Name: 複数のマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質の単離による老化に関連する翻訳後修飾の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学ぶマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質単離法による老化関連翻訳後修飾の解析。この自動化プロトコルは、質量分析による高スループットPTMプロファイリングを可能にし、細胞骨格タンパク質の年齢依存性変化を明らかにする。

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この研究は、NIH R01 DK110355、DK093776 [NTS]、DK102450 [NTS]、およびP30 DK034987 [UNC-チャペルヒルへの] NIH交付金によって支援された。著者らは、qPCRおよびウェスタンブロット実験の支援についてDeekshita Ramanarayananに感謝している。

このプロトコルは、ノースカロライナ大学の施設内動物管理および使用委員会（IACUC）に従って承認され、実施されます。 1.準備<ol><li>トリトン-X緩衝液（1％トリトンX-100,5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、pH7.4中の容量を出す）を調製する。 500mLにするには：Triton X-100と500mM EDTAをそれぞれ5mL加え、PBS490mL、pH7.4に入れる。 Triton-X緩衝液は4℃で保存してください。 </li><li>高塩緩衝液（10mM Tris-HCl、pH7.6,140mM NaCl、1.5M KCl、5mM EDTA、0.5％Triton X-100、二倍蒸留（dd）H 2 O中に容量を持ち出す）を調製する。 500mLを作るため：0.5M Tris-HCl（pH7.6）10mL、5M NaCl 14mL、KCl55.9g、0.5M EDTA5mLおよびTriton X-100 2.5mLを撹拌し、容量を500に調整するmLとなるように希釈した）。ハイソルトバッファー溶液は4℃で保存してください。 </li><li>使用直前に、適切な量のTriton-XおよびHigh Salt Buffer（ <emプロテアーゼまたはプロテアーゼ/ホスファターゼインヒビターカクテルで、例えば、25mgの組織サンプルごとに1mL）を除去し、インヒビターを含む未使用のバッファーを捨てる。 </li><li> 1×PBS、pH 7.4中で5mM EDTAを調製する。 500mLを作るために：0.5M EDTA5mLを1xPBS、495mLに撹拌する。 </li><li>獣医学のガイドラインと制度上の基準に準拠した承認されたプロトコルを使用して、異なるマウスの器官（脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、結腸、腸、腎臓、脾臓）を分離する。組織収集手順は、プロテアーゼが豊富な組織（ 例えば、膵臓を最初に処理すべきである）のRNAおよびタンパク質の完全性を保存するために、5分を超えてはならない。 </li><li>その後のRNA抽出、cDNA合成、およびIF遺伝子発現の定量的リアルタイムPCR解析のために、少量の組織（約5〜20mg）を切断し、RNA保存液に入れます。組織を含むRNA保存液チューブを4℃で一晩置き、さらにプロトコールに従う貯蔵および隔離ステップ。 </li><li>組織の残りの部分をより小さな断片（ 例えば 0.5cm）に切断し、冷凍瓶に入れる。長期保管の場合はバイアルを-80℃または液体窒素でスナップフリーズして保管してください。 </li></ol> IF遺伝子発現解析<ol><li> RNA貯蔵溶液試薬中に保存された組織からRNAを抽出する。製造業者のプロトコールに従って、任意の適切な/好ましいRNA抽出方法を使用する。 </li><li> RNA濃度を定量し、2μgのRNAを使用して、製造業者のプロトコールに従って適切な逆転写キットを使用してcDNAを生成する。 </li><li>生成されたcDNAおよびマウスIF遺伝子特異的プライマーを使用して、各サンプルの3つの技術的複製ならびに製造業者のプロトコルによるブランク対照を含むqPCR反応をセットアップした。 </li><li> IF遺伝子発現を、異なる条件（ 例えば、若い組織と古い組織）を比較した倍率変化として定量化する。 </li></ol> 3.Pイムノブロット用の全組織溶解物の修復<ol><li> 1mLの2×非還元SDSサンプルバッファー中で25mgの組織をホモジナイズする。タンパク質濃度を定量するために比色分析を行う場合は、ブロモフェノールブルー染料をサンプルバッファーから除きます。 </li><li>還元メルカプトエタノール（2-ME）を5％（v / v）添加して還元サンプルを調製する。非還元性サンプル200μLに10μLの2-MEを加える。 </li><li>界面活性剤および還元剤適合性タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を決定する。色素が既にサンプルバッファーに含まれている場合、タンパク質量は、クーマシーベースの染色24を含む多くの技術によってゲルを実行した後に推定することができます。 </li><li>すべてのサンプルをボルテックスし、95℃で5分間加熱する。 </li><li>還元条件と非還元条件の両方でウェスタンブロッティングを行います。膜を短時間露出させてモノマー種を明らかにし、より長い時間（&gt; 1分）で高分子量複合体含有物を明らかにするIFタンパク質。凝集をモニタリングする場合、ゲル/膜全体（ゲルウェルの底を含む）を調べる。 </li><li>平行ゲルを実行し、ローディングコントロールとしてタンパク質染色で染色する。疾患モデルまたは傷害実験では、ハウスキーピングタンパク質（ 例えば、アクチン、GAPDH）のイムノブロットとは対照的に、ストレス条件の違いによって後者が変化するので、ローディングコントロールとして全タンパク質染色を使用すべきである。 </li></ol> 4.組織特異的IFの界面活性剤可溶性および高塩濃度抽出物の調製<ol><li>氷冷したTriton X-100緩衝液1 mLをガラス管ホモジナイザーに加え、氷上に置きます。 </li><li>液体窒素保存液から少量の組織（〜25 mg）を取り出し、ガラスホモジナイザーに直接入れる。ホモジナイズ（50ストローク）し、気泡を作るのを避けるために、ポリテトラフルオロエチレン乳棒を使用してください。常にホモジナイザーとライゼートを冷たく保ちます。 </li><li>ライセートを1.5 mLのmicrに移す遠心チューブを氷上に置き、予め冷却した遠心分離機（4℃）で20,000×gで10分間遠心する。 </li><li>上清画分を別のチューブに集める。これは、トリトンX可溶性画分であり、免疫沈降（Ip）およびIFタンパク質の界面活性剤可溶性プールの分析に使用することができる。脳組織からより清潔なIF抽出物を得るために、ステップ4.1-4.4を繰り返すことができることに留意されたい。 </li><li>組織ペレットに1 mLのHigh Salt Bufferを加え、清潔なホモジナイザーに移し、100ストロークを飛ばします。ホモジネートをマイクロ遠心チューブに戻して移し、チューブを冷たい部屋の回転シェーカーに1時間置きます。 </li><li>ホモジネートを20,000 xgで4℃で20分間遠心分離する。上清を捨てる。 </li><li>氷冷PBS / EDTAバッファー1 mLをペレットに加え、クリーンホモジナイザーでペレット（20ストローク）を最終的なクリーンアップステップ*としてホモジナイズします。新しいチューブに移し、4℃で20,000×gで10分間遠心分離して、IFタンパク質 -高濃度高塩抽出物（HSE）である。 *任意に、この段階でホモジナイズの代わりにボルテックスする。 </li><li>上清を捨て、予熱した非還元性SDSサンプルバッファー300μLにペレットを溶解する。最初にピペッティングとボルテックスでペレットを壊し、95℃で5分間サンプルを加熱する。 </li><li>ペレットが確実に溶解するように必要に応じてボルテックスおよびピペットをかけます。ペレットを完全に溶解させるのに数分かかることがあります。 </li><li>すべてのサンプルを分析まで-20℃で保存する。 </li></ol> 5.