フルーツフライで免疫染色でステロイド合成器官とそのインタラクティブ臓器を可視化するためのプロトコル

本手順の総合的な目的は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の幼虫または成体雌におけるステロイド合成器官およびそれらと相互作用する器官を可視化することです。この手法は、昆虫のステロイドホルモン生合成や、交尾および変態の背景にある神経調節メカニズムの理解に役立ちます。本技術の主な利点は、ステロイド合成器官への神経支配および相互作用する器官の相対的な部分が維持されることです。

一般的に、この手法に不慣れな方は、ショウジョウバエ幼虫のステロイド合成器官が非常に小さく透明であるため、苦労されることと思います。そこで、私と私の研究室が実施している解剖プロトコルを共有させていただきます。それでは、始めていきましょう。

幼虫の準備が完了したら、PBSを満たした3 cmのディッシュ内で、解剖顕微鏡を用いて粗解剖を開始します。まず、ピンセットで口鉤を固定します。次に、マイクロシザーを用いて、前方端から長さの約3分の1の位置で体を切断します。

次に、1組のピンセットで前方を保持し、もう1組のピンセットを使用して頭部先端を体内にゆっくりと押し込み、最終的に幼虫の体を裏返します。この方法で最大20匹の幼虫を10分以内に準備し、固定液に転送します。30分後、準備したサンプルを洗浄し、免疫染色の工程に進みます。

まず、幼虫を水に約1時間浸し、窒息させて不動化させます。次に、シリコンコーティングされたディッシュ上のPBSの一滴に、幼虫を背側が上になるように置きます。背側には2本の気管管があります。

解剖顕微鏡下で、ピンセットを用いて昆虫ピンを前方端に刺します。次に、体を後方へ伸ばし、2本目のピンを後方端に刺します。続いて、マイクロ鋏を用いて尾の近くに小さな切開を加えます。

切開口から、背面の正中線に沿って頭部方向へ背側クチクラを慎重に縦方向に切り込みますが、クチクラ下の組織を傷つけないように注意してください。切開後、体壁を左右に広げ、四隅を昆虫ピンで固定します。次に、ピンセットを用いて前方の脂肪体と唾液腺を除去し、表面にある脳・環状腺複合体を露出させます。

次に、PBSを吸引し、試料を固定液に浸します。30分後、ピンセットを用いて昆虫ピンを取り除き、試料を0.3% PBTを満たしたマイクロチューブに移します。その後、免疫染色の工程に進みます。

幼虫の免疫染色後、使い捨てピペットを用いてサンプルを0.3% PBTを満たしたディッシュに移します。解剖顕微鏡下で、ピンセットでキューティクルまたは口鉤を固定します。次に、1 mLシリンジに取り付けた27ゲージの針をナイフのように使い、食道の先端部と眼ディスクを切り離すことで、脳・環状腺・眼ディスク複合体を体壁のキューティクルから摘出します。

次に、ピンセットを用いて、食道と腸を脳・環状腺・眼原基複合体から注意深く分離します。食道は腹側神経索の上方で脳を通過しているため、腸を後方へ引き出します。最後に、脳・環状腺複合体を単離するため、針ナイフを用いて、脳原基、眼原基、および脚原基の間の接続部を注意深く切断します。

解剖の際は、エッジの鋭い精密ピンセットを使用することが非常に重要です。ピンセットの先端に隙間がないよう、砥石を用いて研いでおくことを強く推奨します。サンプルの転送には、広口チップを装着したマイクロピペットを使用してください。

サンプルをガラススライドの中央に配置します。次に、ピンセットを使用してサンプルを腹側にして配置し、脳の背側に位置する環状腺をイメージングできるようにします。その後、スライドを傾け、余分なPBTをできるだけ拭き取ります。

次に、サンプルの近くに封入剤を1滴滴下し、ピンセットを使用してカバーガラスを封入剤の上に、次いでサンプルの上にゆっくりと下ろします。成虫雌の卵巣を解剖するには、二酸化炭素ガスでハエを麻酔させます。その後、頭部を切断し、体をPBSを満たした3 cmのディッシュに移します。

