VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析
April 9th, 2017
この原稿は、ナノスケールの構造の正確なモデルを生成するために、超解像顕微鏡画像に単一粒子の分析を適用するVirusMapperフィジーベースのオープン・ソース・ソフトウェア・パッケージを使用しています。
この手順の全体的な目標は、蛍光標識されたコンポーネントを持つ構造の超解像画像に単一粒子分析を適用することにより、ウイルスまたは高分子複合体の高精度分子モデルを作成することです。この方法は、複雑なウイルスのタンパク質構造や、感染の過程でどのように変化するかなど、ウイルス学の分野における重要な疑問に答えることができます。この手法の主な利点は、同じ構造の複数の画像を収集することで、そのコンポーネントの高精度マップを生成できるようになることです。
この方法はウイルスの構造に関する洞察を提供しますが、哺乳類細胞内の他の病原体や高分子複合体などの他のシステムにも適用できます。まず、超解像蛍光顕微鏡でサンプルをイメージングします。不要な蛍光構造のない数百から数千の十分に分離された粒子を含む複数の視野の画像を取得します。
画像を取得して処理したら、画像をインポートして、インターカレートされたチャネルを持つスタックに連結します。必要に応じて、連結されたイメージをハイパースタックからスタックに変換します。次に、VirusMapperサブメニューで「Extract Viral Structures」を選択し、抽出した粒子のファイルパスを設定します。
画像化された蛍光チャネルの数を記入します。参照チャンネルを、粒子が最も一貫した外観を持つ蛍光チャンネルに設定します。これらの粒子に中心最大値がない場合は、検出前のガウスぼかしを適用して、中心の最大値を出現させます。
次に、最大の粒子の直径をピクセル単位で推定します。ROI 半径をその値の半分よりわずかに大きい値に設定します。フレームごとに必要な ROI の数を見積もります。
最初は 100 個以下の ROI を使用します。パーティクルの分離に基づいて、ROIの最大オーバーラップを設定します。そのフレームの ROI をプレビューします。
半径、ROI の数、および最大オーバーラップを調整して、フレーム内の各パーティクルが 1 つの ROI で囲まれるようにします。ROI が最大のパーティクルよりも少なくとも 数ピクセル幅であることを確認します。次に、「OK」をクリックしてセグメンテーションを実行します。
抽出後、ROI マネージャーでサンプル イメージを閉じます。抽出されたパーティクルセットの名前は変更しないでください。Generate Seeds」を選択し、抽出したパーティクルデータが入ったフォルダを開きます。
参照チャネルを設定し、シードを生成するすべてのチャネルを選択します。以前のモデルに合わせる必要がある場合は、シードを90度回転させます。パーティクルが中心の最大値を持たないチャネルの場合は、前と同様に事前位置合わせの[ガウス ブラー](Gaussian blur)の値を増やします。
チャンネルが密集していない場合は、非基準チャンネルのシフト補正を有効にします。パーティクル シーケンスで、一貫して表示される構造を検索します。代表的なパーティクルを特定し、対応するフレーム番号を「使用するフレーム」フィールドに入力します。
結果のシードを確認します。シードの選択は、この手順の重要な段階です。生データを慎重に表示して、モデル化する1つ以上の構造を特定します。
モデルの品質は、これらの構造を正確に反映するシードを選択することに大きく依存します。必要に応じて、参照チャネル、ガウスぼかし半径、およびシフト補正を調整して、同様のシードを持つ追加のフレームの識別を最適化します。フレームの追加と生成パラメーターの調整を続けます。これにより、データ内の観測された構造が平均構造を最もよく表します。
シードのフォルダ名とファイル接頭辞を入力します。「OK」をクリックして、後でモデリングするためにシード画像を保存します。Generate Models Based On Seeds」を選択し、抽出したパーティクルフォルダを開きます。
各チャネルのシード平均を読み込みます。参照ベースの構造検出を行う場合は、アライメント用の参照チャネルを選択します。1 つのチャネル内の既知のパーティクル構造を、2 番目の未知のチャネルを位置合わせするための参照として使用できます。
これにより、未知の構造の偏りのないマッピングが可能になります。チャンネル間の色ずれは事前に修正する必要があることに注意してください。解析でモデル内の小さな違いや微妙な特徴を探す場合は、テンプレートのマッチング中に画像の強度を [正方形] を選択します。
最小類似性を 60 から 80% に設定し、反復回数を 1 に設定します。計算中に表示するモデルとパーティクルを選択し、プレビューモデルを生成します。プレビュー モデルを確認します。
最小類似度を大きくして、目的の形態の粒子のみを含めます。必要に応じて他のモデル計算パラメーターを最適化し、必要に応じてモデル生成プロセスで表示する追加の要素を選択します。プレビューモデルに問題がなければ、反復回数を 10 回に増やします。
フォルダ名とファイルのプレフィックスを設定します。「OK」をクリックして、最終モデルのすべての反復を含むモデル進化スタックを保存します。緑色と赤色の蛍光タンパク質でタグ付けされた2つのタンパク質を持つ組換えワクシニアウイルスを、構造化照明顕微鏡でイメージングし、VirusMapperプラグインでモデル化しました。
種子は、正面と矢状方について別々に生成され、それぞれ5つの代表的な粒子から平均化されました。ウイルスの向きに応じて、1つまたは2つの側方体を区別することができます。したがって、2つの方向に対して別々のモデルを生成できます。
この手順を試行する際は、モデルの品質が取得した生データの品質に大きく依存することを覚えておくことが重要です。単粒子解析では精度は向上しますが、低品質の画像を補正することはできません。この手順に続いて、これらのモデルでさらに定量化またはモデルフィッティングを行うことができます。
これは、感染中のウイルス構造のナノスケールの変化など、特に関連する追加の質問に答えるのに役立ちます。このビデオを見れば、単一粒子解析ソフトウェアVirusMapperを使用して超解像画像から分子構造のモデルを生成する方法について十分に理解できるはずです。
概要
この原稿は、超解像度顕微鏡画像の単粒子解析を使用してウイルスの高精度分子モデルを生成する方法を提示しています。この技術は、VirusMapperソフトウェアを活用して、ウイルスの構造と感染中のその変化についての理解を深めます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- ウイルス学
- 顕微鏡学
- 構造生物学
背景
- 単粒子解析により、ナノスケールの構造の詳細なモデリングが可能になります。
- 超解像度顕微鏡は、蛍光標識された構成要素の高解像度画像を提供します。
- この方法はウイルス以外にも様々な生物学的システムに適用できます。
- ウイルス構造の理解は感染メカニズムの洞察に不可欠です。
研究の目的
- ウイルスと高分子複合体の正確な分子モデルを作成すること。
- 複雑なウイルスのタンパク質構造を調査すること。
- ウイルス感染の過程における構造変化を探ること。
使用された方法
- 超解像度蛍光顕微鏡を用いた画像取得。
- 解析用のスタックに画像を処理して連結すること。
- VirusMapperを使用してウイルス構造を抽出し、種を生成すること。
- 選択された種に基づいてモデルを生成し、反復的な改良を行うこと。
主要な結果
- ウイルス構造の高精度モデルが正常に生成されました。
