木管化カブトムシの付属物の走査型および透過型電子顕微鏡の試料調製方法
February 3rd, 2020
昆虫センシラの超構造を観察するために、走査電子顕微鏡と透過電子顕微鏡(それぞれSEMおよびTEM)のサンプル調製プロトコルを研究で提示した。TEMでサンプル変形を避けるためにTween 20を固定に添加した。蛍光顕微鏡法はTEMにおけるスライス精度を向上させるのに役立った。
ウッドボーリングカブトムシ彼らの体面はSEMでは常に難しいです。Tween-20は固定および洗浄の解決に加えられる。木のつまらないカブトムシの体面 TEMでは、Tween-20 は体壁への固定性の浸透を高め、体内の組織や臓器をより良く固定することができます。
蛍光顕微鏡は、スライス精度を向上させるのに役立ちます。この技術は、体表面を洗浄し、木のつまらないカブトムシの体壁に浸透するのに役立ちます。したがって、SEMとTEMのビジョンをクリアします。
蛍光顕微鏡はTEMのスライスの正確さを改善するために役立つ。この手順のデモンストレーションは、当研究室の大学院生である張上ruです。クロロホルス・カラガナが住んでいる地域では、漏斗トラップにイソフォロンなどの植物誘引物質を餌にしたフィールドトラップを配置します。
トラップに木のつまらないカブトムシの大人を引き付けます。pH 7.2で1リットル当たり0.1モルの成人クロロフォラスカラガナのきれいな体を保存し、体積グルタルアルデヒドで2.5%重量、および体積Tween-20で0.06%体積。3日間摂氏4度でサンプルを固定します。
保存液から体を取り出し、PBSですすいでください。ステレオ顕微鏡の下で、付属物を取り除き、PBSTで40キロヘルツで超音波洗浄するために鉗子を使用してください。100秒間洗浄した後、サンプルを顕微鏡に移して、清潔かどうかを確認します。
損傷を避けるために400秒以上清掃しないでください。次いで、サンプルをエタノールに20分間濃度で浸し、脱水を行います。脱水後、ステレオ顕微鏡下で、カーボン両面粘着テープを使用して、3つの観察面、側側、腹側、および側面をスタブに別々に固定します。
すべての表示面が清潔で汚染がないことを確認します。シリカゲル乾燥剤を含むペトリ皿にサンプルステージを48時間置きます。次に、イオンスパッタリング装置で、メインバルブを開いた位置まで回転させ、サンプルチャンバーカバーを取り外し、サンプルをチャンバーに入れます。
電源スイッチをオンにして、準備ができたライトが点灯していることを確認します。スパッタリング時間を45秒、コーティング厚さを70.875オングストロームに設定します。機械ポンプの真空ダイヤルインデックスが7を下回ったら、放電を押して白金の散布を開始します。
手順の最後に、電源をオフにして、サンプルをチャンバーから取り出します。V回T.K倍のK倍に等しいオングストロームでスプレーフィルム厚Dを算出し、スパッタリングされた金属とガスによって決定される定数である。私はミリアンペアのプラズマ流れであり、Vはキロボルトで印加される電圧であり、Tは秒単位の時間です。
サンプルを含むスタブを SEM のステージに挿入します。SEMソフトウェアを開き、20キロボルトから希望の動作電圧を選択します。
成体のクロロフォラスカラガナから付属物を得た後、PBSTのサンプルを超音波浴で3時間洗浄し、PBSで1%重量の体積オスミウム四酸化された25°Cで1時間後固定します。室温での体積エタノールで50%60%70%80%85%90%95%100%および100%体積で20分連続処理を使用してサンプルを脱水します。鉗子で、平らな埋め込み型の熱い樹脂を適用し、樹脂にサンプルを埋め込む。
サンプルがプレートの底部にあり、埋め込まれた溝の端にできるだけ近づけるようにしてください。ラベルを付け、サンプルを含むプレートを摂氏60度で72時間インキュベートします。インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、樹脂が重合していることを確認します。
サンプルが固まったら、各樹脂ブロックを蛍光顕微鏡の下に置き、顕微鏡の蛍光光源を動かして、上から青色光で試料を照射し、それらを撮影します。樹脂ブロック内の感性線がはっきりと見えるようにしてください。樹脂ブロックの端とターゲットセンサとの距離を測定し、センサをターゲットにします。
パルプのSEM画像を参照し、ターゲットレセプターに近いカミソリの刃で樹脂ブロックを大まかに切断します。次に、青色光蛍光顕微鏡下で、上記の光源を調整して、感音がはっきりと観察されるようにする。目的マイクロメータを蛍光顕微鏡ステージに追加します。
大まかにカットした樹脂ブロックを撮影し、ImageJを使用してターゲットと樹脂のエッジの距離を測定します。樹脂サンプルを超ミクロトーム上に置き、ターゲット位置に達するまで50〜60ナノメートルの厚さのセクションを切断します。ペトリ皿の中で、フォームバーコーティングされた100メッシュの銅グリッドにセクションを取り付けます。
室温でウラニル酢酸の飽和濾過溶液でグリッドを染色します。染色時にセクションを覆い、光誘発性沈殿物を遮断します。10分間汚れます。
ヒュームフードでは、50%メタノールで2回リンスし、次いで濾過された脱気水で2回リンスする。プラスチックペトリ皿の正方形に準備された鉛クエン酸塩の汚れの滴を置き、8分間座らせます。脱気濾過水ですすいで乾燥します。
TEM マシン内のサンプル・ステージにグリッドを取り付けます。電圧を80キロボルトに設定し、セクションを調べます。このプロトコルでは、Tween-20で洗浄および固定溶液を用いて、Tween-20を使用しないよりも明確なSEM画像が観察された。
Tween-20固定溶液により、グルタルアルデヒド固定溶液が組織に浸透することを可能にし、Tween-20なしで調製されたサンプルの内部構造がぼやけている間、微小管構造がTEM画像ではっきりと見られた。上顎の触知体上のタイプ1センシラ小枝塩基化のペグの連続的な断面図は、樹状鞘が外側樹状セグメントを取り囲み、先端細孔に伸びることを示した。7つの分岐されていない外側樹状セグメントは、外側の空洞に囲まれた内側の受容体リンパ腔内に存在していた。
管状体は、各細径ソケットベースの他の外樹状セグメントから樹状鞘によって分離した。毛様体領域では、8つの双極性ニューロンの存在を示す、異なる直径の8つの樹状突起が同定された。この技術は、単一細胞記録やその時点でのハイブリダイゼーションなどの神経の機能をさらに研究するために使用することができる。
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概要
この研究は、走査型および透過型電子顕微鏡（SEMおよびTEM）を使用した超微細観察のための昆虫の感覚器サンプルの準備プロトコルを提示します。SEMでサンプル変形を防ぐ方法として、固定液にTween 20を追加することが強調されています。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- 顕微鏡技術
背景
- 昆虫の感覚器は感覚機能を理解する上で重要です。
- 電子顕微鏡は詳細な構造的洞察を提供します。
- サンプルの準備は正確なイメージングに不可欠です。
- Tween 20は固定液の効果を高めます。
研究の目的
- 顕微鏡用昆虫の感覚器サンプルの準備を改善すること。
- SEMおよびTEMのイメージングの品質を向上させること。
- 固定プロセスでのTween 20の使用の利点を実証すること。
使用された方法
- 走査型電子顕微鏡（SEM）
- 透過型電子顕微鏡（TEM）
- 固定液溶液におけるTween 20の使用
- 精密なスライスを達成するための蛍光顕微鏡
主要な結果
- Tween 20はSEMでのサンプル変形を大幅に減少させます。
- TEMでの組織の固定と浸透が改善されます。
