Name: 線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 学ぶC. elegansを用いた加齢に伴うタンパク質凝集の変化検出法。遺伝子ノックダウンの影響評価とプロテオスタシス機構の解明に貢献し、老化研究の新たな知見を提供します。

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この作品は、DZNE とマリー ・ キュリー国際社会復帰グラント (D.C.D.、322120) からの資金によって支えられました。

<ol><li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+proteostasis+for+disease+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li>
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<li>Andux, S., Ellis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+maintains+oocyte+quality+in+aging+Caenorhabditis+elegans+females%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females.</a> PLoS genetics. 4, 1000295(2008).</li>
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<li>Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+elongation+factor+that+links+signals+from+the+reproductive+system+to+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 5, 1000639(2009).</li>
<li>Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+the+Trade-Off+between+Somatic+Proteostasis+and+Reproduction+in+Caenorhabditis+elegans+Models+of+Polyglutamine+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases.</a> Front Mol Neurosci. 10, 101(2017).</li>
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<li>Kraemer, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+and+defective+neurotransmission+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).</li>
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ここで報告受ける RNAi 解析質量分析法および西部にしみが付くことによって線虫の老化から高い不溶性タンパク質凝集体を分離する手法を提案する.私達は、年齢依存した蛋白質の集合を防止する IIS を大幅に減らすことによってプロテオステイシスを向上させることを示します。線虫c.エレガンス ノザン特定の集計しやすいタンパク質を選択すると、さらに固有の蛋白質凝集を調節メカニズムを分析することが可能です。
疾患関連蛋白質の集合対固有の年齢依存性蛋白質の集合 この現在の仕事は蛋白質の集合ではない疾患において集約する特定の蛋白質に制限前の調査結果に基づいています。異所萌出へ表現された疾患関連蛋白質よりもむしろ内因性凝集しやすい蛋白質に焦点を当て、期待の凝集過程の生理学的な規則に新しい洞察力を提供することです。年齢依存性タンパク質凝集体は、異なる細胞場所5で発見されて、彼らの研究もありますコンパートメントへの洞察力品質管理の特定のメカニズム。全体的に、固有の蛋白質の集合を制御...

タンパクは、広告、PD、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、前頭側頭型認知症 (FTD)、および他の多くなどのいくつかの神経変性疾患の認刻極印として認識されます。例えば、運動ニューロンの変性の細胞質集合体を形成する ALS 患者 TDP 43 または FUS ミスフォールドタンパク中の PD 患者の黒質に特にレビー小体として蓄積するアミロイド線維に α シヌクレイン アセンブリ。それぞれのこれらの神経変性疾患、プロテオスタシス蛋白質の恒常性を維持するメカニズムが病気につながるそのため、誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積を防ぐために失敗しました。
通常の条件の下でこれらの調節機構を厳密に制御タンパク質合成、折りたたみ、分解の率および細胞機能を確保するためプロテオステイシスが欠かせません。いくつかの研究は、高齢化、蛋白質の恒常性を維持するために多くの細胞や臓器の機能が徐々 に低下、年齢とプロテオステイシス ネットワークの生理的な老朽化はの重要な悪化要因を示す神経変性疾患 (参照1,2,3で確認)。タンパク質の品質管理と小胞体ストレス ストレスに対する細胞の反応が年齢に侵害されているという事実は、タンパクが老化の一般的な結果であることを示唆しています。確かに、我々 と他の示されている蛋白質の集合は病に制限されない、その代り、プロテオームの一部なる高い洗剤-不溶性高齢動物4,5,6,7 ,8,9,10。計算とin vivoの解析では、これらの生理学的な年齢関連の集計がいくつかの側面5疾患集計を似ているを明らかにしました。内因性、年齢依存した蛋白質の集合の発見は私たちに異所萌出へ表現されたひと疾患関連蛋白質を使用せずタンパク質凝集を調節する分子・細胞メカニズムを解剖する機会を与えます。現時点では、限られた情報のみが存在するは、広範なタンパク質の不溶の規制とこの破綻の生物の健康への影響について。
線虫C. elegansは、老化研究のこれらの動物は比較的短い寿命を持っているし、高い生物にみられる多くの特徴的な高齢化機能を表示、もっとも広範囲に研究のモデル生物の一つです。不溶性タンパク質の加齢の影響線虫病神経変性研究11 のフィールドに集計を抽出するために用いられている微分の溶解度に基づく逐次生化学分画によって研究されています。.定量的質量分析によるいくつかの百のタンパク質は、集計しやすい線虫病5の不在になること示されていた。ここで我々 は液体文化と西部のしみによって質量分析法と解析法による定量化のための集約された蛋白質を分離する逐次抽出にワームの大規模な番号を成長するプロトコルの詳細に説明します。高齢者の変性、集計しやすいタンパク質蓄積されていくので他の体細胞組織5,12,13 c. の elegans生殖腺およびマスク変更蛋白質の分析の焦点に生殖腺のない突然変異体を用いて非生殖ティッシュに不溶。提示方法 0.5 %sds で不溶性と比較的低い遠心速度によって小球形にされた高い不溶性、大きい総計の解析が可能。 にします。またより小さくとより可溶性凝集体を収集するほど厳しくない抽出プロトコルとなっていますまた、10を他の所で出版しました。さらに、凝集体内線虫の評価に使用する方法をについて説明します。
全体的にみて、RNA 干渉 (RNAi) との組み合わせで、これらのメソッドは、年齢依存した蛋白質の集合を調節することの興味の遺伝子の役割を評価できます。この RNAi を使用して興味の特定の蛋白質のノックダウンと若齢および老齢のワームからの抽出物の分析について述べる。これらのメソッドは、プロテオステイシス ネットワークのコンポーネント調整不溶性タンパク質を決定するための強力なツールをする必要があります。いくつかの介入など減少インスリン/インスリン様成長因子 (IGF) 1 シグナル (IIS)線虫の加齢14を劇的に遅らせることが示されています。長寿経路はしばしばタンパク質品質管理機構を誘導し、こうしてこれらの経路が積極的に影響を与えられます蛋白質の集合の率。たとえば、IIS 経路7の阻害に寿命の長い動物で減らされた内在タンパク質凝集を示す.

