ゴルジ - コックス法を用いた太い脳切片内のイメージングニューロン

この手順の全体的な目標は、げっ歯類の脳内のニューロンの形態に対する効果的な治療法を決定することです。この方法は、げっ歯類の脳のさまざまな領域内のニューロンの正常および実験的に操作された形態など、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法には、単一の組織学的サンプルに完全に含まれる標識ニューロンを同定し、可視化する確率を高めるという主な利点があります。

Golgi-Cox染色を開始するには、17ミリリットルのGolgi-Cox溶液を含む20ミリリットルのガラスシンチレーションバイアルに新鮮なマウスの脳を入れます。光から保護し、室温で25日間インキュベートします。インキュベーション期間が経過すると、クライオは脳を40ミリリットルのスクロース凍結保護剤に入れて脳を保護し、摂氏4度の暗闇で24時間インキュベートします。

スクロースでのインキュベーション後、脳を凍結して長期保存するか、ビデオの次のセクションに示すようにすぐにブロックして切片化することができます。凍結する場合は、ドライアイスで予冷した200ミリリットルのイソペンタンに全脳を浸します。次に、凍結した脳を50ミリリットルの円錐形のチューブに入れ、摂氏マイナス80度の暗闇で保管します。

まず、スクロースから脳を取り除きます。そして、カミソリの刃を使って小脳を切り取り、脳の残りの尾側端に平らな縁を残すことで、切片化のためにそれをブロックします。脳は、目的のニューロンが結果として生じるセクション内に完全に含まれるように、正確な角度でブロックする必要があります。

例えば、大脳皮質錐体ニューロンには、吻側尾軸に対して完全に垂直な冠状面を使用します。次に、寒天が溶けるまで加熱します。そして、融点より少し高くなるまで冷まします。

次に、尾側の端を下にして、脳を小さな使い捨ての計量皿に入れます。溶かした寒天を加えて脳を覆います。寒天が固まったら、脳の周りに約2〜4ミリリットルを残して余分な部分を切り取ります。

次に、少量のエチルシアノアクリレートを使用して、尾側の端を下にして脳をビブラトームのステージに接着します。ビブラトームのステージ領域を、脳を覆うのに十分なスクロース凍結保護剤で満たします。次に、検査する脳領域に応じて、400〜500ミクロンのスライスの厚さで脳を切片にします。

小さな絵筆を使用して、メッシュボトムインサートを含み、スクロースMリン酸緩衝液をあらかじめ充填した6ウェル組織培養プレートのウェルに脳切片を置きます。切片作成中は光から保護してください。切片化が終了したら、切片を4°Cの暗闇で一晩インキュベートします。

メッシュボトムインサートを使用して、脳切片をリン酸緩衝液中の5ミリリットルのパラホルムアルデヒドを含む新しいウェルに移します。ロッカーの上で、室温でゆっくりと移動しながら、暗闇で15分間インキュベートします。切片を5ミリリットルの水を含む新しい井戸に移して、2回洗います。

光から保護し、室温で適度な速度で5分間洗ってください。次に、切片を5ミリリットルの水酸化アンモニウムを含む新しいウェルに移します。暗闇の中で室温で15分間ゆっくりと揺らします。

切片を5ミリリットルの水を含む新しい井戸に移して、2回洗います。室温で暗闇の中で適度な速度で動くロッカーで5分間洗います。切片を5ミリリットルの希釈固定剤A.インキュベートする新しいウェルに移し、室温で暗闇の中で低速で移動するロッカーで25分間インキュベートします。

セクションを以前のように2回水で洗います。小さな絵筆を使用して切片を顕微鏡スライドに置き、ピンセットと小さなティッシュを使用して余分な水分と寒天を取り除きます。脱水手順に進む前に、すべての寒天が除去されていることを確認してください。

切片を光から保護された室温で風乾させます。適切な乾燥時間は重要であり、ラボごとに決定する必要があります。時間が短すぎると、脱水ステップ中にスライドから切片が脱落したり、時間が長すぎると切片に亀裂が入るおそれがあります。

乾燥後、まずスライドを清澄剤に5分間入れます。スライドを100%エタノールに5分間置きます。次に、一連の減少するエタノール濃度をそれぞれ2分間移動します。

アルコールシリーズの後、スライドを水に5分間置きます。その後、0.5%クレシルバイオレットを水に7分間染色します。クレシルバイオレットの染色後、スライドを水中に2分間置きます。

次に、切片を一連のアルコール濃度の増加にそれぞれ2分間ずつ脱水します。その後、100%エタノールで5分間2回洗浄します。清算剤に5分間置きます。

最後に、無水封入剤を追加し、セクションにカバースリップを置きます。スライドを室温で暗所で少なくとも5日間水平に乾燥させます。目的のニューロンを含む領域の高解像度画像スタックをキャプチャするには、まず顕微鏡で30X 1.05 NAシリコーンオイル浸対物レンズを選択します。

次に、スライドに3〜4滴のシリコーン浸漬油を塗布します。対物レンズをスライド上に配置し、対物レンズとオイルが接触するようにします。画像に焦点を合わせ、イメージングソフトウェアで露出やホワイトバランスなどのカメラ設定を調整します。

次に、セクションの上部に焦点を合わせ、画像取得ウィンドウ内でスタックの上部の横にある設定を選択して、画像スタックの上限と下限を設定します。次に、セクションの一番下にフォーカスし、スタックの一番下にある[設定]を選択します。画像取得ウィンドウ内の画像間の距離の横に1ミクロンを入力して、ステップ距離を1ミクロンに設定します。

最後に、画像取得ウィンドウ内で[画像スタックの取得]を選択して、画像スタックをキャプチャします。前の手順を繰り返して、すべての画像スタックがX軸とY軸で少なくとも10%重なっていることを確認しながら、関心領域全体をキャプチャします。この大脳皮質の画像は、10倍対物レンズを使用して厚さ500ミクロンの切片から取得した画像スタックの結合Z投影です。

この画像の組織は、メインのオールフレッシュプロトコルを使用して処理されました。赤い四角で示された領域は、30倍のシリコンオイル浸対物レンズを使用して画像化され、より高解像度のマージZ投影画像スタックが取得されました。赤い矢印は、高解像度の30倍画像スタックから追跡されたニューロンの2次元Z投影を示しています。

ここでは、クレシルバイオレット染色を施したフレッシュプロトコールバリアントを使用しました。この高解像度の画像は、クレシルバイオレット染色切片を示しています。そして、これが得られたニューロントレースです。

最後に、この組織は、ゴルジ-コックス含浸後に脳を凍結するプロトコルバリアントを使用して処理されました。ここでは、以前に凍結した組織が高解像度で見られます。そして、ニューロントレースの高品質な2次元Z投影が再び得られる。

この技術は1か月以内に完了し、処理とイメージングのステップは最終週で完了します。あるいは、ゴルジ・コックス含浸後に脳を凍結することもでき、後日、処理とイメージングを完了することができます。この手順に続いて、神経科学者は、キャプチャした画像を使用して、樹状突起の複雑さや脊椎密度などの詳細な形態学的分析を行い、実験的操作が脳内のニューロンの構造をどのように変化させるかを判断できます。