VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

この手順の全体的な目標は、蛍光標識されたコンポーネントを持つ構造の超解像画像に単一粒子分析を適用することにより、ウイルスまたは高分子複合体の高精度分子モデルを作成することです。この方法は、複雑なウイルスのタンパク質構造や、感染の過程でどのように変化するかなど、ウイルス学の分野における重要な疑問に答えることができます。この手法の主な利点は、同じ構造の複数の画像を収集することで、そのコンポーネントの高精度マップを生成できるようになることです。

この方法はウイルスの構造に関する洞察を提供しますが、哺乳類細胞内の他の病原体や高分子複合体などの他のシステムにも適用できます。まず、超解像蛍光顕微鏡でサンプルをイメージングします。不要な蛍光構造のない数百から数千の十分に分離された粒子を含む複数の視野の画像を取得します。

画像を取得して処理したら、画像をインポートして、インターカレートされたチャネルを持つスタックに連結します。必要に応じて、連結されたイメージをハイパースタックからスタックに変換します。次に、VirusMapperサブメニューで「Extract Viral Structures」を選択し、抽出した粒子のファイルパスを設定します。

画像化された蛍光チャネルの数を記入します。参照チャンネルを、粒子が最も一貫した外観を持つ蛍光チャンネルに設定します。これらの粒子に中心最大値がない場合は、検出前のガウスぼかしを適用して、中心の最大値を出現させます。

次に、最大の粒子の直径をピクセル単位で推定します。ROI 半径をその値の半分よりわずかに大きい値に設定します。フレームごとに必要な ROI の数を見積もります。

最初は 100 個以下の ROI を使用します。パーティクルの分離に基づいて、ROIの最大オーバーラップを設定します。そのフレームの ROI をプレビューします。

半径、ROI の数、および最大オーバーラップを調整して、フレーム内の各パーティクルが 1 つの ROI で囲まれるようにします。ROI が最大のパーティクルよりも少なくとも 数ピクセル幅であることを確認します。次に、「OK」をクリックしてセグメンテーションを実行します。

抽出後、ROI マネージャーでサンプル イメージを閉じます。抽出されたパーティクルセットの名前は変更しないでください。Generate Seeds」を選択し、抽出したパーティクルデータが入ったフォルダを開きます。

参照チャネルを設定し、シードを生成するすべてのチャネルを選択します。以前のモデルに合わせる必要がある場合は、シードを90度回転させます。パーティクルが中心の最大値を持たないチャネルの場合は、前と同様に事前位置合わせの[ガウス ブラー](Gaussian blur)の値を増やします。

チャンネルが密集していない場合は、非基準チャンネルのシフト補正を有効にします。パーティクル シーケンスで、一貫して表示される構造を検索します。代表的なパーティクルを特定し、対応するフレーム番号を「使用するフレーム」フィールドに入力します。

結果のシードを確認します。シードの選択は、この手順の重要な段階です。生データを慎重に表示して、モデル化する1つ以上の構造を特定します。

モデルの品質は、これらの構造を正確に反映するシードを選択することに大きく依存します。必要に応じて、参照チャネル、ガウスぼかし半径、およびシフト補正を調整して、同様のシードを持つ追加のフレームの識別を最適化します。フレームの追加と生成パラメーターの調整を続けます。これにより、データ内の観測された構造が平均構造を最もよく表します。

シードのフォルダ名とファイル接頭辞を入力します。「OK」をクリックして、後でモデリングするためにシード画像を保存します。Generate Models Based On Seeds」を選択し、抽出したパーティクルフォルダを開きます。

各チャネルのシード平均を読み込みます。参照ベースの構造検出を行う場合は、アライメント用の参照チャネルを選択します。1 つのチャネル内の既知のパーティクル構造を、2 番目の未知のチャネルを位置合わせするための参照として使用できます。

これにより、未知の構造の偏りのないマッピングが可能になります。チャンネル間の色ずれは事前に修正する必要があることに注意してください。解析でモデル内の小さな違いや微妙な特徴を探す場合は、テンプレートのマッチング中に画像の強度を [正方形] を選択します。

最小類似性を 60 から 80% に設定し、反復回数を 1 に設定します。計算中に表示するモデルとパーティクルを選択し、プレビューモデルを生成します。プレビュー モデルを確認します。

最小類似度を大きくして、目的の形態の粒子のみを含めます。必要に応じて他のモデル計算パラメーターを最適化し、必要に応じてモデル生成プロセスで表示する追加の要素を選択します。プレビューモデルに問題がなければ、反復回数を 10 回に増やします。

フォルダ名とファイルのプレフィックスを設定します。「OK」をクリックして、最終モデルのすべての反復を含むモデル進化スタックを保存します。緑色と赤色の蛍光タンパク質でタグ付けされた2つのタンパク質を持つ組換えワクシニアウイルスを、構造化照明顕微鏡でイメージングし、VirusMapperプラグインでモデル化しました。

種子は、正面と矢状方について別々に生成され、それぞれ5つの代表的な粒子から平均化されました。ウイルスの向きに応じて、1つまたは2つの側方体を区別することができます。したがって、2つの方向に対して別々のモデルを生成できます。

この手順を試行する際は、モデルの品質が取得した生データの品質に大きく依存することを覚えておくことが重要です。単粒子解析では精度は向上しますが、低品質の画像を補正することはできません。この手順に続いて、これらのモデルでさらに定量化またはモデルフィッティングを行うことができます。

これは、感染中のウイルス構造のナノスケールの変化など、特に関連する追加の質問に答えるのに役立ちます。このビデオを見れば、単一粒子解析ソフトウェアVirusMapperを使用して超解像画像から分子構造のモデルを生成する方法について十分に理解できるはずです。