Name: 開発と大人の準備ショウジョウバエ脳と網膜 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-15T17:55:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: 学ぶショウジョウバエの脳と網膜の解剖法とライブイメージング技術。共焦点顕微鏡を用いて感光細胞の動態を観察し、神経生物学研究に応用する方法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、ウェルチ財団（I - 1657）とNIH（RO1EY18884）からの補助金によって支えられている。 PRHは、生物医学研究のユージンマクダーモットの学者である。

1。はじめこのビデオでは、我々は視細胞を中心としたライブイメージングと免疫組織化学のためにショウジョウバエの脳と網膜を準備する方法を説明します。最初に、我々は、脳の解剖のために準備する方法を示します。次に、我々はライブの準備のための基礎を形成する一般的な免疫組織化学に使用される2つの基本的な解剖のデモンストレーションを行います。これら二つの製剤は、成人の脳と眼の解剖です。次に、我々は、光受容体のライブイメージングのためのその使用法を重視した大人と脳の発達のライブイメージングに使用される解剖のデモンストレーションを行います。最後に、我々はどのようにイメージを生きている組織を説明し、共振共焦点顕微鏡を用いたライブイメージングのいくつかの例が表示されます。 2。解剖の準備<ol><li>良い解剖では、シャープなピンセットが必要です。両端が細かい点で交わるまで研ぎブロックまたは非常に細かいサンドペーパー（&gt; 1500）を使用して、軽く両側に前後に鉗子を渡します。我々は標準的な研ぎ石を使用してください。ここでは、シャープの技術をカバーし、しかし鋭い鉗子は、ライブ解剖のために不可欠であることに注意してくださいれません。我々はすべての解剖前にピンセットを研ぐ。 </li><li>成人の脳の解剖のために、それらを麻酔し、目的の遺伝子型を整理してCO 2のパッドの上にハエを置きます。蛹のケースを壊すように注意しながら、蛹の解剖のために、単純にバイアルに到達し、慎重にピンセットで蛹を削除します。 </li><li>水とキムワイプを湿らせ。あなたの鉗子からごみを削除するには、解剖時にこれを使用します。ステレオスコープのステージ上で解剖皿を置き、HL3溶液1で塗りつぶす。すべての解剖は、組織は、解剖の手順の間に生きていると健康なままであることを保証するためにHL3で行われます。また、我々は解剖時に鉗子を保護するためにSylgardのカバー底部を持っている解剖皿を使用してください。 </li><li>今、あなたが免疫組織化学を実行する予定がある場合は解決策を修正する準備。 500μLマイクロチューブにHL3の180μL場所。 3.7％ホルムアルデヒド溶液を得るために37％ホルムアルデヒドの20μLを追加。 </li><li>最後に、適切な手の位置は、良好な解剖のために重要です。良い手の位置で、あなたの鉗子は、着実かつ制御、微妙な動きが可能になります。最初に、親指の側に鉗子を置きます。その後、指の先端が上にかかっているようなまっすぐ下に人差し指をもたらす。今すぐあなたの中指の側面に鉗子の側面を休み、解剖皿に移動する。親指と中指で料理との物理的な接触を行う。皿に親指と中指を休んでいる間、顕微鏡ステージ上に手首を植える。この方法では、解剖時に表面にしっかりと三点を植え、それは、鉗子の非常に微妙な操作を行うことが可能になりました。このテクニックは、最初は少し抵抗を感じるかもしれないが、練習すれば、すぐに脳の解剖のマスターになります。 </li></ol> 3。成人脳<ol><li> CO 2パッドの上に、向きを大人は離れてあなたの手から頭と腹側を上に飛ぶ。ちょうど頭下胸部をつかむ。適切に行われれば、脚と口吻が長くなります。ステレオスコープの下に表示している状態で、頭を削除するには、鉗子で拡張口吻をつかむ。ボディと水没頭を捨てる。水中ヘッドに再び焦点を合わせる。全体の解剖は、ソリューションの下に実行されます。これは、常時鉗子で頭の上に保持するために非常に重要です。そうでなければ、頭が浮くと取得することは難しいでしょう。頭が解剖中にフォーカスの外に移動した場合、単に顕微鏡を調整することなく焦点面に戻すに移動します。この一見単純な作業では、最初は難しいかもしれませんが、焦点にあなたの頭を維持することは時間をかけて容易になるだろう。 </li><li>第一口先と眼の間に結合組織を引き裂くことによって解剖を始める。常に少なくとも一つの鉗子でしっかりと保持している間に目で涙。脳の下の損傷を防ぐために、鉗子のつま先は、網膜やキューティクルの直下のみであるかどうかを確認。左右交互に、頭の後ろに向かって作業し、網膜を離れて引き裂くために、ピンセットを使用してください。網膜を離れて引き裂くことはラミナがこの解剖を通して視葉にアタッチしたままになっている可能性が増加します。途中でキューティクルを引き裂く、頭部の背部のまわり続ける。他の目で涙、キューティクルを引き離し始める。あなたがキューティクルをつかんでている限り、あなたは脳を粉砕されていない知っているように！これを念頭に、脳が明らかにされるまでは離れてキューティクルと網膜を引っ張っていきます。 </li><li>脳が表示されていれば、あなたは、脳（図1A）に接続された気管を削除するために始めることができます。脳が特定されるまで気管とキューティクルにプルし続ける。この時点で、tのお皿の底に再び焦点を合わせる必要彼の残りの手順。あなたの脳がそうでなければ一晩抗​​体の洗​​浄中に浮かぶことがあるため、残りの気管を外します。光受容体端末のイメージングのための、それは板を保持することが望ましいですが、細胞体と強く自家蛍光顔料が含まれている網膜を、削除する必要があります。これを行うには、慎重に粘膜を損傷することなく、ふさふさと色素細胞の残骸で引っ張る。これは、細かいスキルであり、訓練が必要です。 </li><li>成人の脳は、我々は第6節で議論する条件を使用して数時間あるいは数日を保つ事が可能である。免疫組織化学のために、成人の脳は現在、ホルムアルデヒドで固定する準備が整いました。2は、すでに準備作業を行った固定液に成人の脳を移動するために5μLに設定P20 pipettemanを使用してください。 40から10の頭脳をもたらすすべき、20分間大人の脳を解剖し続ける。さらに40分の修正で脳を残す、しかし、この期間は最適な一次抗体染色によって異なる場合があります。ホルムアルデヒド溶液を除去し、以下、PBS -トリトンと呼ばれるPBS、0.4％TritonX - 100を含む溶液の400μLで各5分間3回脳を洗う。完全に修正液を洗浄した後、一次抗体溶液を追加することがあります。 </li></ol> 4。成人の目<ol><li>成人の脳で説明したようにこの解剖を始める。頭部を沈めると顕微鏡をリフォーカスした後、吻と眼の間に結合組織を引き裂くことから始めます。口先の上に、目からキューティクルを分離。今、頭の後ろに向かって作業し、目の裏側から表皮を分離。 one鉗子で、頭の後ろの中心をつかむ。他に、目をつかんで引っ張る。眼が（図1B）皿の底に沈降することができます。ラミナは、おそらくまだ目に添付され、この時点で完全に無傷の光受容細胞の端子のライブイメージングに使用することができます。光受容体の細胞体のライブイメージングを続行するには、セクション4.5に進んでください。次の3つのセクションでは、固定された目の免疫組織化学を説明する。 </li><li>免疫組織化学のために、5μLに設定P20 pipettemanを使用してソリューションを固定するために目を移動する。 10分の合計のために大人の目を解剖し続ける。さらに30分の修正で目にしておきます。修正液と、成体の脳の解剖で説明されている行為の洗浄を削除します。 </li><li>あなたが最終的に画像に目のommatidial構造を希望される場合ラミナが削除されている必要があります。あなたの解剖皿に固定された目を戻すと、まだ接続されているすべての気管や脂肪細胞を取り除く。次に、一方の鉗子と眼の外側を押しながら、他で板を取り外します。それはcellbodies下（図1B）を公開し、一体で外れるはず。唯一の薄板をつかむように注意してください！そうしないと、網膜から視細胞を切り離し危険性があります。 </li><li> P20のpipettemanを使用して、500uLチューブに400uL PBS -トリトンに目を移動する。静かに光受容体からの自家蛍光赤色色素を除去するために一晩4℃で、それらを揺すり。次の日、あなたは、洗浄溶液を破棄し、一次抗体溶液を追加することがあります。 </li><li>大人の目のライブイメージングのために我々は唯一のpharate大人のハエを使用して、間もなく羽化する前に後期のサナギ、すなわち。この段階では、解剖時の葉身の端末から別の光受容体の細胞体。 </li><li> Pharate大人蛹は蛹のケースを通して見える明確に定義された翼、目、そしてキューティクルを持っている。蛹を選択して、頭部を露出させる蛹の例前方部分を削除してください。慎重に、さらに発展フライを囲む薄い内膜を取り除く。あなたの鉗子とプルの頭のベースをつかむ。頭が水中に保ちながら蛹の残りを捨てる。 </li><li>免疫組織化学のための目の解剖で示すように進んでください。 pharate大人の段階では、しかし、光受容体の細胞体では、画像の網膜に囲まれた細胞体をできるように、薄板からより容易に分離させます。また、ラミナでは、画像の遠位薄板をできるように、視葉に接続されたままになります。あなたがイメージする光受容体端末のカートリッジを見ることができる近位ラミナを、ご希望の場合は、葉身はもっと強く眼に添付されている大人のその場で目の切開を行います。 </li></ol> 5。アイディスク脳の複合体を開発<ol><li>比較的大きな開発細胞のこの単層を容易に共焦点顕微鏡を用いて観測されているため、20パーセント蛹の開発（P +20％）で、発展途上の目のディスクは、私たちの研究室でのライブイメージングのためのお気に入りとなっている3。 </li><li> 20パーセント蛹を選択するには、マルピーギ管、蛹のケースの下に表示される緑色のスポットを探し、そして&quot;ダークボディ&quot;4を持ってそのサナギを避ける。あなたの解剖皿にHL3でP 20パーセント蛹、浸し、それを選択した後、慎重に慎重に、蛹の袋の前方部分を削除する薄い内膜を貫通しないように。あなたの鉗子と内膜をつかんで引き離す。 </li><li>慎重に（図1C）非常に顕著な発展途上の脳や目のディスクを見つけるためにリリースの内容全体を検索。アイディスク脳、複雑を簡単に変態のこの段階で分離されている。解剖皿の底に脳を隔離する。視葉から中央の脳を慎重に分離する。視葉/目のディスクは、ライブイメージングで使用されます。 </li></ol> 6。イメージングを生きる：顕微鏡で<ol><li>あなたが1つか2つしかソリューションの短期間のための画像を希望する場合は、スライドガラス上の画像あなたの組織が壊れる可能性があります。この場合、最初の塗料メーカーの指示を使用してSylgardと表面でスライドを準備。スライドの真ん中に20μLHL3を置きます。スライドにHL3のさらに20μLで切除した組織を輸送。組織は、空気にさらされることはありません必要があります。さらに、ピペットの取り扱いやソリューションの表面張力からの応力やひずみは避けなければならない。 </li><li>ライブイメージングのために、組織がしっかりと最小限の処理との接触で固定する必要があります。我々は安全に微小電極を介して適用水重合外科グルーGluShield、日常的に電気生理学5の胚の調製に用いられる手法を用いて脳の位置を決めます。電気生理学的記録のために引っ張られるようなガラス電極を取得します。先端を折りますとGluShieldが口の中で生成された負の空気圧を使用することに端を埋める。だけの十分な接着剤が入る可能性があることを電極の折ります。今HL3のドロップでSylgardに接着剤の少量を適用するために正圧を使用してください。今、すぐにライブイメージングのための望ましい方向を維持し、接着剤に組織を設定します。水浸レンズは、現在のイメージングに使用することができます。あなたが膜透過性の染料を追加する場合は、イメージングながらお風呂にそれを追加することができます。 </li><li>我々は、長時間にわたって撮影は6に減少する光退色と高速撮像を可能にする共振スキャニング共焦点顕微鏡を使用したり、完全に、または複数回ソリューションを交換するために、我々は、蠕動ポンプに接続する灌流チャンバー（ハーバードIC30共焦点イメージングチャンバー）を使用してくださいそれは徐々に生きている組織（図2A）上に培養液をperfuses。一定の液体の交換と最小限のGluShield接点の動きは時間7の長い期間にわたって観察されている組織のフラット化を減らす。発育期間のイメージングのための、目の円盤脳の複雑なが完全なままにして接着剤との最小限の接触を持つべきである必要があることに注意してください。 </li><li>それは薄くて平らなレンダリングするために剃毛されSylgardのドロップでコーティングされたカバースリップを使用してください。カバーガラスと接着剤Sylgardに生きている組織の中心に20μLHL3を分注する。泡が空気（図2B）に生きている組織を公開することなく、チャンバーを通過できるようになるガスケットを生成します。ガスケットは、組織が共焦点顕微鏡のレンズに近い組織を持って来るために十分な薄を押しつぶされることを回避するのに十分な厚さでなければなりません;我々は我々のセットアップで250μm使用。完全に常時水没組織をしないように注意して、灌流チャンバーを組み立てます。蠕動ポンプを使用して近く100μL分あたりの速度で最初に灌流を開始する。この速度は、チャンバーの高さを定義するガスケットの厚さに応じてかなり高速です。時間のスケールのイメージングでは、20 - ヒドロキシおよび抗生物質が、抗真菌ではないを追加し、毎分10μlを約はるかに低い速度で灌流を行う必要がある場合があります。灌流チャンバーを供給する培地中に最終的に、我々はバブルの酸素。 </li></ol> 7。代表的な結果： 私たちのビデオプロトコルの最後に5節で紹介した準備を用いて開発する視細胞のライブイメージングのための例を示します。この調製は、細胞特異的に蛍光レポーターを表現するためにショウジョウバエ遺伝子組み換えを利用しています。膜タグ付きmyrRFPとエンドソームのマーカー2xFYVE - GFP 9に示した例では、2つの蛍光レポーターは、光受容体特異的なGMR - Gal4のドライバ8の制御下で発現されています。 70x70x17.5μmと137x137x700nm（512x512x26）のボクセルサイズのバウンディングボックスを持つ2チャンネルの3Dデータセットごとに1分を得た。映画は、細胞内エンドソーム輸送や小胞融合のイベントのダイナミクスを明らかにこの4Dのデータセットの時間をかけて選択した面を示しています。目や粘膜の固定組織の準備のための代表画像を図に示します。 3。

