線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド

この実験の全体的な目標は、C.elegansの加齢に伴うタンパク質不溶性の変化を検出し、標的遺伝子のノックダウンがこの老化マーカーにどのように影響するかを評価することです。この方法は、生物が加齢とともに健康なプロテオームを維持できない理由など、老化とプロテオスタシスの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、疾患プロセスがない場合の通常の老化中のタンパク質凝集を研究する機会です。

この方法は、C.elegansのタンパク質凝集に関する洞察を得ることができますが、例えば、マウスの加齢に伴うタンパク質不溶性を研究するために、他のモデル生物にも適応させることができます。治療を開始するには、添付のテキストプロトコルに記載されているように、207.45ミリリットルのS基礎培地と追加の試薬を2,800ミリリットルのFernbach培養フラスコに加えます。カルベニシリン1ミリリットルあたり50マイクログラムの最終濃度とIPTG1ミリモルを加え、フラスコをメンブレンスクリューキャップで閉じます。

L1を摂氏25度のインキュベーターから取り出し、15ミリリットルのチューブに移します。L1を1、900倍gで3分間遠心分離します。回転後、上澄み液を取り除きます。

顕微鏡下で、2マイクロリットルあたりのL1を数え、少なくとも9滴から得られた数値を平均化します。次に、前のステップで準備した4つのFernbach培養フラスコに、若いワームコレクションに50, 000ワーム、老化したワームコレクションに100, 000ワームを追加します。次に、線虫の数に比例して、コントロールRNAi細菌と目的の遺伝子のRNAi細菌を追加します。

バクテリアを追加した後、Sベースで完全な線虫培養を行い、総容量を300ミリリットルにします。ワーム培養物を摂氏25度で、150rpmの振とうインキュベーターで収集するまでインキュベートします。2日目または3日目に若い線虫を採取して、タンパク質溶解度の基礎レベルを測定します。

1つのフラスコからワームを分離漏斗に注ぎ、ワームを室温で10分間沈殿させます。ワームが沈殿した後、ストップコックを開き、ワームを1本の50ミリリットルのチューブに滴下します。次に、ワームペレットを2本の15ミリリットルチューブに分割します。

チューブをM9で15ミリリットルに充填し、ワームを遠心分離します。ワームを洗うには、上清を取り除き、チューブにM9を最大15ミリリットル充填します。遠心分離を繰り返します。洗浄が完了したら、ワームを2本の50ミリリットルチューブに移し、氷冷したM9を使用して総容量を20ミリリットルに満たします。

バクテリアや死んだワームを取り除くには、20ミリリットルの希釈ワームペレット2つを、20ミリリットルの氷冷した60%スクロースで満たされた2つの50ミリリットルチューブに追加します。チューブをすばやく遠心分離します。25ミリリットルのピペットで、上部のワーム層の最大15ミリリットルを慎重に取り除きます。

氷上に調製した37ミリリットルのM9とオクトキシノール-9に上部のワーム層を直接配置します。次に、チューブを2、700倍gで3分間遠心分離し、摂氏4度の加速9と減速7で行います。上清を捨てた後、ペレットを4本の15ミリリットルチューブに移し、氷冷したM9とオクトキシノール-9で2回洗浄します。

次に、チューブを遠心分離します。上清を取り除き、15ミリリットルのマークまでチューブに氷冷したM9とオクトキシノール-9を入れます。氷冷したM9でワームを洗い、4つのチューブを2つのチューブに組み合わせます。

チューブを15ミリリットルに充填し、遠心分離します。上清を取り除き、2本のチューブにM9を室温で合計4ミリリットルまで満たし、摂氏25度のニューティングミキサーで40分間回転させます。ナット後、氷冷したM9とオクトキシノール-9でワームを2回洗います。

次に、M9で2回洗い、ワームを1つのチューブに移します。回収前に、再アセンブリまたは阻害剤を含まないRAB高塩抽出バッファーで線虫を洗浄します。ワームペレットの上に液体がなくなるまで、上清を取り除きます。

