開発と大人の準備ショウジョウバエ脳と網膜

このビデオでは、光受容体細胞に焦点を当てたライブイメージングと免疫組織化学のために、脳と網膜のophを準備する方法を示します。まず、脳の解剖の準備方法をご紹介します。次に、成人の脳、成人の網膜、発達中の眼の3つの異なる解剖を示します。

これらのそれぞれについて、免疫組織化学または画像化された生命のために組織を固定することができます。最後に、生命組織をイメージングする方法を説明し、共鳴走査型共焦点顕微鏡を使用したライブイメージングの例をいくつか紹介します。では、さっそく始めましょう。

良い切片を作るには、鋭い鉗子が必要です。シャープニングブロックまたは非常に細かいサンドペーパーを使用して、両端が合わさるまで鉗子を両側でゆっくりと前後に通します。細かいところでは、標準的な砥石を使用します。

ここでは研ぎの技術については触れませんが、生きた解剖には鋭い鉗子が不可欠であると言います。私たちは毎日、成人の脳解剖のために鉗子を研いでいます。ハエをCO2パッドの上に置いて麻酔をかけ、目的の遺伝子型を選別します。

瞳孔解剖の場合は、バイアルに手を伸ばし、瞳孔ケースを壊さないように注意しながら、鉗子で瞳孔を慎重に取り除きます。キムワイプをワップして水で湿らせます。解剖中にこれを使用して、鉗子から破片を取り除きます。

解剖皿をステレオスコープのステージに置き、HL3溶液で満たします。すべての解剖は HL 3 で行われ、解剖手順中に組織が生きて健康であることを保証します。また、解剖中に鉗子を保護するために、底部にシルガードが覆われた解剖皿を使用するのが好きです。

次に、固定ソリューションを準備します。免疫組織化学を実行する予定の場合。180マイクロリットルのHL3を500マイクロリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。

20マイクロリットルの37%ホルムアルデヒドを加えて、3.7%ホルムアルデヒド溶液を作ります。最後に、適切な手の位置は、良好な手の位置で良好な解剖を行うために重要です。あなたの鉗子は安定しており、微妙な動きを制御することができます。

まず、鉗子を親指の側面に置き、次に人差し指をまっすぐ下に持ってきて、指の先が上に乗られるようにします。次に、鉗子の側面を中指の側面に置き、解剖皿に移動します。親指と中指を皿に置きながら、親指と中指で皿に物理的に接触させます。

顕微鏡ステージに手首を固定します。こちらへ。解剖中は表面に3つのポイントがしっかりと固定されており、鉗子の非常に微妙な操作のみを行うことが可能になりました。

CO2パッド上。大人のハエの腹側を上に向け、頭を手から離します。頭のすぐ下の胸部をつかみます。

適切に行われると、ステレオスコープで見ながら脚とプロバスが伸び、鉗子で伸びたプロボスをつかんで頭を取り除き、体を捨てて頭を沈めます。水没した頭に再び焦点を合わせます。解剖全体は溶液の下で行われます。

常に鉗子で頭をつかむことが非常に重要です。そうしないと、頭が浮いてしまいます。そして、浮いている頭は常に取り戻すのが難しいことを忘れないでください。

解剖中に頭部が焦点から外れた場合は、顕微鏡を調整せずに焦点面に戻します。この一見単純なタスクは、最初は難しいかもしれませんが、時間が経つにつれて頭を集中させ続けることが容易になります。まず、プロバスと眼の間の結合組織を引き裂くことから解剖を開始します。

常に少なくとも1つの鉗子でしっかりと保持しながら、目を引き裂きます。鉗子のつま先が網膜またはキューティクルのすぐ下にあることを確認してください。下の脳を傷つけないように、左右に交互に動かします。

鉗子を使用して、後頭部に向かって働いている網膜を引き裂きます。網膜を引き裂くと、椎弓板が視神経葉に付着したままになる可能性が高くなります。この解剖を通して、後頭部の周りを回り続け、途中でキューティクルを引き裂き、もう一方の目を引き裂き、キューティクルを引き抜き始めます。