大量実験におけるIFタンパク質抽出のための自動化組織溶解<ol><li> RNA抽出のために、溶解マトリックスD（小さなセラミック球を使用する）を入れたチューブに溶解緩衝液（組織25mgあたり600μLの緩衝液）を置き、組織ライザーで25秒間2回パルスする。 20,000 xgでの遠心分離によってマトリックスから溶解液を分離し、次の工程に分離する。 </li><li>タンパク質の抽出には、Trit溶解マトリックスSS（単一のステンレススチールビーズを使用）を含む溶解チューブ中で、X-100（または全溶解物を調製する場合はSDSサンプルバッファー）上に置く。複数のマトリックスを試験した後、これは、伝統的な計量法と同様の品質のIFタンパク質抽出物を生成するため選択された。自動化された方法は、膵臓および脾臓に最適ではなく、これらの組織に標準的なホモジナイゼーションプロトコルを使用する必要があることに注意してください。 </li><li> High Salt Extractの調製を進めるには、磁石を使用してステンレスビーズをチューブから取り出し、チューブを20,000 xgで10分間4℃で遠心します。 </li><li>手動プロトコルのステップ4.4（上記）に進みます。 </li><li>すべてのサンプルを分析まで-20℃で保存する。 </li></ol>翻訳後修飾IFタンパク質の免疫濃縮<ol><li> PBST緩衝液（PBS中0.02％Tween-20）を調製する。 50mLを調製するために、10mLのTween-20を50mLのPBS（pH7.4）に加える。 </li><li> PTM抗体を調製する（PBST200μL中の抗体1〜10μg）。一般に、3μgの抗体/反応は、必要に応じてさらに最適化できる良好な開始条件である。 </li><li>各反応について、50μLの磁性ビーズを微量遠心管に分注し、磁石の上に置き、ビーズ保存液を吸引します。 </li><li>ビーズを抗体溶液に再懸濁し、室温で20分間、ローテーター（少量の混合を確実にするためにエンドオーバーエンド）でインキュベートすることにより、ビーズを免疫沈降抗体に結合させる。 </li><li>チューブを磁石の上に置き、抗体溶液を吸引する。 </li><li> 200μLのPBSTで1回抗体結合ビーズをすすぎ、洗浄バッファーを除去する。 </li><li> 0.6-1mLの組織溶解物をビーズに加え、穏やかなピペットで混合し、冷たい部屋の回転器で3時間インキュベートする。 </li><li>チューブを磁石の上に置き、溶解物を除去し、200μLのPBSTでビーズを5回洗浄する。最後の洗浄ステップの後、ビーズを100μlで収集し、6; LのPBS（Tween-20無し）で清潔な新しいチューブに移す。チューブをマグネットの上に置きます。 </li><li> PBSを吸引し、100μLの非還元サンプル緩衝液を加える。 50μLを除去し、2-ME（5％）を加えて還元サンプルを作製する。試料を95℃で5分間加熱する。 </li><li>磁石上のビーズからip分画を分離し、新しいチューブに集める。 </li><li>分析まで-20℃でサンプルを保存する。 </li></ol>質量分析のためのIFタンパク質試料の調製<ol><li>質量分析の分析には時間とコストがかかりますので、研究を開始する前にプロテオミクスの専門家に相談してください。 </li><li>汚染を避けるために特別な注意を払ってください。きれいな手袋ですべてのゲルを取り扱い、清潔な容器でインキュベートし、ddH 2 O（石鹸を避ける）のみを用いて洗浄する。 </li><li>標準条件に従ってSDS-PAGEゲル上で20〜50μLのHSEサンプル（セクション4および5から）を流してください。 </li&gt; <li>タンパク質染色で1時間染色する。複数回すすぎ、ddH 2 Oで一晩脱脂する。 IFタンパク質バンドは脱染色後に容易に見えるはずである。 </li><li>ゲルをプラスチック製のシートプロテクターの間に置き、分析のために切除して送るバンドをスキャンしてマークします。 </li><li>新しいきれいなかみそりを使用してIFタンパク質バンドを切り出します。 </li><li>ゲルバンドを清潔なマイクロ遠心チューブに入れ、質量分析装置に移す。 </li></ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