- 蛍光顕微鏡は正確なスライスの達成を助けます。
- 昆虫の感覚器のイメージングの明瞭さが向上します。
結論
- このプロトコルは効果的に昆虫の感覚器のイメージングの品質を向上させます。
- Tween 20はサンプル準備の価値ある追加です。
- 蛍光顕微鏡は正確なサンプルのスライスに有益です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enhances sample preparation for ultrastructural imaging of biological appendages, supporting target validation in neuroscience and sensory biology research. By improving fixation and imaging clarity, it enables more reliable phenotypic screening and mechanistic de-risking of neural targets. The method contributes to predictive confidence in early discovery workflows involving insect or invertebrate model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of sensory neuron ultrastructure to validate insect sensilla as disease-relevant systems for target screening.
- Operational Value: Provides reproducible sample preparation for consistent imaging across studies.
- Strategic Value: Supports lead identification by clarifying neural target architecture in invertebrate models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates assay readiness by producing high-fidelity structural data for correlative functional screening.
- Operational Value: Standardizes dehydration, embedding, and sectioning steps to improve reproducibility in ultrastructural workflows.
- Strategic Value: Enables platform reuse across insect models for comparative target validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by linking sensilla ultrastructure to sensory function in pest control target validation.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation via standardized TEM-ready samples.
- Strategic Value: Aids risk-adjusted advancement decisions by reducing ambiguity in neural target characterization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where ultrastructural confirmation supports target hypothesis testing and biological de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling clear visualization of dendritic sheaths and neuronal structures in insect sensilla.
- Screening: Describes assay readiness through standardized dehydration and sputter-coating for reliable SEM imaging.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as dendritic segment counting and pore measurement for comparative analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via fluorescence-guided sectioning for precise ultrastructural correlation.
- Enterprise Reuse: Positions the protocol as a reusable capability for insect model preparation across discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through enhanced visualization of microtubule and dendritic structures in TEM.
- Operational Value: Standardization via Tween-20-enhanced fixation and fluorescence-guided slicing for reduced variability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk in neural target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through improved target confidence in invertebrate neuroscience models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electron microscopy, histology, and fluorescence imaging.
- Depends on access to SEM, TEM, ultrasonic cleaners, sputter coaters, and ultramicrotomes.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, dehydration, and staining protocols.
- Involves adaptation considerations when applying to different insect species or appendage types.
- Includes practical limitations such as ultrasonic cleaning duration constraints to prevent sample damage.
