Name: 単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: 学ぶ ウイルス粒子をガラス表面に固定するサンプル調製法。原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングで高品質なウイルス構造観察を実現し、生物物理学研究に有用です。

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<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
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</ol>

著者らは、この論文に競合する金銭的利益を持っていません。

AFMおよび高解像蛍光イメージングによる単一のビリオンイメージングは、CryoEM断層撮影の代替方法として使用することができます。これらの方法論のそれぞれは、それぞれの特定の強みを持っています。例えばAFMは、サンプルまたは内部ウイルスタンパク質のタグ付けに必要のないWTビリオンで行うことができます。ウイルス構造の位置は、ビリオンの弾性特性への寄与から減少する。
新たに開発されたウイルス逆遺伝的アプローチと組み合わせて単一のビリオン超分解能イメージングは、低コピー数ウイルスタンパク質20を局在化するための強力な技術となる。タンパク質を蛍光タンパク質と融合させたタンパク質との置換を伴う組換えウイルスは、これらの逆遺伝的アプローチを用いて作製および精製することができる。超解像イメージングは遺伝的タグ付けによる特異性を有するが、変異型ウイルスの使用が必要である。
AFM と超解像度イメージングは、非常に類似したサンプル準備を利用する無料の方法です。この論文で概説した方法は、初期の単一分子イメージングアッセイの形態であり、ビリオンのトポロジーにほとんど影響を与えずに単一のビリオンを固定することを可能にする。

電荷ベースの非特異的相互作用は、原子間力顕微鏡1,2におけるビリオンの接着に日常的に使用される。これらの技術は、非常に硬いキャプシド3-6で非エンベロープビリオンに使用すると特にうまく機能します。これらの技術はサンプルを固定化するのに非常に有効であるが、それらは表面にタンパク質の非特異的結合を防ぐものではない。非特異的結合は、AFMと様々な抗体を用いてサンプルのインキュベーションを必要とする超解像蛍光技術を用いてビリオンを画像化しようとすると問題を引き起こす可能性がある。ここでは、ビリオンの特定の固定化のためのサンプル調製方法を概説する。
ポリ(エチレングリコール)(PEG)は、ポリ(L-リジン)(PLL)に移植され、ガラス表面に吸着し、ガラス7とのタンパク質の静電相互作用のための重要なブロックを提供する。ガラス表面上の単一分子の固定化を必要とする単分子アッセイは、この性質を利用して、これを用いて、PEGベースの固定化技術8~10を作成した。この調製物はまた、クラトリンケージをガラス表面11に固定化するとともに、コントロールセル接着のための均質なフィブロネクチンコーティングを作成するためにも使用された。
単一分子イメージング方法からガラス表面へのPLL-g-PEG吸着に基づくサンプル調製方法を採用し、静脈性口内炎ウイルス(VSV)の単一ウイルスのイメージングに適用しました。これらの単一のビリオンは、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて画像化した。同様の実験もコントロールとして機能化されたビーズに対して行った。また、超解像蛍光顕微鏡法によってビリオンを画像化し、Alexa 647で標識されたVSV-G抗体を用いて、単一のビリオンのエンベロープの画像を作成した。高解像度蛍光イメージングは、単一分子の局在化を利用して、画像13〜15を作成する。fPALMバイ平面イメージングは、光軸15,16に沿って平面および50nm解像度の20nmを有する単一分子の局在化を可能にする。この2平面技術は、本研究に存在する超解像度蛍光画像を画像化するために使用された。同様の結果を持つ代替技術は、STORM13,17,18です。
この論文で概説した手順によってガラスに固定されたVSVのAFMおよび超分解能蛍光像の両方が、最小非特異的相互作用19を有するガラスへのビリオンの特異的結合を示した。ここでは、AFMおよび超解像度蛍光イメージング実験用のサンプル調製プロトコルを紹介します。簡単に言うと:きれいなガラスカバーリップはPLL-g-PEGおよびPLL-g-PEG-ビオチンの混合物を吸着することによって機能する。この薄膜は、コーティングされた表面に15〜25%の機能化ビオチンを提供するように設計される典型的な。カバーリップはさらに四量体アビジンでインキュベートされる。ビオチン化されたウイルス抗体は、ビリオンのユニークな結合部位を作成するために使用されます。抗体の結合は2つの方法で行うことができる。
最初の方法はAFMのために最適化されていますが、超解像蛍光イメージングには適しています。この方法では、アビジン被覆表面は、ウイルス接着の前にビオチン化抗体で処理される。固定化されたビリオンは、エンベロープを覆い、ビリオンの超解像蛍光イメージングを可能にするために、Alexa 647標識抗体で処理されます。
2番目の方法は、アビジン処理面にウイルスを付着させる前に、ビオチン化抗体およびAlexa 647標識抗体を用いてウイルスを溶液中で攻撃することです。この方法は、ウイルスエンベロープの回復が重要である超解像蛍光イメージング実験に最適化されています。この方法は、ウイルス表面に均一な抗体被覆を可能にする利点を有する。ビオチン化抗体は、ウイルスエンベロープの外側に高濃度の蛍光標識を維持しながら、アビジン処理面に対するウイルスの十分な吸着を可能にする比率でAlexa 647標識ウイルス抗体と混合することができる。これらのAlexa 647標識ウイルス抗体はビオチン化されておらず、その過剰はバックグラウンドノイズを低減するために洗い流され得る。