キューティクルをつかんでいる限り、脳を潰していないことがわかります。これを念頭に置いて、脳が現れるまでキューティクルと網膜を引き離し続けます。脳が見えたら、脳に付着した気管の取り外しを開始し、脳が孤立するまで、脳、気管、キューティクルを引っ張り続けることができます。

この時点で、視細胞末端のイメージングの残りの手順について、皿の底に再び焦点を合わせる必要があります。椎弓板を保持することが望ましいですが、細胞体と強い自己蛍光色素を含む網膜を切除する必要があります。これを行うには、椎弓板を傷つけずに、ふさふさした細胞体を慎重に引っ張ります。

これはより細かいスキルであり、練習が必要です。残りの気管を取り除く そうしないと、一晩中抗体を洗浄すると脳が浮く可能性があるため、セクション7で説明する条件を使用して、成人の脳を数時間または一晩中生き続けることができます。免疫組織化学では、成体の脳を固定してホルムアルデヒドにする準備が整いました。

5マイクロリットルに設定されたP 20ピペットを使用して、成人の脳をすでに調製した固定溶液に移動します。成体の脳を20分間解剖し続けると、4〜10個の脳が得られます。脳を離れて、さらに40分間固定します。

ただし、この期間は異なる場合があります。最適な一次抗体染色のためには、ホルムアルデヒド溶液を除去し、PBSと0.4%TRITTON×100(以下、PBSトリトン)を含む溶液を400マイクロリットル、各5分間、脳を3回洗浄します。固定溶液を完全に洗い流した後、一次抗体溶液を添加してもかまいません。

成人の脳について説明したように、この解剖を開始する 頭を沈めて顕微鏡の焦点を合わせ直した後、まず、プロバスとプロバスの上の眼との間の結合組織を引き裂くことから始めます。キューティクルを目から分離します。次に、キューティクルを目の下側から分離し、1つの鉗子で頭の後ろに向かって働きます。

この解剖のために後頭部の中心をつかみます。他の鉗子で脳を潰しても大丈夫です。目をつかんで引き離します。

皿の底に目が落ち着くのを待ちます。椎弓板はおそらくまだ眼に付着しており、完全に無傷の視細胞からの視細胞末端のライブイメージングに使用できます。次の3つのセクションでは、免疫組織化学のために眼を準備する方法について説明します。

免疫組織化学の場合は、固定溶液に目を動かします。5マイクロリットルに設定されたP 20パイプペットマンを使用して、合計10分間大人の目を解剖し続けます。目を離し、さらに30分間固定します。

固定溶液を取り出し、成人の脳解剖で説明されているように洗浄を行います。.最終的に目の材料構造を画像化したい場合は、 を取り除く必要があります。次に、固定された目を解剖皿に戻し、まだ付着している可能性のある気管または脂肪細胞をすべて取り除きます。

次に、一方の鉗子で目の外側を保持しながら、もう一方の鉗子で椎弓板を取り除きます。それは一つに外れ、その下の細胞体が露出するはずです。椎弓板のみをつかむように注意してくださいそうしないと、細胞体が網膜から剥がれる危険があります。

P 20パイプエマンを使用して、500マイクロリットルのチューブ内の400マイクロリットルのPBSトリトンに目を動かします。それらを4度で一晩静かに揺らして、翌日、光受容体から自己蛍光性の赤い色素を取り除きます。あなたは洗浄液を捨てて、椎弓板のない大人の目のライブイメージングのためにプライマリー誰でも追加することができます。

フェレットの成虫のハエのみを使用しており、これはeloの直前に後期のピュイです。この段階では、視細胞体は解剖中に椎弓板の末端から分離します。成体のピュイは、瞳孔ケースを通して見える明確な翼、目、およびキューティクルを持っています。

