大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル

本プロトコルの全体的な目的は、成体ショウジョウバエの脳を迅速に摘出し、ホールマウント解析に適した形態保持状態の良い脳を効率的に得ることができる、簡便なワンステップの解剖手順について説明することです。この手法は、神経科学および遺伝学の分野における疑問の解決に寄与します。これには、脳回路の詳細なマッピング、ニューロンの遺伝学的操作による影響の研究、および遺伝子の機能解析などが含まれます。

この手法の主な利点は、習得が容易な手順であることです。これにより、形態が良好に保持された成虫のハエの脳を、10秒以内に摘出することが可能になります。ハエの頭部を囲む外骨格を引き剥がす際、ピンセットを離す時の必要な慣性を制御するには技術と練習が必要であるため、本手法のビデオデモンストレーションが非常に重要となります。

これらの小さく煩わしいショウジョウバエは、生物学的な原理について多くのことを教えてくれました。また、アルツハイマー病やパーキンソン病などの人間における疾患の原因究明や治療法の発見にも役立つ可能性があります。倍率を1.2 Xに設定した解剖顕微鏡を使用し、麻酔をかけたハエを固定し、腹部を上にした状態で冷たい解剖液に浸します。

ピンセットを解剖プレートに対して160〜170度の角度に保ち、ハエの腹部に軽く力を加えます。これによりハエが固定され、頭部が15〜25度後方に押し下げられ、口吻が上方に伸びます。この操作の後、口吻の下にあるクチクラの柔らかく半透明な領域が明確になります。

倍率を上げ、この領域に焦点面を調整します。利き手で解剖用ピンセットを持ち、先端を閉じるように圧力をかけます。ハエを固定しているピンセットに対して、垂直にピンセットを配置します。

ピンセットの閉じた先端を、クチクラの柔らかい半透明の領域に刺し入れます。この際、脳に触れるほど深く刺さないように注意してください。次に、素早く、かつ確実にピンセットを離して先端を開かせ、ハエの頭部の外骨格を引き裂きます。ピンセットの先端を離したときの勢いを利用して、外骨格と、それに付随する頭部ケース、眼、気管の大部分を、脳組織から一度の動作でそっと取り除きます。

これで、損傷のない脳が露出しているはずです。ピンセットを使用して、白い繊維状の気管組織などの残りの付随組織を慎重に除去します。その際、脳本体を引っ張ったり損傷させたりしないよう注意してください。摘出した脳サンプルを胴体とともに、氷上の4%paraformaldehyde約1mLに入れ、40分から60分間静置します。

パラホルムアルデヒドを除去し、1 mLの1X PBSでサンプルをリンスします。その際、脳組織を吸引しないように注意しながら、ピペッティングで溶液を3回吸い上げ、吐き出してください。次に、PBSを除去し、1 mLの1X PBTを用いて、ニューテーションにより5分間ずつ5回洗浄します。その後、目的の一次抗体を適切な希釈倍率で添加します。

その後、サンプルを4 °Cで一晩、ニューテーションを用いてインキュベートします。一次抗体を除去し、1 mLの1X PBTを用いて、1回につき5〜10分間、ニューテーションを行いながら計5回サンプルを洗浄します。洗浄後のサンプルに、適切な希釈率とインキュベーション時間で二次抗体を添加します。

続いて、サンプルを1 mLの1 X PBTで10分間ずつ、ニューテーションを用いて6回洗浄します。この工程は、非特異的に結合した二次抗体を除去するために不可欠です。その後、1 mg/mLのDAPIを1 X PBT溶液で1:10,000に希釈した液1 mLにサンプルを浸し、ニューテーションを行いながら30〜60分間インキュベートします。

最後に、1 mLの1 X PBSを加えてサンプルを洗浄し、ピペッティングを3回行います。カバーガラスをマウントスライドの上に置きます。チップの先端を切断したピペットを使用して、1 X PBS溶液中の脳をカバーガラス上に移します。

次に、ピンセットを用いて脳を体から分離します。細いピペットチップを使用して、脳組織の周囲の液体を除去します。その後、20〜40 µLの抗退色封入剤を加えます。

粘性の媒体を外側に追いやりながら、脳をゆっくりと広げます。片側から、気泡が脳に触れるのを最小限に抑えるよう注意しながら、2枚目のカバーガラスをサンプル上にゆっくりと下ろします。カバーガラスが馴染むまで待ち、その後、ラボワイプを使用してカバーガラスの端から余分な液体を取り除きます。

小さなテープを使用して、カバーガラスのペアをマウンティングスライドに一時的に固定します。サンプルの観察には、複合蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用してください。これらの画像は、同一の成体Drosophilaの前方および後方からのビューを示しています。

細胞核はDAPI染色により可視化し、ニューロンは汎ニューロンマーカーおよびanti-ELAV抗体を用いて標識した。ドーパミン作動性（DA）ニューロンは、anti-TH抗体染色により明らかにした。すべてのイメージチャンネルにおいて、脳の両側で同程度の強度が見られた。

脳の前方および後方の拡大像により、DA神経細胞クラスターの詳細な examination が可能です。前方の画像では対になった前内側クラスターが確認でき、脳の後方では対になった後内側および対になった後外側クラスターが確認できます。これらの神経細胞を定量化した結果、3日齢のオス w1118 株のショウジョウバエでは、全脳の PPM クラスターに通常 27 個、片側脳半球の PPL クラスターに 16 個、および片側脳半球の PAL クラスターに 5 個の DA 神経細胞が存在することが明らかになりました。

PAMクラスターのそれぞれに、平均97個のDAニューロンが認められました。PALおよびPAMクラスターの3D再構築により、PAMクラスターのDAニューロンは、PALなどの他のクラスターのニューロンよりも相対的にサイズが小さく、TH染色の強度が弱いことも示されました。高次脳機能の根底にある分子経路や神経回路の解析、およびヒトの脳疾患のモデリングにおいて、成虫のショウジョウバエ脳に着目した研究がますます増加しています。

このような脳ベースの研究では、形態が良好に保存された脳サンプルを効率的に調製することが不可欠です。これは、大規模な脳ベースのスクリーニングにおいて特に重要となる可能性があります。私がこの手法を思いついたきっかけは、ピンセットでハエを保持することに苦労していたときでした。

多くのショウジョウバエ研究者が使用する先端の鋭いピンセットの代わりに、Shebnaは鈍端ピンセットを試したところ、脳の解剖がより容易であることが分かりました。この技術を習得し、適切に行えば、10秒以内に完了させることができます。かつて私は、1回の実験のために6種類の異なる遺伝子型の脳を約100個、わずか1日で解剖したことがあります。

この解剖手順は単純に見えるかもしれませんが、まずは使い捨て可能なハエを用いて練習することが重要です。また、ハエの脳を破壊せずにピンセットを配置することに苦労する場合があるかもしれません。解剖した脳は、RNA解析、in situ ハイブリダイゼーション、脳組織からのタンパク質およびRNAサンプルの抽出など、他の研究に利用できます。

このビデオを視聴することで、形態を良好に保持したままショウジョウバエの脳を解剖できるようになります。今後の改善により、この手順はより簡便かつ迅速になると予想されます。将来的には、大規模な研究に向けて自動化される可能性があります。

パラホルムアルデヒドおよび鋭利な解剖用ピンセットの使用には危険が伴うことに注意してください。固定液を扱う際は手袋を着用するなどの予防措置を講じ、解剖が完了したら直ちにピンセットにキャップをしてから脇に置いてください。