<ol><li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li>
<li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li>
<li>Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+lobe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Optic lobe development.</a> Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+-+A+Laboratory+Handbook%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Drosophila - A Laboratory Handbook.</a> , Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69, 689-692 (2006).</li>
<li>Ayaz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li>
<li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87 (4), 651-660 (1996).</li>
<li>Wucherpfennig, T., Wilsch-Brauninger, M., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Drosophila+Rab5+during+endosomal+trafficking+at+the+synapse+and+evoked+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release.</a> J Cell Biol. 161, 609-624 (2003).</li>
<li>Merzlyak, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((monomeric+red+fluorescent+protein+with+an+extended+fluorescence+lifetime%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime.</a> Nat Methods. 4 (7), 555-557 (2007).</li>
<li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36 (3), 463-474 (2002).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Cooper, M. T., Bray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+regulation+of+Notch+signalling+polarizes+cell+fate+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Frizzled regulation of Notch signalling polarizes cell fate in the Drosophila eye.</a> Nature. 397 (6719), 526-530 (1999).</li>
<li>Cook, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+subtype+specification%3A+from+flies+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor subtype specification: from flies to humans.</a> Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).</li>
<li>Gurskaya, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaoptin%2C+a+cell+surface+glycoprotein+required+for+Drosophila+photoreceptor+cell+morphogenesis%2C+contains+a+repeat+motif+found+in+yeast+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human.</a> Cell. 52 (2), 291-301 (1988).</li>
<li>Richardt, A., Rybak, J., Stortkuhl, K. F., Meinertzhagen, I. A., Hovemann, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebony+protein+in+the+Drosophila+nervous+system%3A+optic+neuropile+expression+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ebony protein in the Drosophila nervous system: optic neuropile expression in glial cells.</a> J Comp Neurol. 452 (1), 93-102 (2002).</li>
<li>Beronja, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+function+of+Drosophila+Sec6+in+apical+exocytosis+of+epithelial+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Essential function of Drosophila Sec6 in apical exocytosis of epithelial photoreceptor cells.</a> J Cell Biol. 169 (4), 635-646 (2005).</li>
<li>Mehta, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Drosophila+sec15+reveal+a+function+in+neuronal+targeting+for+a+subset+of+exocyst+components%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in Drosophila sec15 reveal a function in neuronal targeting for a subset of exocyst components.</a> Neuron. 46 (2), 219-232 (2005).</li>
</ol>

