複数のマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質の単離による老化に関連する翻訳後修飾の研究
2017年5月18日
この方法では、複数のマウス組織から中間体フィラメント（IF）タンパク質を迅速かつ効率的に単離するための生化学的手順を提示する。単離されたIFは、質量分析および他の生化学アッセイによる翻訳後修飾の変化を研究するために使用することができる。
この生化学的手順の全体的な目標は、さまざまな組織特異的な中間フィラメントタンパク質の翻訳後修飾を研究するために、複数のマウス組織から中間フィラメントが豊富な画分を単離することです。この方法は、哺乳類の老化中にこれらの重要なストレス保護細胞骨格タンパク質の機能と調節がどのように影響を受けるかなど、中間フィラメント分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、自動組織溶解ステップを組み込むことで、ユーザーが複数の組織サンプルを迅速かつ効率的に処理できることです。
まず、プロテアーゼ阻害剤を添加した氷冷したTriton X-100バッファー1ミリリットルをガラス管ホモジナイザーに加え、氷の上に置きます。液体窒素貯蔵庫からティッシュの小片を取り出し、ガラスホモジナイザーに直接入れます。次に、ホモジナイザーとサンプルを常に氷上に置いたまま、ポリテトラフルオロエチレンマシュタイユを約50ストローク使用して、気泡の形成を最小限に抑えながらサンプルをホモジナイズします。
ライセートを氷上の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、サンプルを摂氏4度でGの20,000倍で10分間遠心分離します。次に、Triton X可溶性上清画分を別のチューブに集めます。この画分は、免疫沈降およびIFタンパク質の界面活性剤可溶性プールの分析に使用できます。
次に、組織ペレットにプロテアーゼ阻害剤を添加した1ミリリットルの高塩緩衝液を添加します。それをきれいなホモジナイザーに移し、100ストロークをダウンスします。ホモジネートをマイクロ遠心チューブに戻し、チューブを冷蔵室の回転式シェーカーに1時間置きます。
ホモジネートを摂氏4度でGの20, 000倍で20分間遠心分離し、上清を捨てます。1ミリリットルの氷冷PBS EDTAバッファーをペレットに加え、最終クリーンアップステップとしてクリーンなホモジナイザーに移します。均質化後、サンプルを新しいチューブに移し、摂氏4度でGの20,000倍で10分間遠心分離して、IFタンパク質が豊富な高塩抽出物、またはHSCを得ます。
上清を捨て、ペレットを予熱した非還元性SDSサンプルバッファー300マイクロリットルに溶解します。最初にピペッティングとボルテックスでペレットを分解します。次に、サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。
必要に応じてボルテックスとピペットでペレットが完全に溶解していることを確認しますが、これには数分かかる場合があります。分析まで、すべてのサンプルを摂氏マイナス20度で保管してください。RNA抽出を行うには、リジンマトリックスDを含むチューブに溶解バッファーを添加し、次にサンプル組織を組織ライザーに加え、それぞれ25秒間2回パルスします。
20, 000倍G.Forで遠心分離することによりマトリックスからライセートを分離し、総ライセートを調製する場合はTriton X-100またはSDSサンプルバッファーを追加します。リジンマトリックスSSを含むリジンチューブに入れます。次に、サンプル組織を追加します。サンプルを短時間パルスして混合します。
HSCを調製するには、磁石を使用してチューブからステンレス鋼ビーズを取り外し、チューブを摂氏4度でGの20, 000倍で10分間遠心分離します。上清とペレット画分を分離し、ビデオの前半で示したように進めます。10マイクロリットルのT20を50ミリリットルのPBS pH 7.4に加えて、PBSTバッファーを調製します。
次に、200マイクロリットルのPBSTに対して1〜10マイクログラムの抗体を添加して、PTM抗体溶液を調製します。50マイクロリットルの磁気ビーズをマイクロ遠心分離管に分注します。それを磁石の上に置き、ビーズ貯蔵液を吸引します。
ビーズを抗体溶液に再懸濁し、サンプルをローテーター上で室温で20分間インキュベートすることにより、ビーズを免疫沈降抗体に結合させます。チューブを磁石に置き、抗体溶液を吸引します。次に、200マイクロリットルのPBSTを使用して抗体標識ビーズを一度すすぎ、溶液を取り除きます。
0.6〜1ミリリットルの組織溶解液をビーズに加えます。静かにピペッティングして混合し、溶液を低温室のローテーターで3時間インキュベートします。チューブを磁石に置き、ライセートを取り除き、200マイクロリットルのPBSTを使用してビーズを5回洗浄します。
最後の洗浄ステップの後、ビーズと100マイクロリットルのPBSを収集し、ビーズを新しい清潔なチューブに移します。チューブを磁石に置き、PBSを吸引します。チューブを磁石から取り外し、100マイクロリットルの非還元サンプルバッファーを追加します。
チューブから50マイクロリットルを分注し、それを5%2MEと組み合わせて還元サンプルを作成します。サンプルを摂氏95度に5分間加熱します。チューブを磁石に取り付けた状態で、ビーズからIPフラクションを収集し、新しいチューブに移します。
分析まで、サンプルを摂氏マイナス20度で保存します。質量分析のためのタンパク質サンプルの汚染を避けるため、清潔な手袋を使用してすべてのゲルを取り扱い、DD H2Oで洗浄しただけの清潔な容器でインキュベートしてください。標準条件に従って、20〜50マイクロリットルのHSEサンプルをSDSページゲルに泳動します。
テキストプロトコルに従ってゲルを染色した後、プラスチックシートプロテクターの間にゲルを置きます。次に、切除するバンドをスキャンしてマークします。新しい清潔なカミソリを使用してIFタンパク質バンドを切除し、質量分析に提出する前に氷上の清潔な微量遠心チューブにバンドを配置します。
この図は、迅速法を使用して単離された9つのマウス組織からのHSEの典型的な結果を示しています。この方法は膵臓や脾臓にはうまく機能せず、大腸サンプルに追加のバンドが生じることに注意してください。この遺伝子発現解析は、ケラチン8が老化中にアップレギュレーションされることを示しています。
さらに、ウェスタンブロットは、ケラチン8が老齢マウスの肝臓で強力にアップレギュレーションされていることを示しています。ここでは、自動化されたプロトコルを使用して得られた肝臓HSEは、ゲル上のケラチン8および18の強力な濃縮を示しています。質量分析により、老齢マウスの肝臓のK8およびK18には、若いマウスの肝臓には存在しない複数のリン酸化およびアセチル化部位があることが示されました。
肝臓のケラチン変化と同様に、QPCRによる脳組織の分析では、生後3か月のマウスと比較して、24か月齢の脳でGFAPmRNAが5倍誘導されていることが明らかになりました。最後に、クマシー染色による高塩抽出物のタンパク質分析、および総およびアセチルリジンが豊富な画分の免疫ブロットにより、GFAPタンパク質が老化マウスの脳でアップレギュレーションされ、アセチル化されていることが明らかになりました。この手順に続いて、質量分析ベースのプロテオミックスなどの他の方法を使用して、さまざまな生理学的および病態生理学的条件下での中間フィラメントタンパク質の重要な翻訳後修飾および結合パートナーは何かなどの追加の質問に答えることができます。
このビデオを見れば、さまざまな哺乳類組織から中間フィラメントタンパク質を分離する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
この方法は、複数のマウス組織から中間繊維（IF）タンパク質を迅速かつ効率的に分離するための生化学的手順を示しています。分離されたIFは、質量分析法やその他の生化学的アッセイを通じて翻訳後修飾の変化を研究するのに利用できます。
主要な研究要素
科学の分野
- 生化学
- 細胞生物学
- 神経科学
背景
- 中間繊維は重要な細胞骨格タンパク質です。
- 細胞のストレス応答において重要な役割を果たします。
- その修飾を理解することで老化に関する洞察が得られます。
- この方法により、組織特異的なIFタンパク質の分析が可能になります。
研究目的
- マウス組織から中間繊維を豊富に含む画分を分離すること。
- IFタンパク質の翻訳後修飾を調査すること。
- 哺乳類の老化過程におけるこれらのタンパク質の調節を探ること。