IFタンパク質が細胞および組織ストレスのマーカーおよびモジュレーターの両方であるため、IFタンパク質の生化学的特徴付けを可能にする方法は、哺乳類系における多数の病態生理学的現象を理解するのに有用であり得る。現在の方法の背後にある原則は、一般に低塩類溶液および高塩溶液を使用する細胞および組織からIFタンパク質を単離し、分離し、再構成するための1970年代および1980年代に開発された初期手順に基づいており、Triton-X100界面活性剤25,30,31,32 、 33,34,35 。 IFタンパク質の生化学的分離を支持する研究への歴史的な洞察のために、最近のレビュー36,37を見てください。現在の方法シンプルな上皮ケラチンの研究のために開発されたより最近のプロトコルに基づいている26 。この方法の利点は、IF分野に初めての研究者がほとんどの哺乳動物組織からIFタンパク質を効果的に単離できるようにするための初期段階として役立つことである。これは、IFタンパク質規制21,38...

<html> I型IVは、細胞質（ 例えば、上皮および毛ケラチン（K）、筋細胞デスミン、神経フィラメント、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）、および他のタイプの細胞質タンパク質である。その他）;タイプVは核ラミンであり;タイプVIはアイレンズ1の IFである。それらの分子構成に関して、IFタンパク質は、高度に保存されたコイルドコイル「ロッド」ドメインおよび球状の「頭部」および「尾部」ドメインの3つの共通ドメインを有する。 IFタンパク質四量体は、機械的保護2 、ストレス感知3,4 、転写5および成長の調節、ならびに他の重要な細胞機能に関与する動的細胞骨格および核骨格構造を形成する成熟フィラメントに最終的に組み込まれる短いフィラメント前駆体を形成するように集合する&quot; 1,6,7 。 IFシステムの機能的重要性は、ニューロパシー、ミオパチー、皮膚脆弱性障害、代謝機能不全および早期老化症候群を含むIF遺伝子のミスセンス突然変異によって引き起こされる多くのヒト疾患の存在によって強調される8 。いくつかのIF遺伝子突然変異は、肝疾患9の単純な上皮ケラチンのような疾患の進行を引き起こさないが、そのキャリアを素因とする9 。後者は、上皮におけるIFの重要なストレス保護機能によるものである。 IFは一般に、基底条件下で最も豊富な細胞タンパク質の中に含まれていますが、様々なタイプのストレスの間にさらに強く誘導されます10 。例えば、線虫C.elegansのプロテオーム全体の変化を評価した最近の研究では、複数のIFが高度に上方制御され、凝集しやすいことが示された生物老化中に11,12。適切なIF構造の維持は、様々な形態のストレスに対する細胞の抵抗性にとって必須であるため、IF凝集はまた、老化中の機能低下に寄与し得る。しかしながら、ストレスを受けている異なる組織にわたって複数の哺乳動物IFタンパク質を試験する生物学的レベルの研究は欠けている。 IFは、細胞の要求を満たすために適応する高度に動的な構造である。ケラチンは、例えば、可溶性（非糸状）および不溶性（糸状）タンパク質プール13間の生合成に依存しないサイクリングを受ける。通常の生理学的条件下では、非イオン性界面活性剤Nonidet P-40に可溶化することができる約20％と比較して、洗浄剤を含まない緩衝液中で全K8 / K18プールの約5％を抽出することができ、 X100 14 、 </s&gt; 15 。有糸分裂の間に、表皮ケラチンではあまり明らかではないが、ビメンチンおよび他のIII型IFタンパク質においてより明白である単純型上皮K8およびK18 14の溶解性が顕著に増加する15,16 。 IFタンパク質の溶解特性は、フィラメント再配列および溶解性のための重要な翻訳後修飾（PTM）であるリン酸化によって厳密に制御されている17,18,19,20。ほとんどのIFは、保存された部位で多数のPTMによって広範な調節を受け、機能的変化をもたらす17 。 この方法の目的は、複数のマウス組織にわたるIFタンパク質の研究のための生化学的抽出および分析方法に、IF分野の新しい研究者を紹介することである。特定我々は、高塩抽出法を用いたIFタンパク質の単離と、質量分光法およびPTM標的抗体によるPTMの変化の評価に焦点を当てている。これらの方法は以前に公表された手順21に基づいているが、異なるIFタンパク質型を抽出するための改変を含み、IFファミリーにわたる調節のための共通機構を明らかにする。例えば、特定のリジン残基でのK8アセチル化はフィラメントの組織化を制御するが、高アセチル化はK8不溶性および凝集体形成を促進する22 。最近の世界のプロテオミクスプロファイリング研究は、ほとんどの組織特異的IFタンパク質もまたアセチル化の標的であり、ほとんどのIFアセチル化部位が高度に保存されたロッドドメインに限定されることをさらに明らかにした。これにより、IFシステムのグローバルプロファイリングに適したメソッドの必要性が強調されます。我々はまた、optiでの自動ホモジナイゼーションを用いて複数の組織からIFタンパク質を単離する迅速な方法を紹介する溶解した溶解マトリックス。得られた調製物は、質量分析および他の方法による下流のPTM分析に適している。