次に、実体顕微鏡下で、ピンセットで胸部の背面を掴み、別のピンセットで腹部第5または第6節（A-5またはA-6）を保持します。その後、腹部の角質層を後方に向かって剥がします。次の手順に進む前に、ピンセットに付着した粘着性のある角質層を取り除いてください。

次に、輸卵管をピンチし、卵巣を分離します。その後、ピンセットを用いて卵巣の先端部分をほぐして広げます。広げた後、染色準備のため、卵巣を固定液に30分間浸します。

卵巣の神経支配を維持した標本を作成するには、麻酔をかけた雌 flies を PBS で満たしたシリコンコートディッシュに移します。解剖顕微鏡下で口吻を保持し、頭部クチクラを剥がして脳を露出させます。脳から付着している気管を除去し、脳と腹側神経索が接続したままの状態にします。

次に、胸部の背側を持ち、脚と翅を除去します。続いて、各脚の付け根から胸部の腹側クチクラを剥がします。VNCが露出したら、ピンセットを用いて、VNCに付着している残りの背側クチクラと筋肉を非常に慎重に取り除きます。

脳とVNCの間の接続箇所を傷つけないように注意してください。次に、ピンセットを使用して腹部のクチクラを剥離し、卵巣および、プロップ、腸、輸卵管、子宮、付属腺を含む関連器官を露出させます。最後に、気管や脂肪体を含む残りの組織を取り除きます。

次に、免疫染色の準備として、サンプルを固定液に30分間浸します。免疫染色後、マイクロピペットを用いてサンプルを0.1% PBTが入ったガラススライドへ移します。その後、顕微鏡でスライドを観察し、ピンセットを使用して卵巣小管の鎖をそれぞれ分離します。

この工程では、卵巣小管の先端を傷つけないように注意してください。そこには卵巣前部が含まれています。脳から生殖器官に至る複合体を準備する際は、残留している角皮を取り除き、スライド上で構造を展開させてください。

次に、過剰なPBTの大部分を拭き取り、サンプルに封入剤を1滴滴下します。続いて、ピンセットを用いてカバーガラスをスライド上にゆっくりと載せ、スライドを4 °Cの暗所で保存します。その後、顕微鏡下でサンプルを観察し、ステロイド生成器官を視野に入れます。

視野が固定されたら、イメージングシステムを画像取得モードに切り替えます。幼虫期において、前胸腺はanti-shroud抗体を含むエクジステロイド合成酵素に対する抗体で標識されました。前胸腺と脳の間の神経接続を可視化するため、脳・環状腺複合体を解剖しました。

フィレ解剖法により前胃神経系が示されており、そこではセロトニン作動性ニューロン群が前胸腺、前胃、および咽頭筋に投射しています。成体雌では、卵巣のエクジステロイドがGSCの増殖など、卵形成の多くの側面に影響を与えます。GSCは、卵巣内の各卵巣小管の先端にある生殖巣にある。

germarium内において、GSCを1B1およびDE-cadherinの2種類の抗体を用いて特異的に標識しました。卵巣の神経支配を視覚化するため、脳、VNC、腸、prop、子宮、および受精嚢とともに卵巣を摘出しました。ニューロンは、n-Synaptobrevin GAL4ドライバーの制御下にあるmCD8:GFPによって視覚化しました。

さらに、筋肉の構造をジコンジュゲート・ファロイジンを用いて染色しました。ステロイド合成器官の解剖は、最初は難しく感じられるかもしれませんが、この動画で組織の切断箇所を確認することで、器官を損傷させることなくより容易に単離できるようになります。本プロトコルが、初心者の方はもちろん、経験豊富な研究者の方々にとっても有益な情報となることを願っております。

この手順を習得すれば、ご自身の研究に応用し、ニーズに合わせて調整することが可能です。本プロトコルが、ステロイドホルモン生合成の包括的な理解に役立つことを願っております。より詳細なステップバイステップのプロトコルは、原著論文でご確認いただけます。

ご確認ください。