フルーツフライで免疫染色でステロイド合成器官とそのインタラクティブ臓器を可視化するためのプロトコルキイロショウジョウバエ

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエ、Drosophila melanogasterの幼虫または成虫の雌のステロイド産生器官とその相互作用器官を視覚化することです。この方法は、昆虫のステロイドホルモンの生合成、および交配と変態の根底にあるニューロン制御メカニズムを理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、ステロイド産生器官の神経支配とそれらの相互作用器官の相対部分が無傷のままであることです。

一般的に、この方法に不慣れな個体は、ハエの幼虫のステロイド産生器官が非常に小さく透明であるため、苦労します。私の研究室と私は、解剖プロトコルを共有できることを嬉しく思います。それでは、始めましょう。

幼虫を準備した後、PBSで満たされた3センチメートルの皿で、解剖顕微鏡下でコース解剖を開始します。まずは鉗子でマウスフックを握ります。次に、マイクロハサミを使用して、前方の先端から約3分の1の長さで体を切断します。

次に、1対の鉗子で前長を保持し、2番目のペアを使用して頭の先端を体にそっと押し込み、最終的に幼虫の体を裏返しにします。この方法で10分以内に最大20匹の幼虫を調製し、それらを固定液に移します。30分後、調製物を洗浄し、免疫染色を進めます。

まず、幼虫を約1時間水に浸したままにして、幼虫を窒息させ、動けなくします。次に、幼虫の背側を上にして、シリコンコーティングされた皿の上のPBSの滴に置きます。背側には2本の気管チューブがあります。

解剖顕微鏡で、鉗子を使用して昆虫ピンを前部の先端に挿入します。次に、ボディを後側に伸ばし、2番目のピンを後端に挿入します。次に、マイクロハサミを使用して尾の近くに小さな切開を行います。

切開部から、背側のキューティクルを背側の正中線に沿って頭に向かって縦方向に慎重に切り取りますが、キューティクルの下の組織に損傷を与えないようにします。切開後、体壁を伸ばし、角を虫ピンで固定します。次に、鉗子を使用して、前部脂肪体と唾液腺を取り除き、表面の脳環腺複合体を露出させます。

次に、PBSを吸引し、調製物を固定液に浸します。30分後、鉗子を使用して昆虫ピンを取り外し、0.3%PBTで満たされたマイクロチューブに調製物を移します。その後、免疫染色を進めます。

幼虫を免疫染色した後、使い捨てピペットを使用して、0.3%PBTで満たされた皿にサンプルを移します。解剖顕微鏡で、キューティクルまたはマウスフックを1対の鉗子でつかみます。次に、1ミリリットルの注射器に取り付けられた27ゲージの針をナイフのように使用して、食道と眼椎間板の前端を切り取ることにより、脳輪腺の眼椎間板複合体を体のキューティクルから取り除きます。

次に、鉗子を使用して、食道と腸を脳輪腺の眼椎間板複合体から慎重に分離します。食道は腹側神経索の上の脳を通過するため、腸を後側に引き出します。最後に、脳環腺複合体を分離するために、ニードルナイフで脳椎間板、眼椎間板、脚椎間板の間の接続部を慎重に切断します。

解剖時には、鋭いエッジを持つ細かい鉗子を使用することが非常に重要です。鉗子を砥石で研ぎ、隙間なく鉗子の端をまとめることを強くお勧めします。サンプルを移すには、先端が広い口径のマイクロピペットを使用します。

サンプルをスライドガラスの中央に堆積させます。次に、鉗子を使用してサンプルを腹側に配置し、脳の背側にあるリング腺を画像化できるようにします。次に、スライドを傾けて、余分なPBTをできるだけ拭き取ります。

次に、サンプルの近くにマウント試薬を滴下し、鉗子を使用して試薬の上にカバースリップをゆっくりと下げ、次にサンプルの上に下げます。成体の女性の卵巣を解剖するために、ハエを二酸化炭素ガスで麻酔します。次に、頭を切り落とし、PBSで満たされた3センチの皿に体を移します。