イメージングのために使用する蛍光プローブここでは、3つのクラスからの蛍光プローブの選択のためのショウジョウバエの視覚システムの準備の長所と短所を説明します。外因性に生きている組織の準備に追加される（1）プローブ、遺伝的にライブとの両方でエンコードされている（2）蛍光タンパク質固定イメージング、免疫組織化学のための固定された組織に追加される（3）蛍光色素。 1。外因性のプローブ： LysotrackerグリーンDND - 26またはDND - 99レッド （インビトロジェン社）これらは、蛍光膜透過性の最も顕著に細胞、リソソームに強く酸性化のコンパートメントに蓄積する化合物、後期エンドソーム、およびオートファゴソーム市販されている。ナノモル濃度でLysotrackerは（我々は典型的には50 nmを使用して）1分以内に完全にL3とP +20％目のディスクを貫通している。 Lysotrackerは、継続的に蓄積し、5分未満でアルカリ化効果が、我々のイメージを発揮するので。目のディスクとは対照的に、Lysotrackerは組織を中断することなく、脳に浸透していません。しかし、外膜の涙慎重には、視葉内の少数の細胞の直径の浸透が可能になります。 Lysotrackerとは対照的にLysosensor DND - 189（インビトロジェン社）、Lysosensorは酸性コンパートメントに蓄積していませんが、展示物は酸性pHでの蛍光の増加。 LysosensorはLysotrackerと非常に似ている浸透特性があります。我々は、1μMの濃度でLysosensorを使用してください。 2。遺伝的に符号化されたプローブ： 多くのライブイメージング実験のために、我々はバイナリGal4/UAS発現システム12の制御下にGFP、TagRFP 10またはpH感受性pHluorin 11など、様々な蛍光分子でタグ付けされた遺伝子を発現する。光受容体の開発に表現するGAL4 -ラインはGMR - Gal4の（すべての光受容体）8とmDelta0.5 - Gal4の（R4とR7を開発する）13が含まれています。いくつかの亜型特異的なGAL4 -ドライバの行は、その使用、異なるロドプシンのプロモーター14が存在する。ライブイメージングで特に有用な蛍光プローブがphotoconvertible蛋白質である。我々は成功Dendra2、単量体、緑色から赤色photoconvertable蛋白質15を使用している。 Dendra2が488nmのアルゴンレーザーのラインを使用してphotoconvertibleなるように設計されていることに注意してください。しかし、我々は、従来のまたは共振どちら走査型共焦点モードで私たちのセットアップを使用して可視青色光を使用して変換を達成することはできません。対照的に、405nmのUVレーザとの変換が効率的です。 3。免疫組織化学： 固定成人の目には、私たちはしばしばrhabdomeric構造（図1A）を可視化するローダミンファロイジン（インビトロジェン社）または抗Chaoptin（光受容体特異的な抗体16）のいずれかを選択します。ラミナカートリッジの構造を分析するための良い方法は、抗chaoptin 16、グリアマーカー抗黒檀17、および抗SEC6 18（図1B）に結合することです。図に示す。 3、抗体のこの組み合わせは、大きなシナプス（chaoptin）とシナプス後部（SEC6）のプロセスだけでなく、薄板19の上皮グリア（黒檀）を区別する。 灌流チャンバーの組み立てライブイメージングのために、我々は、組織の準備を妨げることなく、ソリューションの遅い交換を可能にする灌流チャンバーを採用。灌流チャンバアセンブリのデモは、ビデオに含まれており、模式的に図2に示します。灌流チャンバーの組立は、図5に示す。 2A。第一標本上のガスケットを敷設することから始めます、と示すように、アセンブリに進んでください。ガスケットの目的は、チャンバーの底と蓋、組織がシールされており、これによってソリューションが流れるの内部空間との間のスペースを作成することです。ガスケットの内側のスペースは、入口（解決策がここに入る）、組織の準備、およびソリューションは、チャンバを離れるに経由するコンセントを含める必要があります。ガスケットの2つの機能が重要です：まず、ガスケットはまだ高解像度レンズと撮像を可能にするのに十分に薄い脳のための十分な厚さでなければなりません。理想的なガスケットの厚さは、セットアップ固有のパラメータに依存します。第二に、ガスケットの切り込みが、バブルが試料（図2B）に問い合わせることなく通過できるようにするコンパートメントを提供します。 顕微鏡でのイメージング我々は、直接スライド上の培養液中に灌流チャンバーまたは63xの水浸レンズ用63x（絞り1.3）グリセリン浸レンズを使用してください。グリセリンレンズは、油のレンズよりも多くの作動距離を提供します。我々は、従来のスキャナ（8000 Hzの対1400 Hzの、それぞれ）よりもはるかに速い速度でスキャン共鳴走査共焦点顕微鏡を使用してください。共鳴スキャンは高速で時間をかけて3次元記録を可能に二のフレームレート。さらに、より高速なスキャン速度が大幅に生きている組織の繰り返しスキャンするための主要な関心事であるレーザー光毒性6を減少させる。レーザー強度とPMT電圧（ゲイン）のバランスはノイズを最小限にし、退色しながら信号を最大にするために達成されなければならない。重要な今後の検討は、特定の地域でのレーザーの影響の量は解像度とズームによって決定されることである。例えば、選択の領域は512 × 512、ズーム1倍時のような256 × 256、ズーム2倍で同じ解像度でスキャンされ、まだ最大限に可能な限りのライブイメージング速度は、256 × 256でズーム2倍4倍高速です。 8000 Hzと2倍の行の平均のスキャン速度で10秒ごとにZ -スタックの速度でZ -スタックあたり5コマ：迅速に細胞内区画の移動の操作を記録するために、我々が正常に以下の設定で記録されている。時間のスケールで長いイメージングセッションでは、我々は多くの場合数分ごとに1つにフレームレートを削減し、準備がシフトする可能性が高いとして、より大きな領域を選択してください。 ショウジョウバエ視覚系の解剖学図3は、 ショウジョウバエの成体の眼（図3A）、成人の脳（図3B）、および20〜25％蛹のアイディスク/脳の複雑な（図3C）の解剖学的構造を示しています。図3Aは、とや粘膜と接続されている脂肪細胞なしの両方大人の目を示しています。大人の目の解剖時には、光受容体の細胞体（左）によって形成されたボールに囲まれたアイの中央にある板は、、（右）の下に細胞体を中断せずに削除する必要があります。成人の脳の解剖のために、人は光受容体の細胞体、板、視葉、中央の脳、および気管（図3B）を区別することができるはずです。視葉に添付されたラミナを残しながら、光受容体と気管は、この解剖のために削除する必要があります。 20から25パーセント蛹のアイディスク/脳、複雑なの同定に役立つように、ライブイメージは、図3Cに示されている。 <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="脳、視葉、細胞体を示す神経解剖学図。薄板、光受容体の解剖。" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図1"> 図1（A）成体の脳。 （B）大人の目。 （C）20％-25％蛹eye-disc/brain複合体。 <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="試料の流れ、対物レンズ、入口、出口、ポンプ、ガスケット、ベースを含むマイクロ流体セットアップ図。" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図2"> 図2（A）潅流チャンバーの組立と試験片の相対的な（B）ガスケットの位置決め。 <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="蛍光顕微鏡画像;細胞構造、緑/赤マーカー、実験的比較。" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図3"> 図3（）抗chaoptin使用して大人感桿分体染色。抗chaoptin（緑、光受容体）、抗黒檀（赤、グリア）、およびSEC6（青、介在ニューロン）を使用して、（B）アダルトラミナ染色。

