単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製
2014年1月2日
表面へのビリオンの付着は、超解像蛍光イメージングまたは原子間力顕微鏡(AFM)による単一のビリオンイメージングの要件です。ここでは、AFMおよび超解像蛍光イメージングでの使用に適したガラス表面へのビリオンの制御接着のためのサンプル調製方法を示す。
この手順では、原子間力顕微鏡や蛍光光活性化局在顕微鏡などの超解像顕微鏡で使用するためのウイルス入りガラスカバースリップを調製します。まず、ガラス基板を清掃し、ポリLリジンにグラフトした部分的にビオチン化されたポリエチレングリコールの薄膜でガラスをコーティングします。次に、表面をアバドンで処理して、ビオチン化フィルムの結合親和性を高めます。
次に、目的のウイルスに特異的なビオチン化抗体で表面を処理します。次に、抗体調製した表面を目的のウイルスで処理します。スピンコーティングとは異なり、この技術には、表面に沿ってバリアントを均一に分布させるという利点があります。
顕微鏡検査を最適化するために、カバースリップを適切なサイズのテフロンカバースリップラックに垂直に置き、ろ過されたエチルアルコール超音波処理物を充填したビーカーに30分間浸します。次に、カバースリップを超純水で広範囲にすすぎます。次に、カバーを別のきれいなテフロンラックとビーカーに入れ、1モルの水酸化ナトリウムを30分間超音波処理し、超純水で広範囲にすすいでください。
次に、すすいだカバースリップを窒素の流れの下で乾かし、清潔で乾燥したテフロンラックに移します。各カバースリップに目に見えるフィルムや粒子が付着していないことを確認します。窒素流で水平に乾燥させた直後に、カバースリップピペットの中央にある滅菌ペトリ皿に1つのカバースリップを置き、PBS中のビオチン化ポリリジングラフトポリエチレングリコールを適量入れます。
サンドイッチ方式で液体の上に別のきれいなカバースリップを置きます。2 つのカバー スリップのアクティブな面間のボリュームが液体で完全に満たされていることを確認します。ペトリ皿に蓋をして、室温で45〜60分間インキュベートします。
次に、余分な水分をつまむことなく、ピンセットでサンドイッチをつまみます。次に、親指と人差し指を使用して、サンドイッチを軽く水平につまみます。カバーを逆方向にスライドさせ、アクティブな面に触れないようにそれらを分離します。
両方の活性面を25ミリリットルの超純水ですすいでください。次に、カバースリップを窒素の流れで乾燥させ、どのカバースリップ面が滅菌ペトリ皿にアクティブになっているかに注意してください。アクティブフェイスアップピペットで処理されたカバースリップに、適量の解凍した証拠溶液をアクティブフェイスの中央に置きます。
アクティブフェイスを下にして別のカバースリップを置き、液体を挟み込み、室温で25〜30分間インキュベートします。次に、前に示したように2つのカバースリップを分離します。アクティブな顔に触れないように注意してください。
次に、両方のアクティブな面を25ミリリットルの超純水ですすぎ、次にカバースリップを窒素の流れで乾燥させます。どのカバースリップ面がアクティブであるかを覚えておくことが重要です。将来の参照のために、熱心で処理されたカバースリップアクティブフェイスを上にして滅菌済みのシャーレにすぐに置き、活性面の中央に適量の解凍ビオチン化抗体をピペットで移します。
サンドイッチ方式で、アクティブな面を下にして別のカバースリップを液体の上に置きます。.その後、室温で45〜60分間インキュベートします 2つのカバースリップを分離した後、両方の活性面を25ミリリットルのPBSですすいでください。次に、抗体処理したカバースリップをアクティブフェイスを上にして滅菌済みのペトリ皿に入れ、アクティブフェイスの中央に適量のウイルスをピペットで移します。
次に、2番目のアクティブカバーでサンドイッチし、スリップし、カバーをして、インキュベートします。次に、2つのカバースリップを分離します。両方のアクティブな面を25ミリリットルのPBSですすぎ、PBSで満たされたテフロンラックとビーカーに移します。
調製したサンプルはすぐに使用するか、摂氏4度で最大3日間保管してください。ここは。水疱性口内炎ウイルスの野生型変異体をガラス表面に固定し、原子間力顕微鏡で分析しました。ビリオンの幅と長さは80ナノメートル×180ナノメートルで、ビリオンの元のサイズからの歪みは最小限に抑えられています。
この実験では、単一のビリオンを蛍光光活性化局在顕微鏡法でイメージングしました。Alexis 6 47標識VSVG抗体を使用。青色の等値面は、FOM顕微鏡を使用してビリオンの回復した表面を示しています。
このビデオを見れば、原子間力顕微鏡や超解像顕微鏡で使用するウイルス入りガラスカバースリップの作り方を十分に理解できるはずです。カバースリップのどの面に活性化学物質が付着しているかを常に覚えておくことが重要です。
概要
本記事では、原子間力顕微鏡（AFM）および超解像蛍光イメージングに使用するための、ウイルスを付着させたガラスカバースリップの作製方法を紹介します。この手法により、ビリオンの制御された接着が可能となり、ウイルス構造の高解像度イメージングが容易になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物物理学
- 顕微鏡技術
背景
- AFMや超解像顕微鏡などのイメージング技術において、ビリオンの付着は不可欠である。
