複数のマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質の単離による老化に関連する翻訳後修飾の研究

この生化学的手順の全体的な目標は、さまざまな組織特異的な中間フィラメントタンパク質の翻訳後修飾を研究するために、複数のマウス組織から中間フィラメントが豊富な画分を単離することです。この方法は、哺乳類の老化中にこれらの重要なストレス保護細胞骨格タンパク質の機能と調節がどのように影響を受けるかなど、中間フィラメント分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、自動組織溶解ステップを組み込むことで、ユーザーが複数の組織サンプルを迅速かつ効率的に処理できることです。

まず、プロテアーゼ阻害剤を添加した氷冷したTriton X-100バッファー1ミリリットルをガラス管ホモジナイザーに加え、氷の上に置きます。液体窒素貯蔵庫からティッシュの小片を取り出し、ガラスホモジナイザーに直接入れます。次に、ホモジナイザーとサンプルを常に氷上に置いたまま、ポリテトラフルオロエチレンマシュタイユを約50ストローク使用して、気泡の形成を最小限に抑えながらサンプルをホモジナイズします。

ライセートを氷上の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、サンプルを摂氏4度でGの20,000倍で10分間遠心分離します。次に、Triton X可溶性上清画分を別のチューブに集めます。この画分は、免疫沈降およびIFタンパク質の界面活性剤可溶性プールの分析に使用できます。

次に、組織ペレットにプロテアーゼ阻害剤を添加した1ミリリットルの高塩緩衝液を添加します。それをきれいなホモジナイザーに移し、100ストロークをダウンスします。ホモジネートをマイクロ遠心チューブに戻し、チューブを冷蔵室の回転式シェーカーに1時間置きます。

ホモジネートを摂氏4度でGの20, 000倍で20分間遠心分離し、上清を捨てます。1ミリリットルの氷冷PBS EDTAバッファーをペレットに加え、最終クリーンアップステップとしてクリーンなホモジナイザーに移します。均質化後、サンプルを新しいチューブに移し、摂氏4度でGの20,000倍で10分間遠心分離して、IFタンパク質が豊富な高塩抽出物、またはHSCを得ます。

上清を捨て、ペレットを予熱した非還元性SDSサンプルバッファー300マイクロリットルに溶解します。最初にピペッティングとボルテックスでペレットを分解します。次に、サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。

必要に応じてボルテックスとピペットでペレットが完全に溶解していることを確認しますが、これには数分かかる場合があります。分析まで、すべてのサンプルを摂氏マイナス20度で保管してください。RNA抽出を行うには、リジンマトリックスDを含むチューブに溶解バッファーを添加し、次にサンプル組織を組織ライザーに加え、それぞれ25秒間2回パルスします。

20, 000倍G.Forで遠心分離することによりマトリックスからライセートを分離し、総ライセートを調製する場合はTriton X-100またはSDSサンプルバッファーを追加します。リジンマトリックスSSを含むリジンチューブに入れます。次に、サンプル組織を追加します。サンプルを短時間パルスして混合します。

HSCを調製するには、磁石を使用してチューブからステンレス鋼ビーズを取り外し、チューブを摂氏4度でGの20, 000倍で10分間遠心分離します。上清とペレット画分を分離し、ビデオの前半で示したように進めます。10マイクロリットルのT20を50ミリリットルのPBS pH 7.4に加えて、PBSTバッファーを調製します。

次に、200マイクロリットルのPBSTに対して1〜10マイクログラムの抗体を添加して、PTM抗体溶液を調製します。50マイクロリットルの磁気ビーズをマイクロ遠心分離管に分注します。それを磁石の上に置き、ビーズ貯蔵液を吸引します。

ビーズを抗体溶液に再懸濁し、サンプルをローテーター上で室温で20分間インキュベートすることにより、ビーズを免疫沈降抗体に結合させます。チューブを磁石に置き、抗体溶液を吸引します。次に、200マイクロリットルのPBSTを使用して抗体標識ビーズを一度すすぎ、溶液を取り除きます。

0.6〜1ミリリットルの組織溶解液をビーズに加えます。静かにピペッティングして混合し、溶液を低温室のローテーターで3時間インキュベートします。チューブを磁石に置き、ライセートを取り除き、200マイクロリットルのPBSTを使用してビーズを5回洗浄します。

最後の洗浄ステップの後、ビーズと100マイクロリットルのPBSを収集し、ビーズを新しい清潔なチューブに移します。チューブを磁石に置き、PBSを吸引します。チューブを磁石から取り外し、100マイクロリットルの非還元サンプルバッファーを追加します。

チューブから50マイクロリットルを分注し、それを5%2MEと組み合わせて還元サンプルを作成します。サンプルを摂氏95度に5分間加熱します。チューブを磁石に取り付けた状態で、ビーズからIPフラクションを収集し、新しいチューブに移します。

分析まで、サンプルを摂氏マイナス20度で保存します。質量分析のためのタンパク質サンプルの汚染を避けるため、清潔な手袋を使用してすべてのゲルを取り扱い、DD H2Oで洗浄しただけの清潔な容器でインキュベートしてください。標準条件に従って、20〜50マイクロリットルのHSEサンプルをSDSページゲルに泳動します。

テキストプロトコルに従ってゲルを染色した後、プラスチックシートプロテクターの間にゲルを置きます。次に、切除するバンドをスキャンしてマークします。新しい清潔なカミソリを使用してIFタンパク質バンドを切除し、質量分析に提出する前に氷上の清潔な微量遠心チューブにバンドを配置します。

この図は、迅速法を使用して単離された9つのマウス組織からのHSEの典型的な結果を示しています。この方法は膵臓や脾臓にはうまく機能せず、大腸サンプルに追加のバンドが生じることに注意してください。この遺伝子発現解析は、ケラチン8が老化中にアップレギュレーションされることを示しています。

さらに、ウェスタンブロットは、ケラチン8が老齢マウスの肝臓で強力にアップレギュレーションされていることを示しています。ここでは、自動化されたプロトコルを使用して得られた肝臓HSEは、ゲル上のケラチン8および18の強力な濃縮を示しています。質量分析により、老齢マウスの肝臓のK8およびK18には、若いマウスの肝臓には存在しない複数のリン酸化およびアセチル化部位があることが示されました。

肝臓のケラチン変化と同様に、QPCRによる脳組織の分析では、生後3か月のマウスと比較して、24か月齢の脳でGFAPmRNAが5倍誘導されていることが明らかになりました。最後に、クマシー染色による高塩抽出物のタンパク質分析、および総およびアセチルリジンが豊富な画分の免疫ブロットにより、GFAPタンパク質が老化マウスの脳でアップレギュレーションされ、アセチル化されていることが明らかになりました。この手順に続いて、質量分析ベースのプロテオミックスなどの他の方法を使用して、さまざまな生理学的および病態生理学的条件下での中間フィラメントタンパク質の重要な翻訳後修飾および結合パートナーは何かなどの追加の質問に答えることができます。

このビデオを見れば、さまざまな哺乳類組織から中間フィラメントタンパク質を分離する方法を十分に理解できるはずです。