問題のあるプラント、卵菌類、および真菌サンプルのための電子顕微鏡（SEM）プロトコルをスキャン

この方法論の目標は、植物、卵菌類、菌類の繊細な組織を取り扱い、走査型電子顕微鏡(SEM)で最適に観察することです。この方法は、実質的にあらゆる真菌、微生物、気性、およびそれらがどのように感染し、コロニーを形成し、宿主に付着するかに関する質問に答えるのに役立ちます。私たちの改良された方法論の技術は、水生生態系のmi-toh-minsの場所のために、サンプルを固定するためのものです。

この手法の主な利点は、高価で簡単に入手できるリソースを使用して、感染の主要な側面を視覚化できることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、ステップが従来のプロトコルから大幅に変更されているため、非常に重要です。また、公開された方法は、詳細を伴わずに一般的な手順を説明しています。

まず、ホルモールと酢酸アルコール、またはFAA固定剤をアルデヒドフィルターを取り付けたヒュームキャビネットで調製します。70%変性エタノール85部、60%ホルムアルデヒド溶液10部、氷酢酸5部。ヒュームキャビネットの下に、FAAのストックを個々の容器に注ぎます。

固定する花または植物の分裂組織を選択し、昆虫、菌類、または極端な気象条件によって損傷を受けないようにします。枝を切って不要な材料を取り除き、サンプルをすぐにFAA溶液に沈着させます。72〜96時間後、FAAをプラスチック容器に注ぎ、化学薬品を廃棄します。

すぐにサンプルを新鮮な70%エタノールで3回洗浄し、残留FAAを除去します。固定材料は70%エタノールで無期限に保存できます。サンプルをエタノールで覆われたシャーレに解剖して、組織が乾燥するのを防ぎます。

ベースを乾燥した黒いシリコンで覆ったシャーレを使用して、対照的な白いティッシュをよりよく見ます。組織を別々の容器に移し、これらを70%エタノールの入ったシャーレに浸します。容器に蓋をして、70%エタノールをたっぷり含んだプラスチック製の遠心分離管に入れます。

解剖した材料を、密閉ジャーまたは遠心分離チューブ内のエタノールシリーズを介して移します。サンプルを各溶液に少なくとも1時間放置します。その後、サンプルを100%エタノール溶液に一晩保管します。

エタノールシリーズに続いて、材料が入った容器をCPDに移し、SEMサンプルホルダーの下にサンプル識別番号を記入します。次に、スタブの上部を両面テープで覆います。

スタブを標本ホルダーに入れます。実体顕微鏡で、CPDですでに乾燥した若くて繊細なサンプルが入った容器を慎重に開きます。CPD処理後、サンプルは軽くなり、静電気に敏感になることに注意してください。

サンプルを取り出したら、ほこりや不純物を避けるために容器を閉じます。サンプルをスタブの粘着性のある表面に置き、目的の位置に先んじて計画します。サンプルが表面に触れると、それらを取り除くことは非常に困難です。

この時点では、大きな解剖を行おうとしないでください。拾いやすい不要なティッシュを取り除くだけです。古生物学の研究のために、葯を解剖して開き、スタブ上の花粉を露出させます。

サンプルは、再水和を避けるために、シリカゲルが入った密閉容器で一晩保護してください。スポッターコーターを使用してサンプルをコーティングし、テキストプロトコルで説明されているようにSEMに移します。別々のペトリ皿で嚢胞の棘の異なる成長をテストするには、0.5ミリリットルの二次嚢胞懸濁液を異なる表面に置きます。

表面には、カーボン、金、銅の透過型電子顕微鏡グリッドが含まれます。以前は、漂白されたサーモンとメルルーサの鱗、およびガラスカバーが滑ります。嚢胞を摂氏20度で70分間インキュベートし、これにより嚢胞が表面に付着するのを促進します。

液体を取り除き、嚢胞を固定するために各表面に0.5ミリリットルの2%グルタルアルデヒドを追加します。サンプルを室温でヒュームキャビネットの下に1時間保管します。グルタルアルデヒドを除去し、エタノールシリーズでサンプルを脱水し、各エタノール溶液を5ミリリットルずつ15分間加えます。