<table><tbody><tr><td>ガラスカバースリップ(fPALM)</td><td>電子顕微鏡サービス</td><td>72225-01</td><td>25 mmカバースリップ</td></tr><tr><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-ビオチン(20%)&nbsp;</td><td>SuSoS-Stock</td><td></td><td>: 0.5 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>NeutrAvidin biotin-binding protein</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td>Stock: 0.25 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 ヤギ抗ウサギIgG (H+L)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>1:200 in 0.2 M KPO4、0.15 M NaCl、10% グリコール、pH 7.2 バッファー</td></tr><tr><td>&α;-VSV-G&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>ab34774</td><td>1:200 in 0.2 M KPO4、0.15 M NaCl、10% グリコール、pH 7.2 バッファー</td></tr><tr><td>Gluox</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>アスペルギリウス属のグルコースオキシダーゼ 7 型&nbsp;</td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>シグマ</td><td>C40-100mg</td><td>ウシの肝臓由来のカタラーゼ&nbsp;</td></tr><tr><td>MEA</td><td>Sigma</td><td>30070-10G</td><td>Cysteamine (MEA</td></tr><tr><td>Stock Buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% グルコース</td></tr><tr><td>NTE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer, ミニ透析ユニット</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>10,000 MW</td></tr><tr><td>顕微鏡カバー ガラス: 35 CIRCLE #1</td><td>Fisherbrand</td><td>35 CIRCLE #1</td><td></td></tr></tbody></table>

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

ガラス表面へのビリオンの固定化は、単一のビリオンイメージングにおいて重要なステップです。ここでは、単一分子イメージングアッセイから、ガラス表面に特異性を持つ単一のビリオンの接着を可能にする技術を紹介します。この調製物は、PLL-g-PEGとPLL-g-PEG-ビオチンの混合物でガラスの表面をグラフトし、アビジンの層を追加し、最終的にビオチン化されたウイルス特異的抗体の付着を通じてビリオンアンカーを作成することに基づいています。この手法は、原子間力顕微鏡(AFM)や超解像蛍光イメージングなど、さまざまな実験に応用してきました。このサンプル調製方法は、表面へのビリオンの制御接着をもたらす。

