Name: フルーツフライで免疫染色でステロイド合成器官とそのインタラクティブ臓器を可視化するためのプロトコルキイロショウジョウバエ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 学ぶステロイド合成器官の免疫染色法で、Drosophila melanogasterの内分泌機構と神経支配を可視化する技術です。幼虫と成虫の dissecting プロトコルを詳細に解説し、昆虫のホルモン合成と発生制御の研究に応用できます。

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私たちは、この作品のために彼らの技術支援のため玲子喜瀬とTomotsune Amekuに感謝します。我々はまた圭伊藤、オルガ・アレックシーエンコ、明子琴、正幸三浦、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター、京都ストックセンター（DGRC）、および株式および試薬のための発達研究ハイブリドーマバンクに感謝しています。この作品は、日本学術振興会科研費助成金番号16K20945、内藤財団、井上科学研究賞からYSNへの助成金によってサポートされていました。文部科学省科研費助成金番号16H04792からRNへの助成金によって。

注：プロトコルの全体的なスキームを図1に示されています。 1.幼虫リング腺の解剖（RG） NOTE：Dで。 cyclorrhaphous双翅目に属するメラノは 、PGは、複合内分泌器官内リング腺（RG、 図2D）と呼ばれます。それはPGを外科的（後述する）他のタイプの細胞から分離されることが不可能であるため、実用的な目標は、解剖によって無傷の、無傷RGを単離することです。 <ol><li> 適切な発達段階での幼虫の準備 注： キイロショウジョウバエの幼虫の発達段階を同期させるために、狭い時間ウィンドウ内の卵を収集するために、適切なタイミングで幼虫を収集する必要があります。 <ol><li> 25℃でのグレープジュース寒天プレート上で2時間、卵を集めます。 </li><li>新たに孵化し収集1 <sup&gt; ST齢ピンセットで解剖顕微鏡の下で幼虫とマッシュポテト標準酵母/コーンミールフライ食品を含む小さなバイアルに移します。 注：幼虫の年齢は「卵は産卵後の時間（HAEL）」、「時間ハッチ後（ほら）」、または「L3の脱皮後の時間（hAL3E）」で表されます。 </li><li>適切な時点で、望ましくない負傷を避けるために、使い捨てのプラスチック製のループで上演幼虫を集めます。 第3齢幼虫の発達の進行の差を最小にするために、70 HAEL（48 HAH）における第2齢幼虫を収集し、それらを2時間間隔で脱皮することを可能にします。次いで、L3の脱皮後2時間以内に第3齢幼虫を集めます。この手順は、0-2 hAL3Eの幼虫を与えます。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で満たされたシャーレにステージング幼虫を転送します。 </li><li>身体から残留食べ物を取り除くためにPBSで幼虫をすすぎます。 </li></ol></li><li> 下の幼虫の粗解剖解剖顕微鏡<ol><li>ピンセットで幼虫の口のフックを保持します。マイクロはさみを使用して、本体の長さの前方三分の一で幼虫体を切断します。 </li><li>鉗子の1ペアで前幼虫体の切断端を持ちます。鉗子の他のペアを使用して、優しく体の内側に向かってヘッドの先端を押します。この手順は、裏返し幼虫の体を回します。 注：このステップでは、1 回目の齢幼虫の解剖のためにスキップすることができます。 </li><li>手順を繰り返して、1.2.1-1.2.2、追加の幼虫を5〜10分間。 注：幼虫の数は解剖のための時間を節約することが20以下でなければなりません。 </li></ol></li><li> 幼虫のフィレ解剖 注：このメソッドはそのまま残るために組織の位置を維持することができます。 <ol><li>わずか1時間水に幼虫を残します。幼虫は、窒息のために固定化されています。 </li><li>シリコンコーティングにPBSのドロップ幼虫の背側を上にして置きますその背側を上にして皿。 注：背側は、長手方向に延びる2本の気管チューブを持っています。 </li><li>解剖顕微鏡下で、ピンセットを用いて幼虫の前方先端部に虫ピンを挿入します。後方側に幼虫体を伸ばすと幼虫の後方先端部に第二のピンを置きます。 注：昆虫ピンに加えて、タングステンワイヤから製造された針21に有用であり得ます。針は、解剖針として使用するための加熱によってピペットチップに埋め込むことができます。 </li><li>解剖顕微鏡下で、マイクロハサミで尾の近くに小さな切開を行います。切開部から、頭部に向けて背側正中線に沿って縦方向に背側クチクラを切りました。キューティクルの下に組織を傷つけないように注意してください。 </li><li>各側の側板のキューティクルを伸ばし、解剖側板の各コーナーに4本のピンを配置します。 </li><li>脳-RG Cを露出させ、鉗子で前脂肪体の部分を削除します表面に露出することomplex。必要に応じて、唾液腺のペアを削除します。 </li></ol></li><li> 免疫組織化学と組織の固定および染色 <ol><li> 500μL定着液（PBS中の4％パラホルムアルデヒド）を充填した1.5 mLのマイクロチューブに幼虫体（ステップ1.2.2）の前方三分の一を置きます。