特別な機器： <ol><li>解剖の範囲：デジタルカメラでライカMz12.5 </li><li>従来と共振スキャンのためのライカTCS SP5共焦点タンデムスキャナ顕微鏡は、住んでいる 青色（488nmの）、緑（561nm）、橙（594nm）と遠赤色（633nm）レーザーだけでなく、特殊な63x、1.4グリセリンと63x、1.3水浸レンズを含むイメージング顕微鏡、。 </li><li>ハーバードインスツルメンツ共焦点イメージングチャンバーRC - 30と蠕動ポンプのモデル720 </li><li>サターピペットプラーP - 97 </li><li>ソフトウェア：アミラ5.2、ヴィサージのイメージング</li></ol>

開発と大人の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>脳と網膜

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

市販<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;脳と視覚系が広くニューロンの発達、機能と変性を研究するモデルシステムを利用している。ここでは、3つの脳の準備と開発蛹の開発アイディスク、脳の複雑なから大人のハエから個々の眼と脳の解剖の範囲をカバーする視覚システムを示す。すべてのプロトコルは準備のライブ文化のために最適化されています。しかし、我々はまた、該当する固定組織の免疫組織化学のための条件を提示する。最後に、我々は、灌流チャンバ内に、従来と共振4D共焦点ライブイメージングを使用して、これらの製剤のためのライブイメージングの条件を示しています。一緒に、これらのプロトコルは、分の規模で機能的な細胞内アッセイから何時間もの規模で発達や変性過程に至るまで、さまざまな時間スケールでのライブイメージングの基礎を提供する。

このプロトコルは、次の3つについて説明します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;準備：目のディスク脳の複合体の解離を開発し1）成人の脳の解剖、2）成人の網膜の解剖、3）。すべての準備が固定組織の免疫組織化学のために使用することができますが重点は、特殊な調製技術とライブイメージングのための条件に置かれている。

ショウジョウバエ（Drosophila）の脳および視覚系は、ニューロンの発達、機能、および変性を研究するためのモデルシステムとして広く利用されています。本稿では、3つの...