<table><tbody><tr><td>フェルンバッハ文化フラスコ&nbsp;</td><td>Corning</td><td>4425-2XL</td><td>Pyrex、容量2,800 ml、3つのバッフルインデントメン</td></tr><tr><td>ブレンスクリューキャップ付き&nbsp;</td><td>Schott</td><td>1088655</td><td>GL45</td></tr><tr><td>Nutating Mixer</td><td>VWR</td><td>444-0148</td><td></td></tr><tr><td>Separatory funnel</td><td>Nalgene</td><td>4300-1000</td><td>容量 1,000 ml</td></tr><tr><td>1 ml シリンジ&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>グレーニードル、27 G x &frac12; "、0.4 mm x 13 mm</td><td>BD Microlance 3</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>Membrane filters 0.025 &micro;M</td><td>Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>pH strip</td><td>Machery-Nagel</td><td>92110</td><td>pH-Fix 0-14</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Complete Mini EDTA-free tablets&nbsp;</td></tr><tr><td>オクトキシノール-9&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1388</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1317</td><td></td></tr><tr><td>Nonylphenylpolyethylenglycol</td><td>Applichem</td><td>A1694</td><td>Nonidet P40 (NP40)</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Roche</td><td>04716728001</td><td>recombinant, RNase free</td></tr><tr><td>RNaseA</td><td>Promega</td><td>A7973</td><td>solution</td></tr><tr><td>Total protein blot staining</td><td>サーモフィッシャー</td><td>S11791</td><td>Sypro Ruby プロテインブロット</td></tr>染色 <tr><td>総タンパク質ゲル染色</td><td>サーモフィッシャー</td><td>S12001</td><td>Sypro Ruby プロテインゲル染色</td></tr><tr><td>TCEP (トリス (2-カルボキシエチル) ホスフィン塩酸塩)</td> <td>Serva</td><td>36970</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>Serva</td><td>26710</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>シーケンシンググレード 修飾トリプシン</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>相対定量および絶対定量用アイソバリックタグ</td><td>Sciex</td><td>4352135</td><td>iTRAQ 試薬 マルチプレックスキット</td></tr><tr><td>遠心分離機 Avanti J-26XP</td><td>ベックマン・コールター</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機 Optima Max-XP</td><td>ベックマン・コールター</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5424R</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td>5404000413</tr><tr><td>遠心分離機 5702</td><td>エッペンドルフ</td><td>5702000329</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 メガフュージ 40R</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>75004518</td><td></td></tr><tr><td>コンセントレーター プラス</td> エ<td>ッペンドルフ</td><td>5305000304</td><td>遠心式蒸発器</td></tr><tr><td>蛍光体顕微鏡 M165 FC&nbsp;</td><td>ライカ</td><td></td><td>とプラナポ2.0x対物</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカ&nbsp;</td><td></td><td>ライカ S6E</td></tr><tr><td>高倍率顕微鏡 ツァイス Axio Observer Z1</td><td>ツァイス</td><td></td><td>PlanAPOCHROMAT 20倍対物レンズとツァイス アクシオ カム MRm</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>質量分析データの解析</td><td>Protein Prospector</td><td></td><td>http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm</td></tr><tr><td>E.coli strain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAi bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L4440</td><td>Julie Ahringer RNAi library</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans mutants</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CF2253</td><td>CGC、株名:EJ1158&nbsp;</td><td></td><td>遺伝子型: gon-2(q388)</td></tr><tr><td>C. elegans transgenics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DCD214</td><td>DZNE T&uumlのDella Davidの研究室;bingen</td><td></td><td>Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]</td></tr><tr><td>DCD215</td><td>DZNE T&uumlのDella Davidの研究室;bingen</td><td></td><td>遺伝子型: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]</td></tr></tbody></table>