そうでなければ固定したサンプルに付着PBSで固定液の好ましくない希釈を引き起こす可能性があり、一度に20個の未満のサンプルを固定します。フィレット解剖のために、PBSの滴を除去した後、定着液の液滴を加えます。 注：固定溶液は、3.7％ホルムアルデヒドを4％パラホルムアルデヒドのいずれかを使用することができます。 </li><li>室温（RT）で30分間定着液中に切開組織をインキュベートまたは代わりに4℃で2時間撹拌しました。 </li><li> 500μLPBSで定着液を交換し、すぐにサンプルを3回すすいでください。 Rにおけるロッカーに15分間、500μLの0.3％PBT（PBS + 0.3％オクチルフェノールエトキシレート）を有するサンプルを洗いますフィレット解剖についてT.、昆虫ピンを除去し、1.5 mLのマイクロチューブにサンプルを移します。 注：組織への抗体の浸透性を増大させるため、試料を室温でロッカー上で1〜2時間、500μL2.0％のPBTを用いて処理されます。 </li><li>溶液（PBT中の2％ウシ血清アルブミン）をブロック500μLとPBTを置き換えます。 RTでロッカー上で1.5時間試料をインキュベートします。 </li><li> 50μL一次抗体溶液、ブロッキング溶液で希釈したすなわち抗体によるブロッキング溶液を交換してください。 </li><li>一晩4℃でロッカー上のサンプルをインキュベートします。 </li><li> 500μLの0.3％PBT一次抗体溶液を交換し、迅速にサンプルを5回すすぎます。 RTでロッカー上で15分間、500μLの0.3％PBTで試料を3回洗浄します。 </li><li> 50μLの二次抗体溶液（ブロッキング溶液中に希釈した色素標識抗体）を用いて0.3％のPBTを置き換えます。核染色、0.5μL4&#39; のために、6-diamidino-2-フェニルインドール（DAPI、0.1mg / mlのストック溶液）、50μLの溶液に添加します。 RTでまたは代わりに一晩4℃で2時間ロッカー上でサンプルをインキュベートします。 注：暗闇の中でサンプルを保管してください。 </li><li> 500μL、0.3％のPBTと抗体溶液を交換し、5回すすいでください。 RTで15分間、500μLの0.3％PBTで試料を3回洗浄します。 </li></ol></li><li> PGを含むと取付脳-RG複合体の微細解剖 <ol><li> 0.3％PBTを充填した皿に免疫染色サンプルを転送するために、使い捨てピペットを使用します。 注：解剖および実装時に不便な泡を避けるために、0.3％のPBTは、PBSと交換することができます。 </li><li>解剖顕微鏡下では、鉗子の1ペアでキューティクルや口のフックを保持します。 「ナイフ」と1mlシリンジに取り付けた27 G針を使用して、身体のキューティクルから脳-RG眼ディスク複合体を除去するために、食道と眼ディスクの前方先端を切りました。 </li><li> SEPAピンセットで脳-RG-目のディスク複合体から食道と腸を評価。食道は、腹側神経索（VNC）上記脳を通過するので、後側に腸を引き出します。 注：ニードルナイフで脳、目のディスク、および脚のディスク間の接続を切り、サンプルから余分な成虫を削除するには。 </li><li>他のサンプルのための手順を1.5.1-1.5.4繰り返します。 注：0.3％PBT又はPBSで満たされた異なる清浄な皿に各完成サンプルを転送する、サンプルに付着する組織破片を防ぐために。 </li><li>マイクロピペットで清潔なガラススライドの中央にサンプルを転送します。 注：第2または第3齢幼虫の場合、マイクロピペットチップの端部は、かみそりの刃で切り捨てられるべきです。 </li><li>解剖顕微鏡下で、ピンセットを使用して、背側を上にして個々のサンプルを整列させます。 注：RGは、脳の背側に配置されている（ 図2A）。このアライメントは、撮像中の個々のサンプルの仕様を容易にします。 </li><li>ガラススライドを傾け、できるだけ多くの余分なPBTを拭き取ってください。スライドの側面に取り付けた試薬の液滴を入れてください。ドロップの反対側からカバースリップのエッジを置き、ピンセットでゆっくりとサンプルにカバースリップを置きます。 注：この手順では、カバーガラスの外に移動するからサンプルを防ぐことができます。 </li><li> 4°Cでサンプルを保管してください。暗闇の中でサンプルを保管してください。 </li></ol></li></ol> 2.卵巣の解剖で 大人の女性<ol><li> 成人女性の調製 <ol><li>フィードの女性は卵巣を太らせるために3〜4日間食べ物を飛ぶ標準酵母/コーンミールで飛びます。 25°Cで維持します。 </li></ol></li><li> 大人の女性の卵巣の解剖 <ol><li>女性は、CO 2ガスで飛んで麻酔し、頭を切り落としました。 </li><li> 3センチメートル皿にフライ体を転送PBSでいっぱい。 </li><li>解剖顕微鏡下で、ピンセットを用いて背側胸部を保持します。他の鉗子で腹部のセグメントA5またはA6をつかみ、後側に向かって腹部キューティクルの剥がれ。鉗子の先端から粘着性のキューティクルを拭き取ってください。 </li><li>卵管をピンチし、体内から卵巣を取り出します。 </li><li>櫛や鉗子で卵巣のヒントを広げます。 注：この操作は、免疫染色の効率を向上させることができます。 </li></ol></li><li> 大人の女性の脳、VNCや生殖器官の解剖。 注：この方法は、卵巣の神経支配はそのまま保持されることを可能にします。 <ol><li>女性は、CO 2ガスで麻酔ハエおよびPBSを充填したシリコンコーティング皿に移します。 </li><li>解剖顕微鏡下で、口吻を保持し、鉗子で脳が露出するようにヘッドキューティクルをはがします。脳に添付気管を削除します。 注：brainが白と丸みを帯びた構造です。脳は胸部にVNCに接続します。 </li><li>背側胸部を持ち、鉗子の1ペアで脚と翼を切り落としました。鉗子の他のペアを使用して、足の塩基から胸部腹キューティクルを剥がします。 VNCが露出されると、VNC使用鉗子に取り付けられた残留背側クチクラ及び筋肉を取り除きます。脳とVNCとの間の接続を傷つけないように注意してください。 </li><li>腹部キューティクルの剥がれや卵巣およびニューロンを含む彼らのインタラクティブな臓器、作物、消化管、卵管、子宮、およびアクセサリー腺を露出するために鉗子を使用してください。 </li><li>気管や鉗子を使用して体脂肪を含む残留組織を削除します。 </li></ol></li><li> 免疫組織化学と組織の固定および染色 <ol><li> 250μLの固定液（4％paraformaを充填した1.5 mLのマイクロチューブに卵巣の約8~10対を転送PBSでldehyde）とRTで30分間、サンプルをインキュベートします。 </li><li> 500μLPBSで定着液を交換し、すぐにサンプルを3回すすいでください。 </li><li> RTで5分毎にサンプルを500μLの0.1％PBTで2回洗浄します。 </li><li>ブロッキング溶液50μLとPBTを交換してください。 RTでロッカー上で1時間試料をインキュベートします。 </li><li> 50μL一次抗体溶液でブロッキング溶液を交換してください。 </li><li>一晩4℃でロッカー上のサンプルをインキュベートします。 </li><li> 500μLの0.1％PBT一次抗体溶液を置き換えます。 RTでロッカー上で15分間、500μLの0.1％PBTで試料を3回洗浄します。 </li><li> 50μLの二次抗体溶液と0.1％のPBTを置き換えます。核染色のために、50μLの溶液に0.5μLDAPIを追加します。 RTでロッカー上で2時間サンプルをインキュベートします。 </li><li> 500μLの0.1％PBTとの二次抗体溶液を置き換えます。 500μLの0.1％PBTで試料を3回洗浄<html> RTでロッカー上で15分間、。 注：洗浄操作は4℃で一晩行うことができます。暗闇の中でサンプルを保管してください。 </li></ol></li><li> スライドガラス上にサンプルをマウントします <ol><li>マイクロピペットを用いて、0.1％のPBTを用いてガラススライドにサンプルを移します。 注：解剖し、実装時の不便な気泡を回避するために、0.1％のPBTをPBSで置換することができます。 </li><li>卵巣のために、解剖顕微鏡下でピンセットで互いにovariolesの文字列を区切ります。 germariaを含むovariolesのヒントを傷つけないでください。脳-VNC-生殖器官の複雑なために、残留キューティクルを削除し、ガラススライド上の位置を配置します。 </li><li>できるだけ過剰PBTを拭き取り、サンプルの中心に取り付け試薬の滴を置きます。ゆっくりとピンセットを用いてカバースリップを置きます。 </li><li> 4°Cでサンプルを保管してください。暗闇の中でサンプルを保管してください。 </li></ol></li></ol>共焦点レーザー走査顕微鏡で「&gt; 3。イメージング<ol><li>顕微鏡でサンプルを観察し、視野内のステロイド産臓器をもたらします。ビューが固定されたら、画像取得モードに撮像システムを切り替えます。 注：10-20X対物レンズが脳-RG複合体や卵巣全体の画像を取得するために使用されています。あるいは、40-63X対物レンズ（水又は油浸）はGSCsまたはPGおよび卵巣のニューロンの神経支配中のタンパク質の細胞内局在を可視化するために使用されます。 </li><li>付属のソフトウェアでの画像取得のパラメータを設定します。蛍光（ 例えば GFPおよびRFP）の組み合わせを選択します。高速走査手順によって、レーザパワー、検出器の感度（ゲイン/オフセット）、及びピンホールの大きさを調整します。 注記：高品質の画像を取得するために、走査レーザパワーと検出器（ゲイン）の感度は、各サンプルのために最適化されなければなりません。形状の概要を説明するために、組織を、透過光画像は蛍光画像に加えて取ることができます。 </li><li>画像のZスタックを取ります。連続高速走査中に、顕微鏡のフォーカス駆動と焦点面を移動させ、開始位置と終了位置を設定します。スライスの数とスライス間の間隔距離は、それに応じて調整されます。 </li><li>スキャン速度、スキャン方法、および双方向スキャンモードを選択します。 </li><li>画像取得のための「本当のスキャンを開始します」。 </li><li>付属ソフトの形式で画像を保存します。 注：元の画像ファイルは、画像取得パラメータおよびスケールの情報が含まれています。エクスポートされた画像は、コンピュータ22上で画像処理ソフトウェアを用いて処理することができます。 </li></ol>

