免疫蛍光法を用いたマウス脳におけるシナプス前タンパク質の分布の定量化

組織包埋培地に埋め込まれた化学的に固定されたマウスの脳スライスを取ります。

スライスをバッファーで洗浄して培地を取り除きます。

膜を透過性化し、非特異的結合部位をブロックする溶液を追加します。

溶液を取り除きます。

ニューロンのシナプスタンパク質を視覚化するには、スライスを一次抗体とともにインキュベートします。

これらの抗体は、特定の脳領域のシナプスで発現するシナプス前タンパク質と、リファレンスマーカーとしてユビキタスに発現するシナプスタンパク質を標的とします。

バッファーで洗浄して、結合していない抗体を除去します。

一次抗体を標的とする蛍光色素標識二次抗体を導入します。

バッファーで洗浄して、結合していない二次抗体を除去します。

DNA結合色素で核を対比染色します。

バッファーで洗浄し、適切な封入剤を使用してスライスをマウントします。

共焦点顕微鏡でスライスを視覚化します。

標的タンパク質と参照マーカーの平均蛍光強度比を計算して、さまざまな脳領域にわたる標的タンパク質の分布を分析します。

免疫染色用にスライスを準備するには、プラスチックピペットを使用して、脳スライスを引き込まずに1つのウェルからPB溶液を除去します。次に、1,000マイクロリットルのピペットを使用して250マイクロリットルの新鮮なPBを加え、余分なOCTを洗浄します。スライスが乾燥しないように、その時点でウェルごとにこの洗浄を繰り返します。

次に、プラスチックピペットを使用して、最初のウェルからPB溶液を除去します。1,000マイクロリットルのピペットを使用して、ウェルあたり250マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加し、ウェルごとにうまく機能します。プレートを室温でシェーカーで3時間インキュベートします。反応チューブへのウェルあたり250マイクロリットルの抗体バッファーでのインキュベーション中。

次に、2マイクロリットルのピペットを使用して適量の抗体を加え、溶液に直接ピペットで入れ、静かに上下に数回ピペットで混合します。次に、この希釈した抗体をボルテックスして、適切な混合を確保します。

ごとにうまく機能し、プラスチックピペットでブロッキングバッファーを除去し、ウェルあたり250マイクロリットルの一次抗体溶液を追加します。プレートを摂氏4度のシェーカーで一晩インキュベートします。

翌日、プラスチックピペットで抗体溶液を取り出します。ウェルあたり300マイクロリットルの洗浄バッファー1でスライスを、室温のシェーカーで10分間洗浄するたびに3回洗浄します。洗浄中、暗所で作業し、蛍光色素共役二次抗体を反応チューブ内で、一次抗体で以前に行ったのと同じ方法で希釈します。

洗浄が完了したら、プラスチックピペットで洗浄バッファーを取り除き、ウェルあたり250マイクロリットルの二次抗体溶液を加えます。室温で暗所で90分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、プラスチックピペットで抗体溶液を取り出します。洗浄バッファー1と同じ方法で、洗浄バッファー2で切片を3回洗浄します。

この洗浄中に、DAPI染色を0.1モルPBで希釈して、1〜2000の濃度にします。プレートから洗浄バッファーを取り出した後、250マイクロリットルのDAPI溶液を加え、シェーカー上で室温で5分間インキュベートします。

プラスチックピペットでDAPI溶液を除去した後、1,000マイクロリットルのピペットを使用して、ウェルあたり500マイクロリットルの0.1モルPBを追加します。顕微鏡スライドをステレオスコープの下に置きます。細いブラシを使用して、0.1モルPBをスライドに3滴ずつ加えます。ブラシを使用して、スライドに一滴につき 1 つのスライスを置き、スライスを平らにして向き

すべてのスライスが正しく配置されたら、紙ティッシュを使用して余分なPBを取り除き、スライスを完全に乾かさずに慎重に乾かします。次に、80マイクロリットルの包埋培地をスライドに加え、カバーガラスで慎重に覆い、脳スライスを埋め込みます。

光への露出を避けるためにスライドを覆い、ヒュームフードで1〜2時間乾燥させてから、共焦点顕微鏡の準備が整うまで摂氏4度の顕微鏡スライドボックスに保管します。

原稿で説明されているように、さまざまなチャネルの全脳スライスの仮想組織を取得した後、[ファイル]、[開く]の順にクリックして、1つの画像のすべての単一チャネルをフィジーにロードします。次に、フリーハンド選択ツールを使用して、DAPI チャネル内の 1 つの半球を描写します。[編集]、[選択範囲]、[マスクの作成]の順にクリックして、選択した領域のマスクを作成します。

次に、[分析]、[粒子の測定]の順にクリックして、単一チャネルの平均蛍光強度を決定し、必ず異なるチャネルを選択して各チャネルの平均蛍光強度値を決定します。

その後、単一チャネルの平均蛍光強度をスプレッドシートにコピーします。対象領域の単一チャネルの平均蛍光強度を決定するには、フリーハンド選択ツールで領域を描写します。