- ウイルスの異なる向きを個別にモデリングしました。
- モデルの品質は生データの品質に依存していました。
- ウイルス構造のナノスケールな変化に関する洞察が得られました。
結論
- 単粒子解析により構造モデルの精度が向上します。
- VirusMapperはウイルス構造を研究するための貴重なツールです。
- さらなる定量化により、ウイルスダイナミクスに関するより深い洞察が得られます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
VirusMapper enables high-precision structural modeling of viral components from super-resolution microscopy data, supporting target validation in antiviral discovery. By quantifying nanoscale architecture and conformational changes, it provides mechanistic de-risking for early-stage virology programs. The open-source, high-throughput plugin facilitates scalable application across discovery teams studying viral entry, assembly, or host-pathogen interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral protein architecture and structural dynamics during infection cycles.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven target selection through direct visualization of macromolecular complexes.
- Predictive Value: Generates structural maps that inform epitope accessibility and druggable site identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative, reproducible structural outputs for assay standardization.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological models for downstream compound screening.
- Platform Value: Facilitates reuse of imaging workflows across multiple viral targets or mutants.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links nanoscale structural changes to functional viral phenotypes.
- Operational Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation via consistent structural readouts.
- Risk Mitigation: Enables data-driven go/no-go decisions based on architectural stability across strains or conditions.
Pipeline & Workflow Integration
VirusMapper fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, providing structural insights that inform antiviral design.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of viral assembly mechanisms and host-factor interactions.
- Screening: Delivers assay-ready structural models with quantitative spatial resolution for compound binding studies.
- Analytics: Generates iterative model refinements and similarity metrics that enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects structural observations to preclinical efficacy through architecture-function correlation.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, open-source platform for structural virology across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence through direct, high-resolution visualization of viral components.
- Operational Value: Ensures reproducibility and scalability via automated particle extraction and iterative modeling.
- Strategic Value: Reduces biological risk in lead selection by validating structural assumptions early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on structural conservation or vulnerability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy and image analysis workflows.
- Depends on access to structured illumination or comparable super-resolution platforms.
- Necessitates standardized image acquisition protocols for consistent particle separation and signal quality.
- Involves cross-team alignment on reference channel selection and seed generation parameters.
- Limited by the quality of raw imaging data; cannot compensate for poor labeling or high background.