AFMを使用した単一のビリオンイメージング:
上で概説したサンプル調製プロトコルは、野生型のビリオンをガラス表面に固定するのに用いた。VSVビリオンは、長さ180nm、直径80nmの弾丸形状です。この技術が適用される可能性のある様々なビリオンがあるので、この概念はビオチン化された36 nmビーズにもまた実証されています。結果として得られた AFM 実験を 図 1に示します。VSVビリオンは、非エンベロープウイルス(GPa)と比較してヤング率(100 MPa)が低い点に注意することが重要です。単一のビリオンVSVの特定の画像は、硬いカンチレバーを有する周囲条件下でタッピングモード下で得られた。その目的は、ウイルス内の余分なタンパク質密度がAFM画像内のバンプとして見えるようになる点までウイルスを変形させることを目的としている。この方法は、ウイルス空洞19内の余分なタンパク質密度を検出するために使用される。
単一のビリオン超解像度イメージング:
Alexa 647標識VSV-G抗体は、方法5Aを用いた超解像実験のために個々のVSVビリオンのエンベロープをコーティングするために使用された。テザリング密度と低い非特異的結合を示すために、サンプルの大きなスキャンを 図2Aに示します。代表的なビリオン上のウイルスエンベロープの回復は 図2B( 青色同一体面)に示されている。
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
図 1.機能化されたPEGG表面のビーズおよびVSVのAFMイメージ投射。36 nmビオチン化ビーズ(A、B)とVSVビリオン(C)をビオチン化VSVG抗体で表面に固定したAFMスキャン。AFMはACエアトポグラフィスキャンモードで行われました。先端半径は<25nmであり、測定は力変調および光タッピング下で行った。先端は3 N /mの力定数および15 kHzの不確実性の共振頻度75 kHzを有していた。ビーズはAFMスキャン中に高さを保持していましたが、VSVビリオンは若い弾性率が大幅に小さく、高さが有意に変形します。この画像では、ビリオンは、小さなキシコンボリューション(ウイルスの先端対鈍端を決定するために使用される)を生成するタッピングモードで硬い片持ち体で特異的に画像化され、ウイルスの先端と鈍い端の間の高さの差は、ウイルス19の鈍い端で余分なタンパク質密度を検出するために使用される。
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> 図 2.PEGG機能表面上のVSVビリオンの蛍光ベースのイメージング。 A)広視野蛍光で画像化されたビオチン化抗VSVG抗体を用いてPEGG表面に固定化された組換えVSVビリオン。 B)ビオチン化された抗VSVG抗体を介してPEGG表面に取り付けられ、アレクサ647標識抗VSVG抗体で飾られたVSVのエンベロープの高分解能再構築(方法5Aはこれらの画像を作成するために使用された)。青のサーフェスは、2D 等値面投影です。左は弾丸型ウイルスのモデルを示す。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">カバースリップサイズ</td>
			<td style="width:93px;">流体</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 mm</td>
			<td>65 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 mm</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 mm</td>
			<td>36 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 mm</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 mm</td>
			<td>16 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1.カバースリップサイズに応じた流体アリコート。

表面へのビリオンの付着は、超解像蛍光イメージングまたは原子間力顕微鏡(AFM)による単一のビリオンイメージングの要件です。ここでは、AFMおよび超解像蛍光イメージングでの使用に適したガラス表面へのビリオンの制御接着のためのサンプル調製方法を示す。