線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

最後の十年では、神経変性疾患、アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD) などの有病率は成長しています。これらの加齢に伴う疾患はこれらの患者の頭脳の線維性構造タンパク質凝集体の出現によって特徴付けられます。通常水溶性タンパク質を受けるまさに、集計プロセスは不十分な理解のままになります。蛋白質の集合は病気プロセスに限定されない代わりに、正常な老化プロセスの一部により異所萌出へを使用せずタンパク質凝集を調節する分子・細胞メカニズムの研究発見表現人間疾患関連タンパク質。ここで相補的なアプローチを通じてカエノラブディティス ・ エレガンスにおける固有の蛋白質凝集を調べるための方法論について述べる。まず、高齢の動物を取得する時代同期のc. の elegansの大量に成長する方法について説明、提案する高い不溶性-大きな凝集体を分離する生化学的なプロシージャ。ターゲット遺伝子ノックダウンと組み合わせて、促進またはいずれか包括的な分析を用いた定量的質量分析法によって年齢依存した蛋白質の集合を防ぐことの興味の遺伝子の役割を分析することが可能だか、抗体の候補者ベースの分析。これらの調査結果、集計しやすい蛋白質の蛍光タグを表現するトランスジェニック動物を体内分析によるに確認します。これらのメソッドは、ある特定の蛋白質が加齢とともに集計と最終的にどのようにこれらの蛋白質を完全に機能しやすい理由を明確に役立つはずです。

どのように長寿命の動物を評価するここに示される方法を用いて削減 IIS は年齢依存した蛋白質の集合を調節します。西部のしみの (参照手順 2.2 簡易西部のしみの分析のための不溶性蛋白質の抽出)、我々 は合計とヤング (成人の日 3) の不溶性のタンパク質含有量を分析し、(成人の日 18) ワーム コントロール RNAi と RNAi ターゲットにインスリンを高齢者/ような IGF-1 受容体daf 2。認められなかった時代またはコントロールとdaf 2間の全体蛋白質のレベルに大きな変化 RNAi 条件 (図 2A)。予想通り、対照動物 (図 2B) の高い不溶性蛋白質のレベルで強力な加齢に伴う増加を検出した.Daf 2 RNAi に寿命の長い動物に比較して、集約傾向は大きく減った。全体蛋白質の不溶解性の抽出物の汚損daf 2...

ここで紹介した方法の目的は、線虫モデル有機体の正常な老化中タンパク質凝集を探索することです。プロトコルは、年齢を形成する非常に不溶解性の大きな凝集体を研究し、プロテオステイシスの変化により蛋白質の集合がどのような影響を与えるかを決定するための強力なツールを表します。