蛹を選択し、HL3に沈めます。瞳孔ケースの前部を取り外して、頭部を露出させます。さらに発育中のハエを囲んでいる薄い内膜を慎重に取り除きます。

鉗子で頭の付け根をつかんで引っ張ります。頭を水に浸したまま、残りの蛹を捨てます。fer rate 成体期の免疫組織化学のための眼の解剖で説明されているように進行します。

ただし、視細胞体は椎弓板からより簡単に分離するため、網膜に囲まれた細胞体を画像化できます。また、椎弓板は視葉に付着したままであるため、遠位椎弓板を画像化できます。視細胞末端カートリッジが見える近位椎弓板を画像化したい場合は、椎弓板が眼により強く付着している成虫のハエで眼郭清を行います。

瞳孔20%発育時のアイディスクの発育は、当研究室のライブイメージングで好評を博しています。なぜなら、この比較的大きな発生中の細胞の単層は、共焦点顕微鏡で容易に観察できるからです。20%の蛹を選択するには、瞳孔ケースの下に現れる緑色の斑点であるイアン細管を探し、20%の瞳孔の発達後に形成される暗い体を持つ蛹を避けます。

蛹を選んだら、解剖皿のHL 3に浸し、瞳孔嚢の前部を慎重に取り除きます。薄い内膜を貫通しないように注意してください。鉗子で内膜をつかみ、引き離します。

公開された内容物を注意深く検索して、非常に目立つ発達中の脳と目の椎間板を見つけます。解剖皿の底で脳を分離します。中心脳を視神経葉から慎重に分離します。

視ローブIディスク複合体は、ライブイメージングに使用されます。1つまたは2つの溶液で短時間だけイメージングしたい場合は、スライドガラスで組織をイメージングすることができます。この場合、まずメーカーの指示に従って表面をシルガードでコーティングしてスライドを準備します。

20マイクロリットルHL3を置きます。スライドの中央で、解剖した組織を追加で20マイクロリットルのHL 3でスライドに運びます。組織は絶対に空気にさらしてはいけません。

さらに、ピペットの取り扱いによるストレスやひずみを避ける必要があります。ライブイメージングでは、組織をしっかりと固定する必要があります。電気生理学的記録のために引っ張られるようなガラス電極を入手してください。

口元で発生する負圧を利用して先端を折って端をのり縫いのりで埋め、糊が入る程度の電極だけを折ってみて下さい。次に、正圧を使用して、HL 3をドロップしてシルガードに少量の接着剤を塗布します。次に、組織を接着剤にすばやくセットし、ライブイメージングの目的の向きを維持します。

水浸レンズを使用してイメージングできるようになりました。膜透過性染料を追加したい場合は、浴槽に加えることができます。長時間のイメージングや、溶液の完全または複数回の交換のためにイメージングを行う際には、蠕動ポンプに接続する灌流チャンバーを使用し、生組織上で培養液をゆっくりと観察します。

シルガードを一滴垂らして薄く平らに仕上げたカバースリップをご使用ください。20マイクロリットルHL3をカバーの中央に分配します。生きた組織を滑り込ませてシルガードに接着します。

生成 生組織を空気にさらすことなく、気泡がチャンバーを通過できるようにするガスケット。ガスケットは、組織が押しつぶされないように十分に厚くする必要がありますが、組織を共焦点顕微鏡レンズに近づけるのに十分な薄さにする必要があります。プロフュージョンチャンバーは、組織が常に完全に水没しないように注意しながら組み立てます。

したがって、溶液交換は毎分最大100マイクロリットルの速度で実行できます。時間スケールでのイメージングには、20種類のヒドロキシダイソンと抗生物質を追加する必要があるかもしれませんが、抗真菌剤は追加せず、毎分約10マイクロリットルのはるかに遅い速度で大量に増殖する必要があります。また、蠕動ポンプに供給する培地に酸素を泡

これで、ショウジョウバエの脳と網膜の解剖を成功させるために必要なすべてのスキルが身に付きました。また、生で発達している眼椎間板や成体の視細胞を画像化することもできます。だから、見てくれてありがとう、そしてあなたの実験に頑張ってください。