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

この手順では、原子間力顕微鏡および蛍光光活性化局在化顕微鏡などの超解像顕微鏡で使用するための、ウイルスを付着させたガラスカバースリップを調製します。まず、ガラス基板を洗浄し、ポリLリジンにグラフトされた部分ビオチン化ポリエチレングリコールの薄膜でガラスをコーティングします。次に、ビオチン化フィルムの結合親和性を高めるため、表面をアビドンで処理します。次に、標的となるウイルスの特異的ビオチン化抗体で表面を処理します。その後、抗体で処理した表面を標的ウイルスで処理します。スピンコーティングとは異なり、この手法は変異体を表面上に均一に分散させることができるという利点があります。顕微鏡観察を最適化するため、カバースリップを適切なサイズのテフロン製カバースリップラックに垂直に配置し、ろ過済みのエタノールを満たしたビーカーに浸し、30分間超音波処理を行います。その後、カバースリップを超純水で十分に洗浄します。次に、カバースリップを別の清潔なテフロンラックに移し、1 M 水酸化ナトリウムを満たしたビーカーに入れて30分間超音波処理を行い、超純水で十分に洗浄します。次に、洗浄済みのカバーガラスを窒素気流で乾燥させ、清潔で乾燥したテフロンラックに移します。各カバーガラスに目に見える膜や粒子が付着していないことを確認してください。窒素気流で水平に乾燥させた直後、カバーガラス1枚を滅菌ペトリ皿に入れ、カバーガラスの中央に適切な量のPBS緩衝液で希釈したビオチン化ポリリジン修飾ポリエチレングリコールをピペッティングします。サンドイッチ法を用いて、液の上に別の清潔なカバーガラスを配置します。2枚のカバーガラスの活性面の間が完全に液体で満たされていることを確認してください。ペトリ皿に蓋をし、室温で45〜60分間インキュベートします。次に、余分な液体を絞り出さないように、ピンセットでサンドイッチをピックアップします。次に、親指と人差し指を使用して、サンドイッチを水平に軽くつまみます。カバーガラスを互いに反対方向にスライドさせ、活性面（active faces）に触れないように分離させます。両方の活性面を25 millilitersの超純水で洗浄します。次に、窒素気流でカバーガラスを乾燥させ、どのカバーガラスの面が活性であるかを滅菌ペトリ皿に記録します。処理済みのカバーガラスの活性面を上に向けた状態で配置し、解凍したエビデンス溶液の適量を活性面の中央にピペットで滴下します。活性面を下にして別のカバーガラスを重ねて液体を挟み、室温で25～30分間インキュベートします。次に、前述のように2枚のカバーガラスを、活性面に触れないように注意しながら分離します。次に、両方の活性面を25 millilitersの超純水で洗浄し、カバーガラスを窒素気流で乾燥させます。どちらのカバーガラスの面が活性面であるかを覚えておくことが重要です。今後の参照のため、アビジン処理済みのカバーガラスの活性面を上にして滅菌ペトリ皿にすぐに配置し、解凍したビオチン化抗体の適量を活性面の中央にピペッティングします。サンドイッチ法を用いて、もう一方のカバーガラスを活性面を下にして液の上に置きます。その後、室温で45～60分間インキュベートします。2枚のカバーガラスを分離した後、両方の活性面を25 millilitersのPBSで洗浄します。次に、抗体処理したカバーガラスを活性面を上にして滅菌済みのペトリ皿に置き、ウイルスの適量を活性面の中央にピペットで滴下します。次に、2枚目の活性化カバーガラスでサンドイッチし、スライドガラスに載せ、カバーをかけてインキュベートします。その後、2枚のカバーガラスを分離します。両方の活性面を25 millilitersのPBSで洗浄し、PBSを満たしたテフロンラックおよびビーカーに移します。調製したサンプルは直ちに使用するか、4°Cで最大3日間保存してください。ここでは、水疱性口炎ウイルスの野生型ビリオンをガラス表面に固定し、原子間力顕微鏡で分析しました。ビリオンの幅と長さは80 nm × 180 nmであり、元のビリオンのサイズからの歪みは最小限であることが示されました。この実験では、蛍光光活性化局在化顕微鏡（PALM）を用いて単一のビリオンをイメージングしました。ここでは、Alexa Fluor 647標識VSVG抗体を使用しています。青色の等値面は、FOM顕微鏡を用いて復元されたビリオンの表面を示しています。このビデオを視聴することで、原子間力顕微鏡（AFM）または超解像顕微鏡に使用するための、ウイルスを付着させたガラスカバースリップの調製方法について十分に理解することができます。カバースリップのどちらの面に活性化学処理が施されているかを常に認識しておくことが重要です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

単一のウイルスゲノム（SVG）は、単一のビリオンのゲノムを分離して増幅する方法である。混合された集合体のウイルス懸濁することにより、ビリオンを捕捉し、下流の処理中にゲノムせん断を低減、アガロースを含む個別のウェルを有する顕微鏡スライド上にフローサイトメトリーを用いてソートされる。全ゲノム増幅は、配列決定のために適しているゲノム材料をもたらす複数の置換増幅（MDA）を用いて達成される。...