- 接着を制御することで、イメージング結果の品質が向上する。
- 従来の手法では、ビリオンを均一に分布させることが困難な場合がある。
- 本研究では、新しい試料調製法を導入する。
研究目的
- ウイルス粒子をガラス表面に接着させるための信頼性の高い手法を開発すること。
- AFMおよび超解像顕微鏡におけるイメージング品質を向上させること。
- 水疱性口炎ウイルスを用いて、本手法の有効性を実証すること。
使用した方法
- ビオチン化ポリエチレングリコールを用いたガラスカバースリップの洗浄およびコーティング。
- アビジンおよびウイルス特異的なビオチン化抗体による表面処理。
- 均一な液体分布を促進するためのカバースリップのサンドイッチ構造化。
- 清潔さを確保するための超音波洗浄およびリンス技術の使用。
主な結果
- イメージングのために、ビリオンをガラス表面に正常に固定することができた。
- 蛍光顕微鏡を用いることで、単一のビリオンを歪みを最小限に抑えてイメージングした。
- 本手法により、表面全体にビリオンを効果的に分散させることが実証された。
- 結果から、高解像度イメージングに向けた調製方法の有効性が確認された。
結論
- 開発された本手法は、ビリオンの接着における信頼性の高いアプローチを提供します。
- この技術により、顕微鏡観察アプリケーションにおけるイメージングの質が向上します。
- 今後の研究では、様々なウイルスイメージングアプリケーションに本手法を応用することが可能です。
よくある質問
産業上の重要性
本手法により、ウイルス粒子をガラス表面に制御された状態で均一に吸着させることが可能となり、ウイルスの構造や宿主との相互作用に関するメカニズム研究のための高解像度イメージングがサポートされます。サンプルの調製において再現性を確保することで、後続の生物物理学的アッセイにおけるばらつきが低減され、ターゲット検証やリード最適化に向けたデータの信頼性が向上します。本技術は、抗ウイルス薬探索プログラムに関連するエンベロープウイルスに適用可能です。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：ビリオンの形態と表面タンパク質の分布を直接的に可視化し、標的へのアクセス可能性およびエピトープの露出に関する知見を得ることができる。
- 運用的価値：同一のイメージング条件下で、野生型と変異型ビリオンを比較するための標準化されたプラットフォームを提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：蛍光読み取りを通じて、固定化されたビリオンへの抗体またはリガンドの結合を定量的に評価することを可能にします。
- 運用的価値：イメージング表面全体でのビリオンの凝集や配向バイアスを最小限に抑えることで、アッセイの均一性を維持します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：ビリオンの構造変化と、感染性や中和耐性などの機能的表現型との相関を明らかにできる。
- 運用的価値：一貫したサンプル調製を用いることで、前臨床モデルにおけるウイルス変異体の経時的な追跡が可能になる。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、構造および生物物理学的特性解析によってターゲット選定やリード化合物のスクリーニングに情報を与える、初期探索ワークフローに適しています。
- 探索生物学： 直接的なイメージングを通じて、ウイルスの侵入メカニズムおよび抗体介在性中和に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング： ハイコンテンツイメージングベースのスクリーニングキャンペーンに向けた、再現性の高いビリオンサンプルの調製を可能にします。
- 分析： 比較分析のための定量的形態測定データ（例：ビリオンの寸法）および蛍光強度測定値を生成します。
- トランスレーショナルリサーチ： イメージング中に本来の構造的特徴を保持することで、in vitroにおけるビリオンの挙動を前臨床での有効性と結びつけます。
- エンタープライズ再利用： 探索プログラムにおける複数のウイルス標的に適用可能な、適応性の高い表面化学プラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：調製に起因するアーティファクトを最小限に抑えることで、構造生物学アッセイにおける予測の信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：標準化された表面機能化により、異なる研究室やイメージング手法間での再現性を高めます。
- 戦略的価値：ビリオンの接着不良によるイメージングの失敗を減らし、装置の使用時間とサンプルリソースを節約します。
- ポートフォリオへの影響：早期の構造的リスク評価を可能にすることで、抗ウイルス薬開発プロジェクトにおける意思決定（go/no-go判断）の迅速化を実現します。
実施上の検討事項
- 表面化学および蛍光顕微鏡技術の専門知識が必要です。
- AFMおよび超解像イメージング設備の利用可能性に依存します。
- 多段階のアセンブリにおいて、活性面の向きを厳密に維持する必要があります。
- 非エンベロープウイルスに適応させる場合は、アンカリング化学の修正が必要になる場合があります。
- 保存期間に制限があるため（4°Cで最大3日間）、同一週内での実験計画が必要です。