皆さん、こんにちは。このビデオでは、光受容細胞に焦点を当て、ライブイメージングおよび免疫組織化学のための脳と網膜の標本調製方法を実演します。まず、脳の解剖に向けた準備方法を説明します。その後、成体脳、成体網膜、および発達中の眼という3種類の異なる解剖操作を実演します。これらの各試料について、免疫組織化学染色のために組織を固定するか、あるいは生体イメージングを行います。最後に、生体組織のイメージング方法について説明し、共焦点共鳴走査顕微鏡を用いたライブイメージングの例をいくつか紹介します。それでは始めましょう。良好な切片を作成するには、鋭利なピンセットが必要です。研磨ブロックまたは非常に細かいサンドペーパーを使用して、ピンセットの両側を先端が合うまでゆっくりと往復させて研ぎます。より鋭い先端が必要な場合は、標準的な砥石を使用します。ここでは研磨技術については説明しませんが、生体解剖においてピンセットの鋭さは不可欠であると言えます。成体脳の解剖では、毎日ピンセットを研いでいます。ショウジョウバエをCO2パッドの上に置いて麻酔させ、目的のジェノタイプを選別します。瞳孔の解剖を行う際は、バイアルの中にピンセットを入れ、瞳孔ケースを破損させないよう注意しながら、瞳孔を慎重に取り出します。キムワイプを丸めて水で湿らせておきます。これは解剖中にピンセットに付着した不要物を除去するために使用します。解剖皿を実体顕微鏡のステージに置き、HL3溶液を満たします。解剖の手順中に組織が生きて健康な状態に保たれるよう、すべての解剖はHL3溶液中で行います。また、解剖中にピンセットを保護するため、底部にSylgardをコーティングした解剖皿を使用することをお勧めします。次に、固定液を調製します。免疫組織化学染色を行う予定の場合は、500 µLマイクロ遠心チューブに HL three を 180 µL 分注してください。3.7% ホルムアルデヒド溶液にするために、37% ホルムアルデヒドを 20 µL 加えます。最後に、良好な解剖を行うには、適切な手の位置が重要です。手の位置が適切であれば、ピンセットが安定し、制御された微細な動きが可能になります。まず、ピンセットを親指の横に置きます。次に、人差し指をまっすぐ下ろし、指先をピンセットの上に乗せます。次に、ピンセットの側面を中指の横に添え、解剖皿へ移動させます。親指と中指を解剖皿に置いた状態で、親指と中指で皿に接触させて固定します。手首を顕微鏡ステージに固定します。このようにしてください。解剖中に3つの接点を表面にしっかりと固定することで、ピンセットで非常に微細な操作を行うことが可能になります。CO2パッドの上で、成虫のハエを腹側が上に、頭部が手から離れる方向になるように向けます。頭部のすぐ下の胸部をつかみます。適切に行えば、実体顕微鏡下で観察している間に脚と口吻が伸展します。ピンセットで伸展した口吻をつかんで頭部を切り離し、体部は廃棄して頭部を溶液中に沈めます。溶液中の頭部に焦点を合わせ直してください。解剖の全工程は溶液中で行います。常にピンセットで頭部をしっかりと保持することが非常に重要です。そうしないと、頭部が浮いてしまいます。また、一度浮いた頭部を回収するのは常に困難であることに留意してください。解剖中に頭部がフォーカスから外れた場合は、顕微鏡を調整せずに、単に頭部を焦点面に移動させてください。この操作は一見簡単そうですが、最初は難しいかもしれません。しかし、時間をかければ頭部のフォーカスを維持することは容易になります。まず、口吻と目の間の結合組織を切り裂くことから解剖を開始してください。常に少なくとも1本のピンセットでしっかりと固定しながら、眼を裂きます。ピンセットの先端が網膜または角膜の直下に位置していることを確認してください。下にある脳を損傷させないよう、左右交互に操作します。ピンセットを用いて、頭部の後方に向かって網膜を剥がします。網膜を剥がすことで、ラミナが視葉に付着したままになる可能性が高まります。この解剖の間、頭部の後方へと進みながら、途中の角質を剥がし、もう一方の目も同様に剥がして、角質を取り除き始めます。角皮を掴んでいる限り、脳を潰することはありません。この点に留意しながら、脳が露出するまで角皮と網膜を引き離し続けます。脳が見えたら、脳に付着している気管の除去を開始し、脳が単離されるまで気管と角皮を引き離し続けてください。ここまでの操作が終わったら、光受容体末端のイメージングに向けた残りのステップのため、ディッシュの底部に焦点を合わせ直してください。ラミナは保持することが望ましいですが、細胞体と強い自家蛍光を持つ色素を含む網膜は除去する必要があります。そのためには、ラミナを傷つけないように注意しながら、茂った細胞体の残骸を慎重に引き離してください。これはより繊細な技術であり、練習が必要です。残りの気管を除去します。抗体のオーバーナイト洗浄中に脳が浮いてしまう可能性があるため、セクション7で説明する条件を用いることで、成体脳を数時間、あるいは一晩生存させたまま保持することができます。免疫組織化学染色のために、これで成体脳をホルムアルデヒドで固定する準備が整いました。5 µLに設定したP 20ピペットを使用して、成体脳をあらかじめ調製した固定液に移動させます。成体脳の解剖を20分間続け、4〜10個の脳を回収します。その後、脳を固定液に残し、さらに40分間固定します。ただし、この時間は変動する場合があります。一次抗体染色の最適化のため、ホルムアルデヒド溶液を除去し、PBSおよび0.4% TRITON X 100を含む溶液（以下、PBS Tritonと表記）400 µLを用いて、脳を5分間ずつ3回洗浄します。固定液を完全に洗い流した後、一次抗体溶液を添加してください。この解剖は、成体脳の手法に従って開始します。頭部を浸漬させ、顕微鏡の焦点を合わせ直した後、まず口器の上方にある口器と眼の間の結合組織を裂きます。眼から角質層を分離します。次に、1本のピンセットを用いて、眼の下側から頭部後方に向かって角質層を分離します。この解剖では、頭部の後方中央を掴みます。