次に、線虫ペレットの容量を推定し、阻害剤を含む同じ量のRABを添加します。ドライアイスの上に液体窒素で半分満たされた50ミリリットルのチューブを準備し、パスツールピペットを使用して、ワームを引き上げ、ゆっくりとチューブに滴下します。液体窒素を蒸発させ、凍結したワームを摂氏マイナス80度で保存して、さらに処理します。

モルタルを液体窒素で冷却し、ドライアイスの上で動物の混乱を行います。凍結したワームを予冷したモルタルに移し、2.5分間挽きます。粉末に100ミリリットルの液体窒素を加え、さらに2.5分間挽きます。

顕微鏡を使用して、ワーム本体が細かく砕かれていることを確認します。次に、粉末を2ミリリットルのチューブに移し、摂氏マイナス80度で保管します。ドライアイスの上で、1時点あたり350ミリグラムのミミズとRNAiバクテリア1つにつき2倍の2倍のミミズを2ミリリットルのチューブに計量します。

高塩溶性タンパク質を除去するには、阻害剤を含む調製済みのRABの重量あたり2容量、1ミリモルPMSF、1ミリリットルあたり200単位、および1ミリリットルあたり100マイクログラムのRNase Aを各チューブに添加し、粉末を氷上で可溶化します。懸濁液を1ミリリットルの注射器に15回引き込み、氷上で10分間インキュベートします。18、400回gで摂氏4度で20分間遠心分離します。

脂肪層を通過し、高塩溶性タンパク質を含む上清を条件ごとに1本の2ミリリットルチューブに集めます。脂肪を取り除き、廃棄します。高塩溶性タンパク質を分注して、摂氏マイナス80度で凍結します。

脂質を廃棄するには、DNase IおよびRNase Aを含まない1モルのスクロースを含む阻害剤を含む700マイクロリットルのRABでペレットを可溶化します。必ず上澄み液と脂質をすべて取り除き、捨ててください。SDS可溶性タンパク質を除去するには、ペレットを700マイクロリットルのRIPAバッファーで可溶化します。

懸濁液をシリンジに10回引き込み、氷上で10分間インキュベートします。18,400gで摂氏4度で20分間遠心分離します。SDS可溶性タンパク質を含む上清を採取し、分注してマイナス80°Cで凍結します。

各ペレットを500マイクロリットルのRIPAバッファーで可溶化した後、各条件の2つのサンプルを一緒にプールし、懸濁液をシリンジに10回引き上げます。上澄み液をすべて取り除いて捨てるように注意してください。非常に不溶性タンパク質を含む最終ペレットを400マイクロリットル70%ギ酸で可溶化し、懸濁液をシリンジに20回引き込みます。

懸濁液を氷上で20分間インキュベートします。超遠心チューブ内の懸濁液を遠心分離して、ワームキューティクルの破片を取り除きます。不溶性の高いタンパク質を含む上清液を採取し、マイナス80°Cで凍結します。

若齢および高齢の線虫の不溶性タンパク質含有量の全タンパク質染色では、対照動物では高不溶性タンパク質レベルの加齢に伴う大幅な増加が明らかになりましたが、長命動物ではそうではありませんでした。予測されるプリオン様ドメインを持つRNA結合タンパク質であるPAB-1の抗体染色により、長命の動物が加齢とともにPAB-1を可溶性に維持するという質量分析データが確認されました。咽頭筋にtagRFP PAB-1を発現するトランスジェニック動物についてin vivo解析を行った。

若い動物では、tagRFP PAB-1は主に咽頭全体にびまん性に存在していました。年齢とともに、後咽頭球から始まる明るい点の漸進的な蓄積。また、老化の過程で、咽頭前球の凝集が観察される動物が増えていきました。

野生型およびdaf-2変異体の背景における年齢による異なるtagRFP PAB-1凝集レベルの定量化により、長命動物における年齢に伴うtagRFP PAB-1凝集の遅延が明らかになりました。このビデオを見れば、タンパク質抽出のために多数の寄生虫を採取する方法や、質量分析やSDSページによるさらなる分析のために難溶性の高い大型凝集体を分離する方法について十分に理解できるはずです。