大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコルショウジョウバエブレインズ

このプロトコルの全体的な目標は、成虫のショウジョウバエの脳のための簡単なワンステップ解剖手順を説明することです。これにより、ホールマウント分析に適した保存された形態の脳を迅速に作成できます。この方法は、神経科学と遺伝学の分野の質問に答えるのに役立ちます。これには、脳回路の微細なマッピング、ニューロンの遺伝子操作の影響の研究、遺伝子の機能的特性評価などが含まれます。

この手法の主な利点は、習得しやすい手順が含まれていることです。それは10秒未満でよく保存された形態の成虫のハエの脳を解剖することを容易にすることができます。鉗子を離してフライヘッドを囲む外骨格を引き裂くときに必要な運動量を制御するには、スキルと練習が必要なため、この方法のビデオデモンストレーションは非常に重要です。

これらの小さくて厄介なショウジョウバエは、生物学的原理について私たちに多くのことを教えてくれました。また、アルツハイマー病やパーキンソン病などの人間の病気の原因と治療法を見つけるのにも役立つかもしれません。1.2倍の倍率に設定された解剖顕微鏡を使用して、麻酔をかけたハエを固定し、腹部を上に向けて冷たい解剖液に浸します。

鉗子を解剖板に対してそれぞれ160〜170度の角度に保ち、ハエの腹部に小さな力を加えます。これにより、ハエが固定され、頭が15〜25度後方に押し込まれ、吻が上向きに伸びます。この操作の後、吻の下のキューティクルの柔らかい半透明の領域が明らかになるはずです。

倍率を上げ、この領域に焦点面を調整します。利き手を使用して、解剖鉗子のペアを取り、先端を閉じるために圧力をかけます。ハエを拘束する鉗子に対して垂直に鉗子を配置します。

鉗子の閉じた先端をキューティクルの柔らかい半透明の領域に突き刺し、脳に触れるほど深く浸透しないように注意します。それから素早く、しかし着実に、鉗子を放してポイントが開き、ハエの頭の外骨格を引き裂きます。鉗子の先端を離す勢いを利用して、外骨格と、眼と気管に関連する頭部のほとんどを一気に脳組織から取り除きます。

無傷の脳が見えるはずです。鉗子を使用して、白い線維性気管組織などの残りの付属組織を慎重に取り除き、脳を適切に引っ張ったり損傷したりしないように注意します。解剖した脳サンプルと関連する胴体を約1ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドに氷上で40〜60分間置きます。

パラホルムアルデヒドを除去し、脳を誤嚥しないように注意しながら、溶液を3回上下させて、1ミリリットルの1 X PBSでサンプルをすすぎます。次に、PBSを取り出し、1ミリリットルのX PBT1個で5回、章動で5分間洗浄します。目的の一次抗体を適切な希釈液で添加します。

次に、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。一次抗体を取り出し、1 X PBT1ミリリットルでサンプルを5回、各洗浄時に5〜10分間、ナットネーションで洗浄します。洗浄したサンプルに二次抗体を適切な希釈時間およびインキュベーション時間で添加します。

これに続いて、サンプルを1ミリリットルのX PBTで6回、それぞれ10分間、章動で洗浄します。このステップは、非特異的に結合した二次抗体を除去するために重要です。1 X PBT溶液1ミリリットルに1ミリグラム/ミリリットルのDAPIを1〜10, 000希釈して、ナチテーションを使用して30〜60分間サンプルをインキュベートします。

最後に、1 X PBSを1ミリリットル加えてサンプルをすすぎ、溶液を3回ピペッティングします。カバースリップを取り付けスライドに置きます。先端がカットされたピペットを使用して、1つのX PBS溶液中の脳をカバーガラスに移します。

次に、鉗子を使用して、脳を体から分離します。細いピペットチップを使用して、脳組織の周りの液体を取り除きます。その後、20〜40マイクロリットルの退色防止封入剤を添加します。

粘性のある媒体を外側に変位させながら、脳を静かに広げます。片側から始めて、2枚目のカバースリップをサンプルの上に静かに下ろし、気泡との脳の接触を最小限に抑えるように注意します。スリップが落ち着くのを待ってから、ラボラトリーワイプを使用してスリップの端から余分な液体を取り除きます。

小さなテープを使用して、カバースリップペアを取り付けスライドに一時的に取り付けます。サンプルをイメージングするには、複合蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用します。これらの画像は、同じ成体のショウジョウバエの正面と後方のビューを示しています。

細胞核をDAPI染色により可視化し、汎ニューロンマーカーと抗ELAV抗体を用いてニューロンを標識した。ドーパミン作動性(DA)ニューロンは、抗TH抗体染色によって明らかになりました。すべての画像チャネルで、脳の両側で同様のレベルの強度が見られました。

脳の前方と後部を拡大して表示することで、DAニューロンクラスターの詳細な検査が可能になります。対になった前内側クラスターは前方の画像で見ることができ、対になった後内側クラスターと対になった後外側クラスターは脳の後側に見られます。これらのニューロンを定量化したところ、3日齢のオスのw1118系統バエは、通常、脳全体のPPMクラスターに27個のDAニューロン、半球あたり16個のPPLクラスターに16個、半球あたりPALクラスターに5個のDAニューロンを持っていることが明らかになりました。

PAMの各clusters. 3Dで平均97個のDAニューロンが見られ、PALおよびPAMクラスターの再構成では、PAMクラスターのDAニューロンは、PALなどの他のクラスターのDAニューロンよりもサイズが比較的小さく、TH染色が弱いことも示されました。高次脳機能の根底にある分子経路やニューロン回路を解剖したり、ヒトの脳疾患をモデル化したりするために、成虫のハエ脳に着

このような脳ベースの研究では、形態がよく保存された脳サンプルを効率的に調製する必要があります。これは、大規模な脳ベースのスクリーニングでは特に重要になる可能性があります。私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、鉗子でハエを保持するのに苦労していたときでした。

ショウジョウバエの研究者の多くが使っている先端が尖った鉗子の代わりに、シェブナは鈍い先端の鉗子を試し、脳を解剖するのが簡単であることを発見しました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば10秒未満で実行できます。あるとき、私はたった1日の実験で、6つの異なる遺伝子型の約100の脳を解剖しました。

この解剖手順は簡単に見えるかもしれませんが、まずはディスペンサブルフライで練習することが重要です。研究者はまた、ハエの脳を破壊することなく鉗子を配置するのに苦労するかもしれません。解剖された脳は、RNA、in situハイブリダイゼーション、脳組織からのタンパク質とRNAサンプルの抽出など、他の研究に使用できます。

このビデオを見た後、よく保存された形態でハエの脳を解剖できるはずです。この手順をより簡単かつ迅速にするための改善を開発できると予測しています。これは、将来、大規模な研究で自動化される可能性があります。

パラホルムアルデヒドと鋭利な解剖鉗子での作業は危険な場合があることを忘れないでください。固定液を取り扱うときは手袋を着用するなどの予防策を講じ、解剖が完了したらすぐに鉗子をキャップしてから脇に置いてください。