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</ol>

利害の衝突は宣言されていません。

私たちは、エクジステロイド生合成およびキイロショウジョウバエにおけるその調節機構を研究し、そして解剖および免疫染色のためのプロトコルを考案しました。エクジステロイド生合成のタイミングは、ニューロンの入力33を介して、環境手がかりに影響されるので、解剖時の脳、VNC、および他の組織と一緒にecdysteroidogenic器官の神経支配を維持するために不可欠です。 上述したように、 キイロショウジョウバエ PGはコーパスallata（CA）と複合内分泌器官RGとコーパスcardiaca（CC）（ 図2D）を形成します。 PGは、エクジステロイドを生成しながら、CAおよびCCは、それぞれ、幼若ホルモン及びadipokineticホルモンを産生します。この解剖学的特性はDでecdysteroidogenesisを研究、研究者への障害となってきました。 ショウジョウバエ 、他の昆虫に比べて。しか...

多細胞生物では、細胞の集団は、体全体のために不可欠である彼らの生体活動の専門機能に恵まれています。その任務を果たすために、各組織または器官は、それらの機能に関連する遺伝子のシリーズを発現し、開発のコンテキスト内でそれらの活性を編成するために他の組織と通信します。このような特殊な細胞機能およびインター器官相互作用を特徴づけるために、我々は、細胞の他のタイプの多アーキテクチャにそのまま保持されると共にセルのグループを指定する必要があります。 そのような特殊な器官の一例は、多くの生合成酵素が活性ステロイドホルモン1にコレステロールから変換ステップを仲介ステロイド産生器官です。これらの酵素の遺伝子のほとんどは、特にステロイドの器官で発現され、生合成経路がしっかり体液入力とニューロンの入力を介して多くの外部刺激により調節されます。一度合成、ステロイドホルモンは、体液中に分泌され、遺伝子2の種々の発現を調節するため、多くの組織および器官を標的とします。したがって、ステロイドホルモンの作用は、恒常性、成長、および再生を維持するためのシステム応答を誘導します。 ステロイドホルモン生合成の機能及びステロイドホルモンの多面的な行動を調査するために、 キイロショウジョウバエは、適切なモデル系として利用することができます。幼虫の段階では、昆虫ステロイドホルモン、エクジステロイドは、専門的な内分泌器官で生合成される前胸腺（PG）3と呼ばれます。 PGでは、いくつかのecdysteroidogenic酵素は、具体的には、適切な発達段階4に脱皮および変態制御する、エクジソンにコレステロールから複数の変換ステップを触媒します。したがって、エクジステロイド力価の動的変化が規制されています環境合図に応答して、多くのシグナル伝達経路によって。一方、成人の段階では、エクジステロイドは、再生、睡眠、メモリ、および寿命5、6、7、8を含む生理学における重要な役割を果たしています。エクジステロイドが積極卵形成6、7、8、9、10、11の進行を調節する、卵巣で生合成されることが知られています。最近では、生殖細胞系列幹細胞（GSCs）の数が12を刺激交配に応じて、エクジステロイドとのセックスペプチドのシグナル伝達に影響されることを報告しています。 よく注釈付きゲノム情報を含むキイロショウジョウバエ遺伝学および細胞生物学の強力なツール、バイナリ遺伝子発現系、およびトランスジェニックのRNAi技術は、PGおよび卵巣13、14、15で生合成をエクジステロイドために不可欠な遺伝子を同定するために私たちを有効にしています。 ecdysteroidogenic遺伝子が同定されたら、これらの遺伝子の転写調節および遺伝子産物の動的局在は、生合成経路16で検査することができます。この目的のために、定量的逆転写PCR、in situハイブリダイゼーション RNA、及び免疫組織学的分析が行われます。これらの技術の適用は、困難なタスクを含みます。 PGまたは卵巣の精巧な解剖。 1は、果物のサンプリングのために解剖を飛ぶの重要なスキルを練習する必要があるので、特に、ショウジョウバエのPGは、他の昆虫（ 例えばカイコとクロバエ）に比べて相対的に小さいです。さらに、両方のecdysteroidogenic器官は神経支配を受けます中枢神経系（CNS）17、18、19、20秒から。したがって、正確な解剖学的な分析のために、ecdysteroidogenic器官は彼らの神経接続を破壊しない、CNSおよび他の器官と一緒にそのまま保持されなければなりません。 ここでは、Dにおけるステロイド産生器官の解剖と可視化のためのプロトコルを提供します。 ショウジョウバエ。解剖の技術を学ぶことはこれらの実験のための重要な出発点です。また、1が正常にいくつかの抗体とGAL4ドライバーラインとステロイド産生臓器並びにそれらのインタラクティブな器官にラベルを付けることができます。これらの技術、材料、および遺伝学を利用して、一つはステロイドホルモンの生合成の総合的なメカニズムを研究することができます。

