共免疫沈降により核および細胞質画分中のタンパク質間相互作用の可視化とその場で近接ライゲーションアッセイ

この実験の全体的な目標は、異なる細胞コンパートメント内のタンパク質タンパク質相互作用を視覚化する際の共免疫沈降法(co-ip)と近接ライゲーションアッセイ(pla)の長所と短所を比較することです。ここで紹介した2つの異なる方法の比較は、科学者が細胞の核と細胞質内のタンパク質タンパク質相互作用の分布パターンを調査する際に、どちらが特定の目的に適しているかを判断するのに役立ちます。co-ipの主な利点は、真正なタンパク質タンパク質相互作用を検出できることです。

対照的に、plaの利点は、研究所のタンパク質相互作用を単一細胞レベルで迅速に解析できることです。テキストプロトコルに従ってhex293細胞を増殖させ、収穫した後、6番目の細胞に3×10に、冷たい細胞質抽出液の300マイクロリットルを追加し、15秒間最高速度で細胞をボルテックスします。抽出物を氷上で30分間インキュベートし、インキュベーション中は10分ごとにサンプルを5秒間ボルテックスします。

次に、16.5マイクロリットルの冷たい細胞質抽出溶液を加え、5秒間ボルテックスし、サンプルを氷上で5分間インキュベートします。抽出物を5秒間ボルテックスし、サンプルを16,000 x gおよび摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を新しい予冷チューブに移し、使用するまで氷上に置いてから、1ミリリットルの冷たいPBSを使用して、ピペッティングを上下に行い、各洗浄後にPBSを除去して不溶性ペレットを3回洗浄します。

次に、150マイクロリットルの冷核抽出溶液を加え、15秒間ボルテックスし、氷上で1時間インキュベートします。インキュベーション中は10分ごとにサンプルを15秒間ボルテックスし、200マイクロリットルのチップを使用して溶液を10回ピペットで披露します。チューブを15秒間ボルテックスし、サンプルを摂氏4度で10分間16, 000 x gで遠心分離し、核抽出物を含む上清を新しい予冷チューブに移し、使用まで氷上に保ちます。

核抽出物と細胞質抽出物の各容量をインプットとして10%ずつ取り出し、残りの抽出物に冷たいPBSを添加して最終容量1ミリリットルにします。使用するまで氷の上に置いてください。必要に応じてプロテインg標識磁気ビーズをプレクリアした後、40マイクロリットルのタンパク質g標識磁気ビーズを4マイクログラムの迅速ポリクローナル抗RBM3抗体、または200マイクロリットルのPBSTのネガティブコントロールとして迅速IGGと組み合わせます。

ローテーラーで室温まで40分間インキュベートします。チューブを磁気ラックに置き、スーパーナテントを取り外して廃棄します。次に、200マイクロリットルのPBSTで、ビーズを一度洗います。

1ミリリットルの希釈リセートをビーズに加え、ローテーター上で摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、チューブを磁気ラックに置き、スーパーナテントを吸引します。ビーズに0.5ミリリットルのPBSTを加え、摂氏4度のローテーターで20rpmの固定速度で10分間3回洗浄します。

40マイクロリットルのサンプルバッファーを加えてビーズからタンパク質を溶出させ、サンプルを摂氏70度で10分間加熱します。ビーズをスピンダウンした後、液体を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。免疫細胞化学を行うには、HEK293細胞を1.5×10で1.5倍にして、8チャンバーポリデリジンコーティングスライドで各チャンバー4個の細胞に播種します。

0.4ミリリットルのDMEMに10%FPSとペンストレップ1ミリリットルあたり100ユニットを補給しました。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で48時間インキュベートした後、培地を吸引し、4%PFAを使用して細胞を室温で10分間層流フードに固定します。次に、PFAを吸引し、チャンバーあたり0.5ミリリットルのPBSを使用して細胞を3回洗浄します。

0.5%tritonX100を5%NGSおよびPBSと共に添加し、細胞を透過およびブロックし、室温で1時間インキュベートします。次に、抗NF90モノクローナル抗体および抗RBM3ポリクローナル一次抗体を1〜100に希釈した後、ウェルに一次抗体を添加し、摂氏4度でシェーカーで一晩インキュベートします。翌日、0.5ミリリットルのPBSを使用して、チャンバーをそれぞれ10分間3回洗浄します。

免疫細胞化学を行うには、1〜500希釈の緑色蛍光色素結合抗マウス抗体と赤色蛍光色素結合抗ウサギ抗体を細胞に加え、室温で1時間インキュベートします。DAPHE NBPSの1〜5, 000希釈液を加えて核を対比染色し、室温で10分間インキュベートした後、前と同じようにサンプルをPBSで洗浄します。スライドガラスからチャンバーを取り外して乾燥させ、スライドごとに250マイクロリットルの封入媒体を使用して取り付けます。

チューブ近接ライゲーションアッセイプローブを調製するには、細胞と一次抗体をインキュベートし、示したように洗浄した後、既製のプローブを0.1%tritonx100および5%NGSおよびPBSで1〜5に希釈し、1つの8チャンバースライドで合計320ミリリットルで希釈します。溶液を室温で20分間インキュベートします。ガラス面からチャンバーを取り外し、希釈したプローブを加えてから、37°Cの湿度インキュベーターでチャンバーを1時間インキュベー

8マイクロリットルのリガーゼ、64マイクロリットルの5xライゲーションストック、および248マイクロリットルの水を混合してライゲーション溶液を調製します。スライドから液体を取り出し、onex洗浄バッファーAを使用してサンプルを5分間ずつ2回洗浄します。ライゲーション溶液をサンプルに加え、摂氏37度の湿度インキュベーターで30分間インキュベー

4マイクロリットルのポリメラーゼ、64マイクロリットルの5倍増幅ストック、および252マイクロリットルの水を混合して増幅溶液を調製し、チューブをホイルで包んで光から保護します。次に、スライドから液体をタップオフし、1つのx Wash Buffer Aを使用して、サンプルを2回ずつ2分間洗浄します。増幅溶液をサンプルに加え、暗湿インキュベーターで摂氏37度で100分間インキュベートします。

その後、前回と同様に液体をタップオフした後、サンプルを洗浄バッファーBで各10分間2回洗浄し、0.1 x Wash Buffer Bで1回洗浄します。最後に、スライドを乾燥させ、DAPHEを含む250μLの市販封入剤でサンプルをマウントし、顕微鏡で蛍光を観察し、CCDカメラで画像を取得します。RBM3をベイトタンパク質として用いた共免疫沈降実験により、NF90-RBM3相互作用が主に核内に存在し、細胞質に少数派が見出されることが明らかになりました。この免疫蛍光実験では、NF90とRBM3の両方が核内に見られます。

どちらのタンパク質もC2の細胞質に見られ、両方のタンパク質は各コンパートメントで完全な共局在を示しています。これらの画像に見られるように、近接ライゲーションアッセイは、NF90-RBM3相互作用のパターンを明らかにしました。これは、大多数の細胞の核内でのほとんどの相互作用である従来の免疫細胞化学と非常によく似ています。NF90-RBM3相互作用の主に細胞質分布を示した細胞はごく一部でした。

この手順を試みる際には、より便利ですが、PLAはタンパク質タンパク質の相互作用を直接反映していないことを覚えておくことが重要です。代わりに、co-ip はダイレクト インタラクションを検出します。さらに、一次抗体の特異性が結果の品質を決定します。

このビデオを見れば、自分の実験目的に応じて、さまざまな細胞コンパートメントにおけるタンパク質タンパク質の相互作用を研究するための適切な方法を選択する方法について十分に理解できるはずです。