単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

この手順では、原子間力顕微鏡や蛍光光活性化局在顕微鏡などの超解像顕微鏡で使用するためのウイルス入りガラスカバースリップを調製します。まず、ガラス基板を清掃し、ポリLリジンにグラフトした部分的にビオチン化されたポリエチレングリコールの薄膜でガラスをコーティングします。次に、表面をアバドンで処理して、ビオチン化フィルムの結合親和性を高めます。

次に、目的のウイルスに特異的なビオチン化抗体で表面を処理します。次に、抗体調製した表面を目的のウイルスで処理します。スピンコーティングとは異なり、この技術には、表面に沿ってバリアントを均一に分布させるという利点があります。

顕微鏡検査を最適化するために、カバースリップを適切なサイズのテフロンカバースリップラックに垂直に置き、ろ過されたエチルアルコール超音波処理物を充填したビーカーに30分間浸します。次に、カバースリップを超純水で広範囲にすすぎます。次に、カバーを別のきれいなテフロンラックとビーカーに入れ、1モルの水酸化ナトリウムを30分間超音波処理し、超純水で広範囲にすすいでください。

次に、すすいだカバースリップを窒素の流れの下で乾かし、清潔で乾燥したテフロンラックに移します。各カバースリップに目に見えるフィルムや粒子が付着していないことを確認します。窒素流で水平に乾燥させた直後に、カバースリップピペットの中央にある滅菌ペトリ皿に1つのカバースリップを置き、PBS中のビオチン化ポリリジングラフトポリエチレングリコールを適量入れます。

サンドイッチ方式で液体の上に別のきれいなカバースリップを置きます。2 つのカバー スリップのアクティブな面間のボリュームが液体で完全に満たされていることを確認します。ペトリ皿に蓋をして、室温で45〜60分間インキュベートします。

次に、余分な水分をつまむことなく、ピンセットでサンドイッチをつまみます。次に、親指と人差し指を使用して、サンドイッチを軽く水平につまみます。カバーを逆方向にスライドさせ、アクティブな面に触れないようにそれらを分離します。

両方の活性面を25ミリリットルの超純水ですすいでください。次に、カバースリップを窒素の流れで乾燥させ、どのカバースリップ面が滅菌ペトリ皿にアクティブになっているかに注意してください。アクティブフェイスアップピペットで処理されたカバースリップに、適量の解凍した証拠溶液をアクティブフェイスの中央に置きます。

アクティブフェイスを下にして別のカバースリップを置き、液体を挟み込み、室温で25〜30分間インキュベートします。次に、前に示したように2つのカバースリップを分離します。アクティブな顔に触れないように注意してください。

次に、両方のアクティブな面を25ミリリットルの超純水ですすぎ、次にカバースリップを窒素の流れで乾燥させます。どのカバースリップ面がアクティブであるかを覚えておくことが重要です。将来の参照のために、熱心で処理されたカバースリップアクティブフェイスを上にして滅菌済みのシャーレにすぐに置き、活性面の中央に適量の解凍ビオチン化抗体をピペットで移します。

サンドイッチ方式で、アクティブな面を下にして別のカバースリップを液体の上に置きます。.その後、室温で45〜60分間インキュベートします 2つのカバースリップを分離した後、両方の活性面を25ミリリットルのPBSですすいでください。次に、抗体処理したカバースリップをアクティブフェイスを上にして滅菌済みのペトリ皿に入れ、アクティブフェイスの中央に適量のウイルスをピペットで移します。

次に、2番目のアクティブカバーでサンドイッチし、スリップし、カバーをして、インキュベートします。次に、2つのカバースリップを分離します。両方のアクティブな面を25ミリリットルのPBSですすぎ、PBSで満たされたテフロンラックとビーカーに移します。

調製したサンプルはすぐに使用するか、摂氏4度で最大3日間保管してください。ここは。水疱性口内炎ウイルスの野生型変異体をガラス表面に固定し、原子間力顕微鏡で分析しました。ビリオンの幅と長さは80ナノメートル×180ナノメートルで、ビリオンの元のサイズからの歪みは最小限に抑えられています。

この実験では、単一のビリオンを蛍光光活性化局在顕微鏡法でイメージングしました。Alexis 6 47標識VSVG抗体を使用。青色の等値面は、FOM顕微鏡を使用してビリオンの回復した表面を示しています。

このビデオを見れば、原子間力顕微鏡や超解像顕微鏡で使用するウイルス入りガラスカバースリップの作り方を十分に理解できるはずです。カバースリップのどの面に活性化学物質が付着しているかを常に覚えておくことが重要です。