もう一方のピンセットで脳を潰しても構いません。眼を掴んで引き離します。眼球をディッシュの底に静置させます。ラミナ（sieve plate）は依然として眼球に付着している可能性が高く、完全に無傷の光受容細胞から光受容体末端のライブイメージングを行う際に利用できます。次の3つのセクションでは、免疫組織化学に向けた眼球の調製方法について説明します。免疫組織化学染色のために、眼を固定液に移します。5 µLに設定したP20ピペットを使用し、さらに合計10分間、成体の眼の解剖を続けます。その後、眼をさらに30分間固定します。固定液を除去し、「成体脳の解剖」で説明した通りに洗浄を行います。最終的に眼の物質的な構造をイメージングしたい場合は、それらを除去する必要があります。次に、固定した眼を解剖皿に戻し、まだ付着している気管や脂肪細胞を除去します。次に、片方のピンセットで眼球の外側を固定しながら、もう一方のピンセットでラミナ（層板）を取り除きます。ラミナは一枚の状態で剥がれ、その下の細胞体が露出するはずです。ラミナのみを掴むように注意してください。さもないと、細胞体が網膜から剥離してしまう恐れがあります。P20ピペットを用いて、眼を500 µLチューブに入れた400 µLのPBS Tritonに移動させます。4°Cで一晩緩やかに揺らし、光受容体から自家蛍光を発する赤色色素を除去します。翌日、洗浄液を廃棄し、ラミナを除去した成体眼のライブイメージング用の一次抗体を添加します。私たちは、羽化直前の後期パパ（pupa）であるフェレット成虫のみを使用します。この段階では、解剖中にラミナ（lamina）において光受容細胞体と末端部が分離します。成虫のパパは、蛹皮を通して確認できる、明確な形態の翅、目、および角皮を有しています。蛹を1匹選び、HL threeに浸します。頭部領域を露出させるため、蛹殻の前端部分を取り除きます。発生中のハエをさらに包んでいる薄い内膜を注意深く取り除きます。ピンセットで頭部の基部を掴んで引き抜きます。頭部を浸したまま、蛹の残りの部分は廃棄してください。その後は、成体期の免疫組織化学用眼球解剖の手順に従って進めてください。しかしながら、光受容細胞の細胞体はラミナからより容易に剥離するため、網膜に位置する細胞体をイメージングすることが可能になります。また、ラミナは視葉に付着したままとなるため、遠位ラミナのイメージングが可能です。光受容細胞の末端カートリッジが観察できる近位ラミナをイメージングしたい場合は、ラミナが眼により強固に付着している成虫を用いて眼の解剖を行ってください。瞳孔発達20%段階の発達中の眼視盤は、共焦点顕微鏡で比較的大きな発達細胞の単層を容易に観察できるため、当研究室でライブイメージングに好んで用いられています。20%蛹を選択するには、瞳孔ケースの下に現れる緑色の点であるIan管を探し、20%瞳孔発達後に形成される黒い体を持つ蛹を避けてください。蛹を選択した後、解剖皿に入れたHL3に浸し、蛹の袋の前部を注意深く取り除きます。この際、薄い内膜を突き破らないように注意してください。ピンセットで内膜を掴み、引き離します。放出された内容物を注意深く探索し、非常に顕著である発達中の脳と眼原盤を探します。解剖皿の底部にある脳を単離します。中央脳を視葉から慎重に分離します。視葉I盤複合体を用いてライブイメージングを行います。1つまたは2つの溶液のみで短期間のイメージングを行う場合は、ガラススライド上で組織をイメージングしても構いません。その場合は、メーカーの指示に従って表面にSylgardをコーティングし、スライドを準備してください。スライドの中央にHL threeを20 µL滴下します。さらに20 µLのHL threeに入れた解離組織をスライド上へ移動させます。組織が空気にさらされないように注意してください。さらに、ピペット操作によるストレスや負荷を避けなければなりません。ライブイメージングを行う際は、組織をしっかりと固定する必要があります。電生理学的記録用に作成されたものと同様のガラス電極を用意してください。チップを折り曲げ、口で発生させた陰圧を用いて端をグルースティッチで充填します。接着剤が入る分だけ電極を折り曲げてください。次に、陽圧を用いて、HL 3の滴の下にあるシルガードに少量の接着剤を塗布します。その後、ライブイメージングに最適な方向を維持しながら、迅速に組織を接着剤の上に設置します。これで、水浸レンズを使用してイメージングを行うことができます。膜透過性染料を添加したい場合は、バスに加えてください。長時間のイメージングを行う場合や、溶液を完全に、あるいは複数回交換したい場合は、ペリスタポンプに接続し、生存組織上に培養液をゆっくりと灌流させる灌流チャンバーを使用します。Sylgardを1滴滴下し、薄く平坦になるまで削ったカバーガラスを使用します。カバーの中央にHL threeを20 µL分注します。生体組織をSylgardの上に滑らせて接着させます。生体組織を空気にさらすことなく、チャンバー内を気泡が通過できるようにガスケットを作成します。ガスケットは、組織を圧迫しない十分な厚みを持ちつつ、共焦点顕微鏡のレンズに組織を近づけられる十分な薄さにする必要があります。組織が常に完全に浸漬された状態を維持するように注意しながら、灌流チャンバーを組み立てます。したがって、溶液交換は最大100 µL/minの速度で行うことができます。数時間スケールのイメージングを行う場合は、20 hydroxy Dysonと抗生物質（抗真菌剤は除く）を添加する必要があるかもしれません。その際は、10 µL/min付近のかなり低速で灌流を行ってください。また、ペリスタルティックポンプに供給する培地には、酸素をバブリングします。これで、ショウジョウバエの脳と網膜を正常に解剖するために必要なスキルをすべて習得しました。また、発達中の眼原基や成体の光受容細胞のライブイメージングを行うことも可能です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしています。