<table><tbody><tr><td><ストロング>エッグコレクション</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ティッシュ培養ディッシュ(55mm)</td><td>AS ONE</td><td>1-8549-02</td><td>&nbsp;ぶどう果汁寒天プレート</td></tr><tr><td>用コレクションカップ</td><td>光化学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母ペースト</td><td>オリエンタルドライイースト、東京</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ぶどう果汁100%</td><td>ウェルチ食品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>飼育幼虫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小さなバイアル(12ml、40回;23.5 mm、PS)</td><td>SARSTEDT</td><td>58.487</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てループ</td><td>AS ONE</td><td>6-488-01</td><td></td></tr><tr><td>標準フライフード</td><td></td><td></td><td>&nbsp;Blooingtonストックセンターのウェブサイトで私たちをレcepi。</td></tr><tr><td>解剖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td>ステミ 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>S8 AP0</td><td></td></tr><tr><td>組織培養皿 (35×10mm, 未処理)</td> <td>岩城</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>シルガード</td><td>東レ</td><td></td><td>石炭シリコン 皿内</td></tr><tr><td>テルモ針 (27G,0.40 x 19 mm)&nbsp;</td><td>テルモ</td><td>NN-2719S</td> 組織鉗子<td>を切る「ナイフ」</td></tr><tr><td>イノックス #5</td><td>デュモン</td><td></td><td></td></tr> スイス <tr><td>昆虫ピン (直径0.18mm)</td>滋賀 <td>フィレット解剖</td>用マイクロハサミ <td>滋賀ブランド</td><td></td></tr><tr><td></td><td>夏目製作所</td><td>MB-50-10</td><td></td></tr><tr><td>fixation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultra純水</td><td>メルク ミリポア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>ナカライ テスク</td><td>16222-65</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>ナカライ テスク</td><td>02890-45</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (1.5 ml)</td><td>INA OPTIKA</td><td>CF-0150</td><td></td></tr><tr><td>Incubation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>As one swist mixer TM-300 (rocker)</td><td>As one</td><td>TM-300</td><td>rocker</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>primary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗SRO(モルモット)、1:1000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗GFP(ウサギ)、1:1000</td><td>Molecular Probes</td><td>A6455</td><td>島田丹羽、丹羽、2014</td></tr><tr><td>抗GFP(マウスmAb、GF200)、1:100</td><td>中来テスク</td><td>04363-66</td><td></td></tr><tr><td>抗5HT(ウサギ)、1:500</td><td>SIGMA</td><td>S5545</td><td></td></tr><tr><td>anti-Hts 1B1(マウス)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>1B1</td><td></td></tr><tr><td>抗DE-カドヘリン(ラット)、1:20</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td></td></tr><tr><td>抗nc82(マウス)、1:50</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 488コンジュゲート</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 488コンジュゲート</td>Life <td>Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ラットIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 546コンジュゲート</td><td>Life Technologies</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗モルモットIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 555コンジュゲート</td>Life <td>Technologies</td><td>A-21435</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546色素標識ファロイジン</td><td>ライフ技術紹介</td><td>A-22283</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>マウント試薬</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロスライドガラス</td><td>松波硝子工業</td><td>SS7213</td><td></td></tr><tr><td>角型顕微鏡カバーガラス</td><td>松波ガラス工業</td><td></td><td></td>C218181</tr><tr><td>FluorSave試薬(マウンティング試薬)</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット 1 ml (ディスポーザブルスポイト)</td><td>WATSON</td><td>5660-222-1S</td><td></td></tr><tr><td>imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700レーザー走査型顕微鏡システム</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>倒立Axioオブザーバー。Z1 SP left</td></tr><tr><td>image processing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>これは、64 ビットの Microsoft Windows7 オペレーティング システム</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr>w に基づく特別なユーザー インターフェイス<tr><td>です。GMR45C06-GAL4</td><td></td><td></td><td>&nbsp;ブルーミントンショウジョウバエストックセンターから。(#46260)</td></tr><tr><td>UAS&ndash;GFPです。UAS&ndash;mCD8::GFP</td><td></td><td></td><td>gifts(東京大学伊藤和彦さんより)</td></tr><tr><td>w[1118]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; ファントム-GAL4#22/UAS-turboRFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w;UAS-mCD8::GFP;TRH-GAL4</td><td></td><td></td>は<td>Ref29、Alekseyenko、O.V、Lee、C.&を参照してください。クラヴィッツ、EA(2010)</td></tr><tr><td>w;UAS-mCD8::GFP</td><td></td><td></td><td>&nbsp;ブルーミントンショウジョウバエストックセンターから。(#32188)</td></tr><tr><td>yw;; nSyb-GAL4</td><td></td><td></td><td>&nbsp;ブルーミントンショウジョウバエストックセンターから。(#51941)</td></tr></tbody></table>