最後の100%エタノール溶液に入ると、サンプルは密封されたペトリ皿に最大1ヶ月間保存できます。グリッドとスケールをペトリ皿から、サンプルを互いに分離した状態に保つCPDに適したホルダー(CPDグリッドホルダーやスタッキングサンプルホルダーなど)に慎重に移します。グリッドを取り、ピンセットでスケールしますが、嚢胞は常にグリッド上を向いている必要があることを念頭に置いてください。

テキストプロトコルに記載されているように、卵子のSEMサンプル調製を行う前に、CPDを使用して材料を乾燥させ、さまざまな表面での挙動を観察します。各サンプルを濾紙で丁寧に包み、約0.5〜1平方センチメートルの鉛筆でラベル付けされた封筒を形成します。サンプルをつぶさないように注意してください。

濾紙をペーパークリップで密封します。次に、パックされたサンプルをペトリ皿に移し、10ミリリットルの水に浸して、胞子の周りの組織を再水和します。すぐにサンプルを電子レンジに入れます。

水が蒸発し始めたら材料を取り除き、室温で冷まします。次に、サンプルをエタノールシリーズに通します。サンプルの量に応じて、このステップにはビーカーまたは遠心分離管を使用します。

サンプルを各溶液に15分間放置します。次に、テキストプロトコルで説明されているように、サンプルをCPDに配置します。SEM観察用の胞子を取り付けるには、封筒を開けます。

次に、スタブの粘着性のある表面で胞子を収集し、それらをつぶさないように注意します。最後に、テキストプロトコルに詳述されているように、サンプルの金コーティングとSEM観察を行います。ここに示されているのは、四酸化オスミウムで処理され、このビデオで示されているFAA CPDプロトコルを使用して調製されたanacyclus clavatusの花芽です。

また、処理されていないPhellorinia herculaneaの乾燥サンプルと、このビデオで示されているように処理された真菌胞子も示されています。この図は、SEMでキャプチャされた初期、中期、および後期の花の発達を示しています。この画像は、若いreh-cimの上面図です。

ここに示されているのは、雌分化中の花芽とアンテシスの花です。一部の構造は、SEM下でのイメージングのために固定および保存するのが難しい場合があります。例としては、湿った環境から来るもの、装飾が施されたもの、インダメンタのあるものなどがあります。

ここに示されているのは、ガラス、炭素、銅、金、メルルーサの鱗、およびサケの鱗屑上のSaprolegnia parasiticaの棘の異なる成長パターンです。これは、Saprolegnia parasiticaの無性生活のサイクルを示すビデオです。無性生殖のライフサイクルは、これらの生物が水生環境や湿気の多い環境に分散するために重要です。

さらに、この段階で生成される動物園のスポールは、サポレニアル目の寄生種における感染の主要な単位を表しています。このテクニックをマスターすると3〜5日で完了しますが、適切に実行されます。私たちは、マドリッドの王立植物園でこの時間枠で外部使用に提供するSEM療法を完了するためにお金を使いました。

このビデオを見た後、研究者はSEM観察のために繊細な生体材料を効果的に収集して固定する方法を知るでしょう。この手順では、細胞の破壊、臓器の歪み、または湿った環境からのサンプルの保存不良を簡単に克服できます。この手順を試行する際、SEMによる観察は表面の高倍率研究に限定されることを覚えておくことが重要です。

また、CPD処理の前に、シールは衝撃的な変化や空気との直接接触から安全に保つ必要があります。その開発後、この技術は、植物学の分野の研究者が、特に漁業が関心を持つ種において、感染過程における胞子の構造を調査する道を開きました。この手順に続いて、特定の臓器や細胞、または花粉の細胞組成物の内部構造がどのようになっているかなど、追加の質問に答えるために、透過顕微鏡法やTMなどの他の方法を実行できます。

ホルマリンとグルタルアルデヒドの操作は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、ヒュームキャビネットの下での作業やマスク、白衣、手袋の使用などの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。