母親の遺伝子産物の機能操作の使用インビトロ卵成熟

このプロトコルの全体的な目標は、ゼブラフィッシュの卵子のin vitro成熟を実施し、必要に応じて、受精前に母体の遺伝子産物を機能的に操作することです。この方法は、発生生物学の分野における重要な疑問、つまり胚に対する母体の寄与の重要性に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、卵子を試験管内で培養し、その後、受精して生存可能な胚を生産できることです。

また、必要に応じて、受精直後に初期胚で作用する母体遺伝子産物の機能操作を可能にします。まず、in vitro培養操作の8〜10日前に、フィッシュネットを使用して、目的の系統の1匹の雄と1匹の雌の魚の複数のセットを交配水槽に移します。それらを交配タンクに一晩置いておきます。

魚が次の午後まで交尾するのを許した後、フィッシュネットを使用して、交尾中に卵を産む雌を分離し、それらを別のタンクに入れます。これらの女性に、ほぼ同量のブラインシュリンプと魚のフードフレークを含む食品混合物で1日2回給餌します。無菌条件下で、50ミリリットルのコニカルチューブに20ミリリットルのLeibovitzのL-15メディウムとl-グルタミンPH7.0を加えます。

次に、10 Normal水酸化ナトリウムを使用してPH 9.0にします。L-15ミディアムの9ミリリットルを2本の別々の50ミリリットルの円錐形チューブに追加します。次に、1つのチューブにDHPともう1つのDHPをラベル付けします。

DHPチューブに、10マイクロリットルのDHP、490マイクロリットルのDH2O、500マイクロリットルの10%BSAを追加します。DHPチューブに、100マイクロリットルあたり10ミリグラム/ミリリットルのゲンタマイシン、400マイクロリットルのDH2O、および500マイクロリットルの10%BSAを追加します。.卵母細胞の解剖を行うには、まずDH2Oに0.2%トリカインストック溶液を調製し、1モルトリスPH 9.0でPH 7.0に緩衝します。

この溶液を摂氏4度に保ちます。施設内の毎日の光サイクルが終了する0〜4時間前に、250ミリリットルのビーカーで、20ミリリットルの0.2%トリカインストック溶液PH7.0を80ミリリットルの魚水に加えて混ぜます。魚が慣れ親しんでいる一日の終わりの光サイクルから4時間以内に手順を開始することが重要です。

そうしないと、卵子は適切に成熟しません。スプーンを使用して、安楽死させた魚をトリカイン溶液から集め、魚の水で短時間すすぎます。次に、魚をペーパータオルの上に置いて余分な水分を吸収します。

きれいなカミソリの刃を使用して、安楽死した魚を胸鰭のレベルで斬首します。次に、解剖ハサミを使用して、魚の腹側に縦方向に切開し、前端から肛門領域まで延長します。魚をペトリ皿に置き、入射光のある解剖顕微鏡で

次に、一対の解剖鉗子を使用して卵巣部分を分離し、組織を4ミリリットルのLeibovitzのL-15 Meidum、DHPを含む35 x 10ミリメートルの培養皿に移します。次に、解剖鉗子を使用して、卵母細胞を卵胞腫瘤から穏やかに解離します。初期段階の4つの卵子を選別します。これらの卵子は、最大サイズに近く、暗く不透明な細胞質と、卵子内に非対称に位置する容易に見える胚小胞(GV)を特徴とします。

早い段階で卵子を捨て、半透明の成熟したステージ5の卵子を捨てます。ガラス製の牧草地ピペットを使用して、初期段階の4つの卵子を、4ミリリットルのLeibovitzのL-15培地とDHPを含む2番目の35 x 10ミリメートルのプラスチック培養皿に移します。最小限の量のマイナスDHP培地を、プラスDHP溶液を含む皿に移します。

mRNAを注入する場合は、注入の直前に、RNAグレードの逆浸透水と0.2モルの塩化カリウムを使用して、mRNAを0.1モルの塩化カリウムの最終溶液に希釈します。注入の直前にモルフォリノス(MO)を注入する場合は、RNAグレードの逆浸透水と0.2モルの塩化カリウムを使用してMOを所望の濃度に希釈し、最終濃度の0.1モルの塩化カリウムを達成します。その後、細い鉗子で卵子を手動で保持し、引っ張ったガラスキャピラリーピペットで作った針を用いて、野生型のステージ4の卵子に約1ナノリットルを注入します。

未熟で注入した卵子をDHP培地で摂氏26.5度でインキュベートし続けます。約30分ごとにチェックして、卵子が無傷のままで、徐々に半透明になることにより適切に成熟していることを確認します。牧草地のピペットを使用して、溶解している卵子をすべて取り除きます。

そして、培地の品質を維持するために、それらを実験室の廃棄物ビーカーに捨てます。新鮮なDHP培地の約半分の量で、卵子溶解の量に応じて、培養培地を交換して透明な溶液を維持します。卵子の大部分が半透明になり、GVが明らかでなくなった場合は、極細鉗子を使用して、卵子と膜の間のスペースが増加した領域の卵胞膜に裂け目を作ります。

メンブレンの一部を剥がし、剥がした部分を押さえながら、卵子をメンブレンから転がします。もう一つの重要なステップは、卵胞膜の除去です。この層が完全に除去されていないと、施肥と絨毛膜の拡大が妨げられます。

脱毛した卵子を最小限の培地で、数滴の培養DHP培地を入れたシャーレに移し、受精に進みます。卵子の成熟ステップの終わり近く、脱卵の前に、500マイクロリットルのハンク液中の5人の雄の精巣を使用して精子溶液を調製します。DHP培地中の脱毛卵母細胞に10〜50マイクロリットルの精子溶液を加えます。

その後、10 秒待ちます。ピペットを使用して、卵母細胞にE3培地を数滴加えます。1分待ってから、E3ミディアムを使用してプレートをフラッディングします。

受精した胚を発育させた後、透過光光学系を備えた解剖顕微鏡を使用して、受精段階の進行を観察し、受精と病期分類について前述したように、受精が成功するようにします。GFPの発現からわかるように、in vitro培養で得られた卵子は、卵子の発生全体を通じて、わずか2時間で外因性mRNAからタンパク質を産生することができます。しかし、卵形成のステージ4で培養条件を開始した卵子だけが、成熟したステージ5の卵子に成長することができます。

この実験では、野生型オーロラB mRNAを注入することで、対応する遺伝子である細胞島における突然変異の表現型への影響を救済します。対照群からの胚も、対応する突然変異表現型を示すために発達することが許されます。翻訳ブロッキングモルフォリノの注入は、lrmp−MOの卵子への注射によって示されるように、既知の変異表現型を成功裏に表現コピーすることができ、これは、対応する突然変異の無益なサイクルの変異体表現型を模倣する。

mRNAコードを野生型または変異型の卵子に注入して、初期胚内の対応する産物を視覚化することもできます。例えば、ここに見られるように、Sass6-mCherryタンパク質は、中心体マーカーであるGammaチューブリンによって標識された病巣に局在します。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、約5〜6時間で完了します。

この手順を試みるときは、手順を急がないように、脱葉と受精の前に卵子の適切な成熟を可能にすることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、追加の質問に答えるために、胚の固定などの他の方法を実行できます。例えば、目的の遺伝子のレスキューや、RNAやタンパク質の局在化などです。

開発後、この技術は、初期胚発生の分野の研究者がゼブラフィッシュの母体遺伝子産物の寄与を探求する道を開きました。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの卵子のin vitro成熟を通じて母性遺伝子産物を機能的に操作する方法を十分に理解できるはずです。