯類脳における細胞内ユビキチンプロテアソーム活性の定量化

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