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

この実験の全体的な目標は、C.elegansの加齢に伴うタンパク質不溶性の変化を検出し、標的遺伝子のノックダウンがこの老化マーカーにどのように影響するかを評価することです。この方法は、生物が加齢とともに健康なプロテオームを維持できない理由など、老化とプロテオスタシスの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、疾患プロセスがない場合の通常の老化中のタンパク質凝集を研究する機会です。この方法は、C.elegansのタンパク質凝集に関する洞察を得ることができますが、例えば、マウスの加齢に伴うタンパク質不溶性を研究するために、他のモデル生物にも適応させることができます。治療を開始するには、添付のテキストプロトコルに記載されているように、207.45ミリリットルのS基礎培地と追加の試薬を2,800ミリリットルのFernbach培養フラスコに加えます。カルベニシリン1ミリリットルあたり50マイクログラムの最終濃度とIPTG1ミリモルを加え、フラスコをメンブレンスクリューキャップで閉じます。L1を摂氏25度のインキュベーターから取り出し、15ミリリットルのチューブに移します。L1を1、900倍gで3分間遠心分離します。回転後、上澄み液を取り除きます。顕微鏡下で、2マイクロリットルあたりのL1を数え、少なくとも9滴から得られた数値を平均化します。次に、前のステップで準備した4つのFernbach培養フラスコに、若いワームコレクションに50, 000ワーム、老化したワームコレクションに100, 000ワームを追加します。次に、線虫の数に比例して、コントロールRNAi細菌と目的の遺伝子のRNAi細菌を追加します。バクテリアを追加した後、Sベースで完全な線虫培養を行い、総容量を300ミリリットルにします。ワーム培養物を摂氏25度で、150rpmの振とうインキュベーターで収集するまでインキュベートします。2日目または3日目に若い線虫を採取して、タンパク質溶解度の基礎レベルを測定します。1つのフラスコからワームを分離漏斗に注ぎ、ワームを室温で10分間沈殿させます。ワームが沈殿した後、ストップコックを開き、ワームを1本の50ミリリットルのチューブに滴下します。次に、ワームペレットを2本の15ミリリットルチューブに分割します。チューブをM9で15ミリリットルに充填し、ワームを遠心分離します。ワームを洗うには、上清を取り除き、チューブにM9を最大15ミリリットル充填します。遠心分離を繰り返します。洗浄が完了したら、ワームを2本の50ミリリットルチューブに移し、氷冷したM9を使用して総容量を20ミリリットルに満たします。バクテリアや死んだワームを取り除くには、20ミリリットルの希釈ワームペレット2つを、20ミリリットルの氷冷した60%スクロースで満たされた2つの50

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生物学

このビデオは、老化によるプロテオスタシスの低下を決定するためのin vivoイメージングベースのアッセイを示しています。このアッセイでは、ポリグルタミンYFP融合タンパク質を体壁筋に発現する線虫Caenorhabditis...

蛍光レポーターベースの麻痺アッセイ:線虫Caenorhabditis elegansにおけるポリグルタミン蛍光レポーターの加齢に伴う進行性形成と関連麻痺を評価する技術

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Caenorhabditis elegansをモデル系として使用して、多細胞生物におけるタンパク質恒常性を研究する

蛍光寿命イメージングは、生きている、老化、およびストレスを受けたC.エレガンス病モデルにおけるタンパク質の凝集傾向を監視し、定量化し、区別する。...

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カエノハブディティス・エレガンスにおける組織特異的プロテオスタティック低下の定量化

ここでは、過活性化イオンチャネル誘導性壊死やタンパク質凝集誘発神経毒性を含む、多目的な線虫モデルを利用した広くアクセス可能な方法論を紹介し、年齢関連神経変性疾患の細胞および分子基盤を監視および解剖する。...

カエノハブディティス・エレガンスにおける年齢関連神経変性疾患のモデル化

以下のプロトコルは、プロテオスタシスの変化の評価として、ワーム培養、蛍光イメージング、およびポリグルタミン凝集体を定量するための自動画像処理のためのハイスループットワークフローの開発と最適化について説明しています。...

Caenorhabditis elegansにおける凝集定量の自動化

Caenorhabditisエレガンスにおける自動包接計数を用いた生体内のタンパク質凝集動態のモニタリング

ここでは、固体プレートベースの食事制限を行うためのプロトコルを提示...

固体プレートベースの食餌制限線虫（Caenorhabditis elegans）</em

この記事では、線虫の胚発生の初期のイベントの可視化のための手法について説明...

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

線虫を維持し、伝播の容易さ...

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

学ぶC. elegansを用いた加齢に伴うタンパク質凝集の変化検出法。遺伝子ノックダウンの影響評価とプロテオスタシス機構の解明に貢献し、老化研究の新たな知見を提供します。

線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド

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