次に、解剖顕微鏡で胸部の背側を鉗子でつかみ、2対目の鉗子で腹部セグメントA-5またはA-6をつかみます。次に、腹部のキューティクルを後側に向けて剥がします。先に進む前に、鉗子から粘着性のあるキューティクルをきれいにします。

次に、卵管をつまんで、卵巣を分離します。次に、鉗子を使用して卵巣の先端をとかして広げます。広げたら、卵巣を固定液に30分間浸し、染色の準備

卵巣の神経支配を維持する製剤を作るために、麻酔をかけた雌のハエをPBSで満たされたシリコーンコーティングされた皿に移します。解剖顕微鏡で吻をつかみ、頭のキューティクルを剥がして脳を露出させます。脳から、付着した気管を取り外し、脳を腹側神経索に接続したままにします。

次に、胸部を背側で保持し、脚と翼を取り外します。次に、各脚の付け根から始めて、胸部の腹側キューティクルをはがします。VNCが露出したら、鉗子を使用して、VNCに付着している残りの背側キューティクルと筋肉を非常に慎重に取り除きます。

脳とVNCの間の接続を損傷しないでください。次に、鉗子を使用して腹部のキューティクルを剥がし、卵巣と、支柱、腸、卵管、子宮、副腺などの相互作用器官を露出させます。最後に、気管や脂肪体などの残留組織をすべて取り除きます。

次に、サンプルを固定液に30分間浸漬し、免疫染色のために調製します。免疫染色後、マイクロピペットを使用してサンプルを0.1%PBTのスライドガラスに移します。次に、スライドを顕微鏡で観察し、鉗子を使用して卵巣の弦を互いに分離します。

このプロセス中に卵巣の先端を傷つけないでください。彼らは細菌を含んでいます。脳を生殖器官複合体に整頓するときは、残っているキューティクルを取り除き、構造をスライド上に広げます。

次に、余分なPBTの大部分を拭き取り、サンプルに一滴のマウント試薬を塗布します。次に、鉗子を使用してカバースリップをスライドにゆっくりと置き、スライドを摂氏4度で暗闇に保管します。その後、顕微鏡でサンプルを観察し、ステロイド産生器官を視野に入れます。

ビューが固定されたら、イメージングシステムを画像取得モードに切り替えます。幼虫期には、前胸腺に、抗シュラウド抗体を含むエクジステロイド産生酵素に対する抗体を標識しました。前胸腺と脳との間のニューロンのつながりを視覚化するために、脳輪腺複合体を解剖しました。

フィレ解剖法は、セロトニン作動性ニューロンのグループが前胸腺、前胸部、および咽頭筋に投射する胃気孔神経系を示しています。成人女性では、卵巣エクスジステロイドは、GSC増殖などの卵形成の多くの側面に影響を及ぼします。GSCは、卵巣の各卵巣の先端にあるゲルマリウムにあります。

ゲルマリウム内では、GSCは2つの抗体、1B1、およびDE-カドヘリンを使用して特異的に標識されました。卵巣の神経支配を視覚化するために、卵巣、脳、VNC、腸、支柱、子宮、精子とともに解剖されました。ニューロンは、n-Synaptobrevin GAL4ドライバーの制御下でmCD8:GFPによって視覚化されました。

さらに、筋肉の構造は、ジコンジュゲートファロイジンを使用して染色されました。ステロイド産生臓器の解剖は、最初は難しく感じるかもしれませんが、この動画を使って組織の切断点を学び、傷つけずに臓器をより簡単に分離することができます。私たちのプロトコールが、初心者だけでなく、経験豊富な研究者にとっても有益なものになることを願っています。

マスターすれば、この手順を研究に適用し、ニーズに合わせてブラッシュアップすることができます。このプロトコルがステロイドホルモンの生合成の包括的な理解に役立つことを願っています。より詳細なステップバイステップのプロトコールは、原稿に記載されています。

ぜひチェックしてみてください。