使用した方法
- 効率的なサンプル処理のための自動組織溶解。
- プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷トリトンX-100バッファーの使用。
- 泡の形成を最小限に抑えながらの組織サンプルのホモジナイゼーション。
- 翻訳後修飾の分析のための質量分析法。
主な結果
- 様々な組織からの中間繊維タンパク質の成功的な分離。
- 特定の翻訳後修飾の同定。
- IFタンパク質の機能調節に関する洞察。
- 老化プロセスの理解のための潜在的な意味。
結論
- この方法はIFタンパク質の分離効率を向上させます。
- その修飾を研究するためのプラットフォームを提供します。
- 結果は細胞骨格ダイナミクスのより広範な理解に貢献する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient isolation and profiling of intermediate filament (IF) proteins across multiple tissues enables systematic investigation of aging-associated post-translational modifications (PTMs) at scale. This capability supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for cytoskeletal protein function in disease-relevant systems. High-throughput IF PTM analysis informs portfolio decisions by clarifying biological responses to stress and aging across organ systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of IF protein regulation and stress response mechanisms across tissues.
- Supports functional target validation by mapping PTM signatures linked to cellular resilience and dysfunction.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing tissue-specific IF protein changes during aging.
Screening & Assay Development
- Provides validated IF-enriched fractions for downstream quantitative PTM assays and immunoprecipitation workflows.
- Standardizes sample preparation for reproducible mass spectrometry-based PTM profiling.
- Enables scalable processing of high sample volumes for disease model studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns IF PTM profiling with disease-relevant tissue models to support translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from molecular discovery to preclinical validation of cytoskeletal targets.
- Informs risk-adjusted advancement by linking PTM changes to functional protein outcomes in aging and disease.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical research by enabling organism-wide IF PTM analysis and supporting downstream proteomic workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on IF protein regulation and stress adaptation across tissues.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative IF fractions for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides mass spectrometry-ready samples for comparative PTM and expression analysis.
- Translational Research: Connects molecular PTM signatures to disease-relevant tissue changes in aging models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable to diverse tissue types and experimental groups.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cytoskeletal target validation and mechanistic understanding.
- Operational Value: Enables high-throughput, standardized sample processing for large-scale studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying tissue-specific protein regulation and PTM dynamics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models based on robust PTM data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue homogenization, protein extraction, and proteomic analysis.
- Needs access to automated homogenization equipment and mass spectrometry infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility across tissues and studies.
- Adaptation may be limited in tissues like pancreas and spleen due to extraction efficiency.
- Strict contamination control is essential for downstream mass spectrometry accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
8:50
Conclusion
7:15
Results: High-salt Extraction of Intermediate Filament Proteins Using Lysing Matrix
0:49
Preparation of Detergent-soluble and High-salt Extracts of Tissue-specific IFs
3:16
Automated Tissue Lysis for RNA and IF Protein Extraction in High-volume Experiments