&#39;シングルウイルスゲノミクス&#39;を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

この原稿は、ナノスケールの構造の正確なモデルを生成するために、超解像顕微鏡画像に単一粒子の分析を適用するVirusMapperフィジーベースのオープン・ソース・ソフトウェア・パッケージを使用しています。...

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

このプロトコルでは、相関超解像光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡像によるゼブラフィッシュの網膜の細胞内タンパク質局在結果を取得する必要な手順について説明します。...

ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

2 つのサンプル処理技術、高圧凍結を組み合わせることのためのプロトコルの紹介、マイクロ波試料処理は続いて集束イオンビームのビーム走査型電子顕微鏡 (FIB SEM)...

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

ここでは、感染アメーバの分離のための単一細胞マイクロ吸引法について説明する。ファウストウイルスと未知の巨大ウイルスに感染したヴェルマメーバ・バーミフォルミスのウイルス亜集団を分離するために、以下に詳述するプロトコルを開発し、2つの低存在量の新規巨大ウイルスを分離する能力を実証した。...

巨大ウイルス混合物分離のための蛍光活性化細胞選別の代替戦略としての単一細胞マイクロ吸引

このプロトコルは、一次神経細胞培養におけるタンパク質の共局在化を研究するために超解像顕微鏡を採用する方法を示す。...

一次ニューロンにおけるタンパク質とシナプスマーカーの共局在化を研究する超分解能イメージング

ここでは、クライオ電子線トモグラフィー用の細胞サンプルの調製をガイドするための3D相関集束イオンビームミリングのパイプラインを紹介します。目的の蛍光タグ付きタンパク質の3D位置は、まずクライオ蛍光顕微鏡で決定され、次にミリングの標的となります。このプロトコルは、哺乳類、酵母、および細菌細胞に適しています。...

高分解能クライオ電子線トモグラフィーのための3D相関集束イオンビームミリングによるサンプル調製

ここでは、透過型電子顕微鏡を使用してナノスケールでの液体EMおよびクライオEM分析に適したウイルスアセンブリを調製するためのプロトコルについて説明します。...

液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩

このプロトコルは、相関光顕微鏡と電子顕微鏡を使用して、それぞれmEosEMとAPEX2で標識されたミトコンドリアとリソソームの相互作用を視覚化するメカニズムを説明しています。...

ミトコンドリアとリソソーム間の相互作用を可視化するための2色相関光顕微鏡と電子顕微鏡法

このビデオプロトコルは、ウイルス学的標本の走査型透過型電子顕微鏡断層撮影法を実行する方法を示しています。最適な結果を得るために、サンプルは高圧凍結とその後の凍結置換によって調製されます。...

ウイルス学における走査型透過型電子顕微鏡断層撮影:高圧凍結凍結置換サンプルの3Dイメージング

このプロトコルは、高解像度のセルラーおよびサブセルラー画像診断のための、多重アレイ検出器と統合されたレーザー走査共焦点顕微鏡システムの高度なイメージングアプリケーションおよび共有リソース管理について詳述しています。このワークフローにより、共焦点から超分解能(~120nm)までのマルチモーダルイメージングが単一のプラットフォーム内で可能となり、ナノスケールの可視化をより容易にします。...

超分解能イメージングと共有管理:多重検出を伴う共焦点顕微鏡のプロトコル

学ぶ ウイルス粒子をガラス表面に固定するサンプル調製法。原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングで高品質なウイルス構造観察を実現し、生物物理学研究に有用です。

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

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