安定同位体のトレースを使用した複雑な細胞のコミュニティのソートされた亜集団で代謝を測定する方法

この記事では、安定同位体追跡、特定の細胞タイプを分離するための細胞選別、および質量分析の組み合わせを使用して、複数の細胞タイプの複雑なコミュニティにおける細胞代謝を研究する方法について説明します。

この方法の全体的な目標は、同位体追跡を使用して、複雑な細胞群集の選別された集団の代謝を測定することです。したがって、この方法を使用すると、複雑な細胞群集の亜集団間の代謝の違い、およびそれらの亜集団間の代謝協力を研究できます。この手法の主な利点は、同位体追跡と細胞選別を組み合わせることで、代謝のより信頼性の高い測定を得ることができ、また、この方法の信頼性を検証できることです。

この方法は、さまざまな技術を組み合わせており、細胞の取り扱い方法や手順の長さが細胞代謝に影響を与える可能性があるため、視覚的なデモンストレーションが重要です。ディッシュからの代謝物抽出では、まず、透析サプリメントを含む安定同位体標識培地で6ウェルプレートで細胞を培養します。細胞が75%のコンフルエント度に達したら、均一に標識されたグルコースを含む500マイクロリットルの冷たいHBSSでウェルを2回すすぎます。

次に、600マイクロリットルの100%ドライアイス予冷メタノールを各ウェルに加え、プレートをドライアイスに移します。セルスクレーパーを使用して細胞を剥離し、各ウェルからの抽出物を個々の微量遠心チューブに慎重に移します。質量分析まで細胞を摂氏マイナス80度で保存します。

選別された細胞の代謝産物抽出のためには、透析サプリメントを含む標識された培養培地で100mm皿で細胞を培養し、選別日までに75%のコンフルエント度に達するようにします。細胞周期選別細胞のパルス標識には、透析サプリメントを含む非標識培地で細胞を75%の密度に達するまで培養します。次に、培地を新鮮な標識培地と交換することにより、細胞を2時間パルス標識します。

均一に標識されたグルコースを含む温かいHBSSで皿をすすぎ、摂氏37度のトリプシンEDTA1.5ミリリットルで細胞を剥離します。4分後、標識グルコースと透析サプリメントを含む3ミリリットルの氷冷HBSSでトリプシンを不活性化し、細胞を15ミリリットルの円錐管に移して遠心分離します。標識グルコース、透析サプリメント、およびEDTAを含むHBSSにペレットを10〜6細胞/mLの濃度の1〜2倍で再懸濁し、40ミクロンのストレーナーで細胞をろ過して単一細胞懸濁液を得る。

細胞を5ミリリットルのチューブに移し、フローサイトメーターで選別します。模擬選別細胞からの代謝物抽出では、破片を歩行させ、一重項のみを選別します。細胞周期から代謝物を抽出するには、破片とダブレットを歩行させ、ジェミニンプローブ蛍光に基づいて細胞をG1とSG2Mに選別します。

ソートの最後に、遠心分離によって細胞を回収し、ペレットを50マイクロリットルの氷冷蒸留水に再懸濁して、均質なペレットを得る。次に、540マイクロリットルのドライアイス冷却メタノールを添加して代謝産物を迅速に抽出します。LCMS分析まで、サンプルを摂氏マイナス80度で保存します。

選別された細胞からの代謝産物の抽出は、代謝の変化を最小限に抑えるために実験作業をできるだけ早く完了して、事前に十分に計画する必要があります。抽出した代謝物の分析では、まず、良質なサンプルピークを示す、対応する利用可能な標準物質を持つ代謝物をいくつか選択します。次に、偽同位体を含めないように注意しながら、ピークの品質を確認します。

同位体標識サンプルの画分から質量同位体を計算します。これにより、各質量同位体のピーク面積を当社の画分から取り出した質量同位体の合計ピーク面積で割ることができます。次に、炭素濃縮の式を使用して、炭素13の濃縮のための標識された炭素画分を計算します。最後に、窒素濃縮の式を使用して、窒素-15の濃縮のための標識窒素画分を計算します。

この代表的な実験では、データ解析から選択された66の代謝物が模擬選別細胞に存在し、そのうち60は、ディッシュ抽出物と模擬選別細胞との間の分布から同様の質量同位体で標識されているように見えました。例えば、グルタミン酸の分布からの質量同位体は、ディッシュと模擬選別抽出物の間で類似しており、私たちの分布からのグルタミン酸質量同位体は、選別された細胞集団でも信頼性が高いことを示しています。FUCCI geminin プローブを使用して G0、G1、または SG2M 細胞周期ステージのいずれかに選別された HELA 細胞を解析すると、両方の集団でシチジン標識が明らかになり、SG2M ステージで濃縮が高く、S 期におけるヌクレオチドの de novo 合成の増加と一致します。

この実験では、我々の分布からの質量同位体は、細胞周期でソートされた画分の両方で同じパターンを示し、同じ合成経路が使用されているが、SG2M段階ではより活性が高いことを示唆しており、この方法では、密接に関連する亜集団間でも代謝の違いが容易に検出可能であることが示された。このビデオを見れば、選別された画分から代謝物を抽出する方法を十分に理解し、注意点を理解することができるはずです。この手順を試みる際には、細胞の取り扱い方法と時間の長さが細胞の代謝に影響を与える可能性があるため、選別および代謝産物抽出中に細胞を迅速に取り扱うことを覚えておくことが重要です。

一度習得すれば、このテクニックは5時間で実行できます。この手順は、他の細胞タイプにも適用できます。例えば、血液中の免疫細胞サブセットや腫瘍内の異なる種類の細胞を、さまざまなプローブ、抗体、または染色方法を使用してソーティングします。