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10009</td><td>免疫沈降ビーズ</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>バッファー用</td></tr><tr><td>Purelink RNA ミニキット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12183018</td><td>組織からの RNA 抽出</td></tr><tr><td>Purelink DNAse カラム</td><td>DNA 消化</td><td></td><td></td>に ThermoFisher Scientific 12185010A をセット</tr><tr><td>Dynamag-2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td>磁石 ダイナビーズ用</td></tr><tr><td>GelCode Blue Stain 試薬</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24592</td><td>質量分析対応ゲル染色</td></tr><tr><td>Pierce ECL ウェスタンブロッティング基質</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32106</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>大容量 cDNA 逆転写キット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>遺伝子発現解析に使用する</td>4368813</tr><tr><td>Proflex 3 x 32-well PCR System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4484073</td><td>PCR System</td></tr><tr><td>PVDF transfer membrane&nbsp;</td><td>ウェスタンブロット用</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88520</td></tr><tr><td>Power Up SYBRマスターミックス</td><td>qPCR分析用</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A25778</td></tr><tr><td>RNAlater</td> RNA<td>単離前の組織保存用</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td>溶液</tr><tr><td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>Precast protein gel</td></tr><tr><td>Anti-Keratin 8抗体 (TS1)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA514428</td><td>K8 のウェスタンブロット検出用</td></tr><tr><td>抗ビメンチン</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA511883</td><td>ビメンチン</td></tr><tr><td>トリス グリシン転写バッファー (25x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC3675</td><td>タンパク質ゲルのウェットトランスファー用</td></tr><tr><td>2x SDS Sample Buffer ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>LC2676</td> 調製<td>用タンパク質ゲルサンプル</td></tr><tr><td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC26755</td><td>ランニングタンパク質ゲル用</td></tr><tr><td>Lysing ビーズ - Matrix D</td><td>MP Biomedicals</td><td>116913100</td><td>組織破壊およびRNA抽出用のLysisビーズおよびマトリックスチューブ</td></tr><tr><td>溶解ビーズ - Matrix SS</td><td>MP Biomedicals</td><td>116921100</td><td>組織破壊およびタンパク質抽出用のLysisビーズおよびマトリックスチューブ</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite 分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND-LITE</td><td>タンパク質と核酸の測定</td></tr><tr><td>Precellys 24 ホモジナイザー</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ03119</td><td>自動組織ホモジナイザー</td></tr></tbody></table>