フルーツフライで免疫染色でステロイド合成器官とそのインタラクティブ臓器を可視化するためのプロトコル<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

多細胞生物では、細胞の小グループは、成長と再生への全身応答を誘導する、その生物起源の活動の専門機能に恵まれています。昆虫で、幼虫の前胸腺（PG）と、成人女性の卵巣プレイエクジステロイドと呼ばれる主要なステロイドホルモンの生合成における重要な役割。これらのecdysteroidogenic器官は生合成のタイミングは、環境手がかりに影響され、それを通して神経系から神経支配されています。ここでは、ステロイドホルモンの生合成とその調節機構を研究するための適切なモデルシステムを提供キイロショウジョウバエを 、飛ぶecdysteroidogenic臓器や幼虫でのインタラクティブな臓器や果物の大人を可視化するためのプロトコルを記述します。巧みな解剖は、私たちは脳、腹側神経索、および他の組織を含むecdysteroidogenic臓器とそのインタラクティブな臓器の位置を維持することができます。を用いた免疫染色ecdysteroidogenic酵素に対するntibodiesは、組織特異的プロモーターにより駆動されるトランスジェニック蛍光タンパク質と共に、ecdysteroidogenic細胞を標識するために利用可能です。また、ecdysteroidogenic器官の神経支配はまた、特異的抗体又はニューロンの様々なタイプのGAL4ドライバーの集合によって標識することができます。したがって、ecdysteroidogenic器官およびそれらの神経接続は、免疫染色およびトランスジェニック技術によって同時に可視化することができます。最後に、我々は、その増殖とメンテナンスエクジステロイドによって制御されている生殖細胞系列幹細胞を、視覚化する方法について説明します。この方法は、ステロイドホルモンの生合成とその神経調節機構の総合的な理解に貢献しています。

私たちは、ステロイド産生器官やキイロショウジョウバエの幼虫と大人の女性で彼らのインタラクティブな臓器を可視化するために上記のプロトコルを使用していました。プロトコルの全体的なスキームを図1に示されています。 PG（ 図2D）を含むRGは、脳よりも小さく、より透明であり、脳（ 図2A-C及び図3-E）の前方、背側に位置しています。 PG細胞を標識するために、いくつかのグループがecdysteroidogenic酵素（ すなわち 、ネバーランド23、24 Spookier、シュラウド20、ファントム25、肉体25、及びシャドウ26）に対する抗体の様々なタイプを生成しました。これらの...

私たちは、解剖、固定、およびステロイドホルモンの生合成とその調節機構を研究するために、ショウジョウバエの幼虫と大人の女性のステロイド産生器官の免疫染色のためのプロトコルを記述します。ステロイド産生臓器に加えて、我々は、ステロイド産生器官の神経支配並びにそのような生殖細胞系列幹細胞のようなステロイド産生標的細胞を可視化します。