preparation-developing-adult-drosophila-brains-retinae-for-live

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、GFPタグ付きのグリア細胞とペアライブ顕微鏡分析を使用して開発をショウジョウバエの眼にグリア細胞の遊走を調べるためのプロトコルについて説明します。...

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

ライブイメージング解析のためのショウジョウバエの胚を作製する、シンプルで安価な、そして効果的な方法が提示される。我々のプロトコルは、湿度およびガス交換を提供し、ショウジョウバエの胚を圧縮しません。このメソッドは、実体顕微鏡や正立複合顕微鏡を用いてショウジョウバエの胚のGFPベースのライブイメージングに適しています。...

の調製ショウジョウバエ</emハンギングドロッププロトコルを使用してライブイメージングのための>胚

成人を準備するために標準的なアプローチ...

大人の準備ショウジョウバエ</emシンセクショニングおよび顕微鏡分析のための>アイズ

個々の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>エッグチェンバース

このビデオでは、成虫のハエの無傷の脳をブリッジスライドの下に埋込む方法を説明し、蛍光顕微鏡法のために免疫染色された脳に対して行われるプロトコールを示しています。...

成虫ショウジョウバエの脳のマウント:共焦点イメージング用のスライドを準備する方法

ソース: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp.

蛍光顕微鏡法を用いたショウジョウバエの蛹眼のライブイメージング

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

このプロトコルは、生きたショウジョウバエの蛹の眼神経上皮をイメージングするための効率的な方法を提供します。この方法は、組織の動きと不均一なトポロジーを補正し、複数のGFPタグ付き接合タンパク質を使用して細胞境界の視覚化を強化し、簡単に組み立てられるイメージングリグを使用します。...

のライブイメージングショウジョウバエ蛹アイ

このプロトコルは、イメージングのために幼虫および成虫の ショウジョウバエ...

視葉可視化のためのショ ウジョウバエ の幼虫および成虫の脳の解剖、免疫組織化学、およびマウント

ここで提示されるプロトコルは、プレートベースの高含有画像を使用して胚発生時に複数 のショウジョウバエ...

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

行動中および刺激に反応して、成人 ショウジョウバエ...

行動と刺激反応の間に全脳イメージングのための成人ショ ウジョウバエメラノガスター を準備する

学ぶショウジョウバエの脳と網膜の解剖法とライブイメージング技術。共焦点顕微鏡を用いて感光細胞の動態を観察し、神経生物学研究に応用する方法を解説します。

開発と大人の準備ショウジョウバエ脳と網膜

さらに動画を探す