複数のマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質の単離による老化に関連する翻訳後修飾の研究

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

中間フィラメント（IF）は、アクチンフィラメントおよび微小管とともに、細胞骨格 - 各細胞の重要な構造要素 - を形成する。正常に機能するIFは細胞に機械的およびストレス回復性を与え、機能不全のIF細胞骨格は細胞の健康を損ない、多くのヒト疾患と関連している。翻訳後修飾（PTM）は、生理学的変化およびストレス条件下でIF動態を決定的に調節する。したがって、IFのPTMシグネチャーにおける変化をモニターする能力は、細胞傷害の間のストレス応答因子としてのIFシステムのより良好な機能的理解、および最終的な調整に寄与し得る。しかし、70を超える個々の遺伝子によってコードされ、組織依存的に発現される多数のIFタンパク質は、異なるPTMの相対的重要性を分類する際の大きな課題である。この目的のために、IFタンパク質上のPTMのモニタリングを可能にする方法孤立した家族のためではなく、生物全体のレベルで、この分野における研究の進展を加速させる可能性があります。ここでは、9種類のマウス組織（脳、心臓、肺、肝臓、小腸、大腸、膵臓、腎臓、および腎臓）からのIFタンパク質の総、洗浄剤可溶性および界面活性剤耐性画分の単離のための生化学的方法を提示する。脾臓）。我々はさらに、異なるマウス組織の溶解マトリックスおよび自動化されたホモジナイゼーションを用いて、IFタンパク質の迅速な単離のための最適化されたプロトコールを実証する。自動化されたプロトコルは、（複数の動物および実験群を含む疾患モデルにおけるような）高試料量の実験でIFをプロファイリングするのに有用である。得られたサンプルは、質量分析に基づくPTMプロファイリングを含む様々な下流分析に利用することができる。これらの方法を利用して、我々は、異なるマウス組織（脳および肝臓）におけるIFタンパク質がそれらの発現に関して並行して変化することを示すための新しいデータを提供する老化中のシオンレベルおよびPTMを減少させる。

溶解マトリックスを用いた複数のマウス組織からのIFタンパク質の高塩ベース抽出のための新しい高速方法。 上皮組織からの中間フィラメントタンパク質画分の大部分を単離する従来の方法25,26 は、ここでは9つの異なる器官および組織溶解のためのより迅速な手順を含むように改変された。伝統的な方法には3つの手動均質化段階が必要であるが、修正された手順は1つの手動均質化段階のみを有するため、特に6つを超えるサンプルを処理する場合に数時間短縮する。 図1Aは、9匹のマウス組織からのHSEの典型的な結果を示し、組織中の予想されるタンパク質の表および各タンパク質の分子量を図1Bに示す </str比較のために。注目すべきは、新...

この方法では、複数のマウス組織から中間体フィラメント（IF）タンパク質を迅速かつ効率的に単離するための生化学的手順を提示する。単離されたIFは、質量分析および他の生化学アッセイによる翻訳後修飾の変化を研究するために使用することができる。