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

本手順の総合的な目的は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の幼虫または成体雌におけるステロイド合成器官およびそれらと相互作用する器官を可視化することです。この手法は、昆虫のステロイドホルモン生合成や、交尾および変態の背景にある神経調節メカニズムの理解に役立ちます。本技術の主な利点は、ステロイド合成器官への神経支配および相互作用する器官の相対的な部分が維持されることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、ショウジョウバエ幼虫のステロイド合成器官が非常に小さく透明であるため、苦労されることと思います。そこで、私と私の研究室が実施している解剖プロトコルを共有させていただきます。それでは、始めていきましょう。幼虫の準備が完了したら、PBSを満たした3 cmのディッシュ内で、解剖顕微鏡を用いて粗解剖を開始します。まず、ピンセットで口鉤を固定します。次に、マイクロシザーを用いて、前方端から長さの約3分の1の位置で体を切断します。次に、1組のピンセットで前方を保持し、もう1組のピンセットを使用して頭部先端を体内にゆっくりと押し込み、最終的に幼虫の体を裏返します。この方法で最大20匹の幼虫を10分以内に準備し、固定液に転送します。30分後、準備したサンプルを洗浄し、免疫染色の工程に進みます。まず、幼虫を水に約1時間浸し、窒息させて不動化させます。次に、シリコンコーティングされたディッシュ上のPBSの一滴に、幼虫を背側が上になるように置きます。背側には2本の気管管があります。解剖顕微鏡下で、ピンセットを用いて昆虫ピンを前方端に刺します。次に、体を後方へ伸ばし、2本目のピンを後方端に刺します。続いて、マイクロ鋏を用いて尾の近くに小さな切開を加えます。切開口から、背面の正中線に沿って頭部方向へ背側クチクラを慎重に縦方向に切り込みますが、クチクラ下の組織を傷つけないように注意してください。切開後、体壁を左右に広げ、四隅を昆虫ピンで固定します。次に、ピンセットを用いて前方の脂肪体と唾液腺を除去し、表面にある脳・環状腺複合体を露出させます。次に、PBSを吸引し、試料を固定液に浸します。30分後、ピンセットを用いて昆虫ピンを取り除き、試料を0.3% PBTを満たしたマイクロチューブに移します。その後、免疫染色の工程に進みます。幼虫の免疫染色後、使い捨てピペットを用いてサンプルを0.3% PBTを満たしたディッシュに移します。解剖顕微鏡下で、ピンセットでキューティクルまたは口鉤を固定します。次に、1 mLシリンジに取り付けた27ゲージの針をナイフのように使い、食道の先端部と眼ディスクを切り離すことで、脳・環状腺・眼ディスク複合体を体壁のキューティクルから摘出します。次に、ピンセットを用いて、食道と腸を脳・環状腺・眼原基複合体から注意深く分離します。食道は腹側神経索の上方で脳を通過しているため、腸を後方へ引き出します。最後に、脳・環状腺複合体を単離するため、針ナイフを用いて、脳原基、眼原基、および脚原基の間の接続部を注意深く切断します。解剖の際は、エッジの鋭い精密ピンセットを使用することが非常に重要です。ピンセットの先端に隙間がないよう、砥石を用いて研いでおくことを強く推奨します。サンプルの転送には、広口チップを装着したマイクロピペットを使用してください。サンプルをガラススライドの中央に配置します。次に、ピンセットを使用してサンプルを腹側にして配置し、脳の背側に位置する環状腺をイメージングできるようにします。その後、スライドを傾け、余分なPBTをできるだけ拭き取ります。次に、サンプルの近くに封入剤を1滴滴下し、ピンセットを使用してカバーガラスを封入剤の上に、次いでサンプルの上にゆっくりと下ろします。成虫雌の卵巣を解剖するには、二酸化炭素ガスでハエを麻酔させます。その後、頭部を切断し、体をPBSを満たした3 cmのディッシュに移します。次に、実体顕微鏡下で、ピンセットで胸部の背面を掴み、別のピンセットで腹部第5または第6節（A-5またはA-6）を保持します。その後、腹部の角質層を後方に向かって剥がします。次の手順に進む前に、ピンセットに付着した粘着性のある角質層を取り除いてください。次に、輸卵管をピンチし、卵巣を分離します。その後、ピンセットを用いて卵巣の先端部分をほぐして広げます。広げた後、染色準備のため、卵巣を固定液に30分間浸します。卵巣の神経支配を維持した標本を作成するには、麻酔をかけた雌 flies を PBS で満たしたシリコンコートディッシュに移します。解剖顕微鏡下で口吻を保持し、頭部クチクラを剥がして脳を露出させます。脳から付着している気管を除去し、脳と腹側神経索が接続したままの状態にします。次に、胸部の背側を持ち、脚と翅を除去します。続いて、各脚の付け根から胸部の腹側クチクラを剥がします。VNCが露出したら、ピンセットを用いて、VNCに付着している残りの背側クチクラと筋肉を非常に慎重に取り除きます。脳とVNCの間の接続箇所を傷つけないように注意してください。次に、ピンセットを使用して腹部のクチクラを剥離し、卵巣および、プロップ、腸、輸卵管、子宮、付属腺を含む関連器官を露出させます。最後に、気管や脂肪体を含む残りの組織を取り除きます。次に、免疫染色の準備として、サンプルを固定液に30分間浸します。免疫染色後、マイクロピペットを用いてサンプルを0.1% PBTが入ったガラススライドへ移します。その後、顕微鏡でスライドを観察し、ピンセットを使用して卵巣小管の鎖をそれぞれ分離します。この工程では、卵巣小管の先端を傷つけないように注意してください。そこには卵巣前部が含まれています。脳から生殖器官に至る複合体を準備する際は、残留している角皮を取り除き、スライド上で構造を展開させてください。次に、過剰なPBTの大部分を拭き取り、サンプルに封入剤を1滴滴下します。続いて、ピンセットを用いてカバーガラスをスライド上にゆっくりと載せ、スライドを4 °Cの暗所で保存します。その後、顕微鏡下でサンプルを観察し、ステロイド生成器官を視野に入れます。視野が固定されたら、イメージングシステムを画像取得モードに切り替えます。幼虫期において、前胸腺はanti-shroud抗体を含むエクジステロイド合成酵素に対する抗体で標識されました。前胸腺と脳の間の神経接続を可視化するため、脳・環状腺複合体を解剖しました。フィレ解剖法により前胃神経系が示されており、そこではセロトニン作動性ニューロン群が前胸腺、前胃、および咽頭筋に投射しています。成体雌では、卵巣のエクジステロイドがGSCの増殖など、卵形成の多くの側面に影響を与えます。GSCは、卵巣内の各卵巣小管の先端にある生殖巣にある。germarium内において、GSCを1B1およびDE-cadherinの2種類の抗体を用いて特異的に標識しました。卵巣の神経支配を視覚化するため、脳、VNC、腸、prop、子宮、および受精嚢とともに卵巣を摘出しました。ニューロンは、n-Synaptobrevin GAL4ドライバーの制御下にあるmCD8:GFPによって視覚化しました。さらに、筋肉の構造をジコンジュゲート・ファロイジンを用いて染色しました。ステロイド合成器官の解剖は、最初は難しく感じられるかもしれませんが、この動画で組織の切断箇所を確認することで、器官を損傷させることなくより容易に単離できるようになります。本プロトコルが、初心者の方はもちろん、経験豊富な研究者の方々にとっても有益な情報となることを願っております。この手順を習得すれば、ご自身の研究に応用し、ニーズに合わせて調整することが可能です。本プロトコルが、ステロイドホルモン生合成の包括的な理解に役立つことを願っております。より詳細なステップバイステップのプロトコルは、原著論文でご確認いただけます。ご確認ください。

protocols-for-visualizing-steroidogenic-organs-their-interactive

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

開発時にどのようにニッチと幹細胞の形態は、実用的な意味を持つ重要な問題です。の...

の解剖と染色ショウジョウバエ幼虫卵巣

の幼虫や蛹に振動や音響に反応する臓器を免疫染色し、可視化する方法...

でProprioceptorsの可視化<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫および蛹

このビデオでは、エクジステロイドや他のホルモンの生合成と分泌に重要な複雑な内分泌構造であるショウジョウバエの輪腺について説明しています。注目のプロトコールは、その解剖、固定、および免疫染色を示しています。...

幼虫の輪腺解剖:ショウジョウバエからの発生性内分泌器官の分離

このビデオは、突然変異したショウジョウバエの脳のキノコ体の表現型欠損を視覚化するための詳細な免疫染色プロトコルを示しています。このプロトコルには、キノコ体の適切な形態学的および機能的発達を促進する軸索誘導に関与するタンパク質であるFas2に対する抗体を使用することが含まれます。...

免疫染色によるショウジョウバエ脳のキノコ体ニューロンの可視化

免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。...

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

ショウジョウバエの成体構造は、虚数円盤と呼ばれる袋のような構造に由来します。これらのディスクの解析により、組織決定、コンパートメント境界の確立、細胞増殖、細胞運命の仕様、平面細胞の極性など、多くの発生過程に関する洞察が得られます。このプロトコールは、光/蛍光顕微鏡用の架空ディスクを調製するために使用されます。...

解剖や成虫の免疫染色からキイロショウジョウバエ

このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。...

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

ショウジョウバエ卵巣は、幹細胞ニッチの開発を研究するためのエクセレント モデル...

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

我々は、同焦点顕微鏡に適し、また再現可能で信頼性の高い標識を可能にする 、ショウジョウバエ...

大精子細胞の3D共焦点解析のための全山 ショウジョウバエ 精巣の免疫染色

初期のショウジョウバエの胚では、多くの細胞小器官は運動性である。原則として、それらは特定の蛍光プローブを介して生きたまま画像化することができるが、卵殻は胚への直接適用を妨げる。このプロトコルは、マイクロインジェクションを介してそのようなプローブを導入し、次いで粒子画像速度測定を介してバルクオルガネラ運動を分析する方法を記述している。...

ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

学ぶステロイド合成器官の免疫染色法で、Drosophila melanogasterの内分泌機構と神経支配を可視化する技術です。幼虫と成虫の dissecting プロトコルを詳細に解説し、昆虫のホルモン合成と発生制御の研究に応用できます。

フルーツフライで免疫染色でステロイド合成器官とそのインタラクティブ臓器を可視化するためのプロトコル

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