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

この生化学的手法の全体的な目的は、組織特異的なさまざまな中間フィラメントタンパク質の翻訳後修飾を研究するために、複数のマウス組織から中間フィラメント濃縮画分を単離することです。この方法は、哺乳類の老化過程において、これらの重要なストレス保護細胞骨格タンパク質の機能と調節がどのように影響を受けるかといった、中間フィラメント分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、組織溶解ステップを自動化することで、複数の組織サンプルを迅速かつ効率的に処理できることです。まず、プロテアーゼ阻害剤を添加した氷冷Triton X-100バッファーを1 mL、ガラス製組織ホモジナイザーに加え、氷上に置きます。液体窒素保存から少量の組織片を取り出し、直接ガラスホモジナイザーに入れます。その後、ホモジナイザーと試料を常に氷上に保持したまま、ポリテトラフルオロエチレン製ペスチルを用いて、気泡の形成を最小限に抑えながら約50回ストロークして試料をホモジナイズします。ライセートを氷上の1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移し、4 °Cで20,000 ×gにて10分間遠心分離します。次に、Triton X可溶性の上清分画を別のチューブに回収します。この分画は、免疫沈降およびIFタンパク質の界面活性剤可溶性プールの解析に使用できます。次に、組織ペレットにプロテアーゼ阻害剤を添加した高塩濃度緩衝液を1 mL加えます。それを清潔なホモジナイザーに移し、100回ダンシングします。ホモジネートをマイクロ遠心チューブに戻し、低温室の回転振盪機で1時間静置します。ホモジネートを4°Cで20,000 ×gにて20分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットに氷冷した1 mLのPBS EDTA緩衝液を加え、最終的なクリーンアップステップとして、清潔なホモジナイザーに移します。ホモジナイズ後、サンプルを新しいチューブに移し、4°Cで20,000 ×gにて10分間遠心分離して、IFタンパク質を豊富に含む高塩抽出物（HSC）を得ます。上清を捨て、ペレットを300 µLの予熱した非還元SDSサンプルバッファーで溶解させます。まずピペッティングとボルテックスでペレットを分散させます。その後、サンプルを95 °Cで5分間加熱します。ペレットが完全に溶解するように、必要に応じてボルテックス処理およびピペッティングを行います。これには数分かかる場合があります。分析まで、すべてのサンプルを-20°Cで保存します。RNA抽出を行うには、lysine matrix Dを含むチューブに溶解バッファーを加え、次にサンプル組織をティッシュライザーに加え、25秒間のパルス処理を2回行います。20,000 ×gで遠心分離し、ライセートをマトリックスから分離します。タンパク質抽出の場合、全ライセートを調製するのであればTriton X-100またはSDSサンプルバッファーを添加します。ライシンマトリックスSSを含むライシンチューブに、サンプル組織を加えます。短時間パルスして混合します。HSCを調製するには、マグネットを用いてチューブからステンレス製ビーズを取り除き、4°Cで10分間、20,000 ×gで遠心分離します。上清とペレット画分を分離し、ビデオの前半で示した手順に従って進めます。50 mLのPBS（pH 7.4）に10 µLのT20を加えて、PBSTバッファーを調製します。次に、1〜10 µgの抗体を200 µLのPBSTに加えて、PTM抗体溶液を調製します。50 µLの磁気ビーズをマイクロ遠心チューブに分注します。これをマグネット上に置き、ビーズ保存液を吸引して除去します。ビーズを抗体溶液に再懸濁し、サンプルを回転機を用いて室温で20分間インキュベートし、免疫沈沈抗体にビーズを結合させます。チューブをマグネットに設置し、抗体溶液を吸引します。次に、200 µLのPBSTを用いて抗体結合ビーズを1回洗浄し、溶液を除去します。組織ライセート1 mLに対し0.6を加えたものをビーズに添加します。緩やかにピペッティングして混合し、低温室のローテーターで3時間インキュベートします。チューブをマグネットに設置してライセートを除去し、200 µLのPBSTを用いてビーズを5回洗浄します。最後の洗浄ステップの後、ビーズと100 µLのPBSを回収し、新しい清潔なチューブにビーズを移します。チューブをマグネットに設置し、PBSを吸引します。チューブをマグネットから外し、100 µLの非還元サンプルバッファーを加えます。チューブから50 µLを分注し、5% 2MEと混ぜて還元サンプルを作成します。サンプルを95 °Cで5分間加熱します。チューブをマグネットに設置し、ビーズからIP画分を回収して、新しいチューブに移します。分析までサンプルを-20 °Cで保存します。質量分析用のタンパク質サンプルの汚染を避けるため、すべてのゲルは清潔な手袋を用いて扱い、DD H2Oのみで洗浄した清潔な容器内でインキュベートしてください。標準的な条件に従い、20〜50 µLのHSEサンプルをSDS-PAGEゲルで電気泳動します。テキストのプロトコルに従ってゲルを染色した後、ゲルをプラスチック製のシートプロテクターで挟みます。次に、スキャンを行い、切り出すバンドをマークします。新品の清潔なカミソリを使用してIFタンパク質のバンドを切り出し、質量分析に提出する前に、清潔なマイクロ遠心チューブに入れ、氷上で保持します。この図は、迅速法を用いて単離した9つのマウス組織からの代表的なHSEの結果を示しています。この方法は、膵臓および脾臓ではうまく機能せず、大腸のサンプルでは追加のバンドが出現することに注意してください。この遺伝子発現解析により、老化に伴いKeratin 8がアップレギュレートされることが示されています。さらに、ウェスタンブロッティングにより、高齢マウスの肝臓でKeratin 8が強くアップレギュレートされていることが示されています。ここでは、自動プロトコルを用いて得られた肝臓HSEにおいて、ゲル上でKeratins 8および18が強く濃縮されていることが示されています。質量分析の結果、高齢マウスの肝臓におけるK8およびK18には、若齢マウスの肝臓には存在しない複数のリン酸化およびアセチル化部位があることが明らかになりました。肝臓におけるケラチンの変化と同様に、脳組織のQPCR分析により、3ヶ月齢のマウスと比較して24ヶ月齢のマウスの脳ではGFAP mRNAが5倍に誘導されていることが明らかになりました。最後に、Coomassie染色による高塩抽出物のタンパク質分析、および全画分とアセチルリシン濃縮画分のイムノブロットにより、加齢マウスの脳においてGFAPタンパク質の発現が上昇し、アセチル化されていることが示されました。この手順の後、質量分析ベースのプロテオミクスなどの他の手法を用いることで、さまざまな生理的および病理学的条件下における中間径フィラメントタンパク質の重要な翻訳後修飾や結合パートナーは何かという、さらなる疑問に答えることが可能です。このビデオを視聴することで、さまざまな哺乳類組織から中間径フィラメントタンパク質を単離する方法について十分に理解することができます。

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Research

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Biochemistry

生物化学

このビデオは、老化によるプロテオスタシスの低下を決定するためのin vivoイメージングベースのアッセイを示しています。このアッセイでは、ポリグルタミンYFP融合タンパク質を体壁筋に発現する線虫Caenorhabditis...

蛍光レポーターベースの麻痺アッセイ:線虫Caenorhabditis elegansにおけるポリグルタミン蛍光レポーターの加齢に伴う進行性形成と関連麻痺を評価する技術

筋線維の単離および培養は、ゴールドスタンダードである...

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

タンパク質の恒常性、ストレス、老化の関係を研究するために、遺伝的に扱いやすい後生動物Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegansをモデル系として使用して、多細胞生物におけるタンパク質恒常性を研究する

ここで紹介した方法の目的は、線虫モデル有機体の正常な老化中タンパク質凝集を探索することです。プロトコルは、年齢を形成する非常に不溶解性の大きな凝集体を研究し、プロテオステイシスの変化により蛋白質の集合がどのような影響を与えるかを決定するための強力なツールを表します。...

線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド

このメソッドでは、標準化された定量的西部のしみが付くアプローチを使用して異なる発達縦長で種々...

タンパク質レベルの組織や標準化された定量ウェスタンブロットによる開発全体の堅牢な比較

プロテオスタティック低下は老化の特徴であり、神経変性疾患の発症を促進する。我々は、蛍光レポーターに融合したポリグルタミン反復の異種発現を通じて、2つの異なる カエノールハブディティス・エレガン...

カエノハブディティス・エレガンスにおける組織特異的プロテオスタティック低下の定量化

ここでは、出生後初期の発達段階で単一の筋線維を効率的に得る方法を、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー(EDMD)の非常に重篤なモデルであるホモジューザイゴウス変異体ラミンΔ8-11マウスモデルから提案する。...

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

チューブリンポリマーである微小管は、真核細胞の細胞骨格成分として重要な役割を果たしており、動的に不安定であることで知られています。本研究では、微小管を分画して安定微小管、不安定な微小管、遊離管に分離し、マウスの各種組織における微小管の安定性を評価する方法を開発しました。...

マウス組織における安定微小管、不安定な微小管、遊離チューブリンを分離するための定量的微小管分画技術

このプロトコルは、画像診断に基づくクロマチンおよびエピジェネティック年齢(ImAge)を抽出し検証するためのイメージングおよび計算ワークフローを提示します。...

クロマチンおよびエピジェネティック老化の画像バイオマーカーを用いた単細胞老化の測定

N 6 -methyladenosine（メートル6 A）RNAに修飾を測定するための修正されたノーザンブロット法が記載されています。現在の方法は、様々な実験デザインの下で多様なRNAおよびコントロールで変更を検出することができます。...

RNAの測定方法<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup細胞や組織における&gt; -methyladenosine変更

学ぶマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質単離法による老化関連翻訳後修飾の解析。この自動化プロトコルは、質量分析による高スループットPTMプロファイリングを可能にし、細胞骨格タンパク質の年齢依存性変化を明らかにする。

複数のマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質の単離による老化に関連する翻訳後修飾の研究

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