蛍光遺伝子にコードされた pH インジケーターとキイロショウジョウバエのマルピギー氏管の上皮細胞で光の定量化の細胞内 pH

このイメージングプロトコルの全体的な目標は、遺伝的にコードされたpHインジケーターを使用して細胞内pHの定量を説明し、この方法を使用して昆虫の腎臓構造モデルであるマルピーギ尿細管における基底外側プロトン輸送を評価する方法を実証することです。この方法は、特定のトランスポータータンパク質が細胞内pH調節における上皮プロトン運動にどのように寄与するかなど、細胞輸送分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、細胞輸送を無傷の上皮の複数の機能的に異なるゾーンにわたって迅速かつ容易に評価できることです。

この方法は、pH調節と昆虫上皮に関する洞察を提供することができますが、培養中の哺乳類ネフロンや上皮細胞などの他のシステムにも適用できます。この手順を開始するには、イメージング顕微鏡ステージに2セットのはんだ付け補助ハンドクランプを配置し、両側に1つずつクランプを配置します。次に、それぞれの曲げガラスキャピラリーと流入線、および真空接続された、流出線を挿入する。

次に、補助的な手に取り付け、顕微鏡のイメージングステージに合わせます。真空グリースを天井テープに広げ、接着剤の豊富ウェルディバイダーをテープに押し付けて、底にグリースを塗ります。接着剤灌流ウェルディバイダーをはがし、ポリリジンコーティングされたスライドの上にグリース面を下にして置きます。

その後、灌流ウェルディバイダーを取り外して、個々の特定のウェルを疎水性グリースで追跡したままにします。その後、200マイクロリットルの室温IPBSまたは昆虫リン酸緩衝生理食塩水をグリースを塗ったものに入れ、ポリリジンコーティングスライド上をよく円で囲みます。次に、スライドをステロスコープの下に置き、氷冷したシュナイダーの培地を解剖皿に注ぎ、麻酔をかけた1匹のメスのハエをそれに移します。

ハエを鉗子のセットで胸部に持ち、もう一方の鉗子を使用して後腹部を優しくつかみます。フライの後端を短く意図的な動きで引き開きます。後部ガードが見えたら、遠位端をつかみ、短い引っ張りを繰り返して後部ガードを体から引き離すことにより、腸と下側の気管からアンティを解放します。

次に、細い鉗子で尿管の前部アンティをつまんで、2番目のアンティセットが腹部から解放されたら。ポールガラスロッドでフリーアニテールアンティを拾い上げ、ロッドを尿管の下にスライドさせて、尿細管が両側に落ちるようにします。その後、アンティをまっすぐ上に持ち上げて溶液から取り出し、その後、アンティと尿管がロッドの下側に付着するようにガラスロッドを回します。

尿管をスライドにまっすぐ下に下げてから、尿管を固定し、尿管をスライドガラスにさらに押し付けて、アンティの遠位端をシールします。ガラスロッドの細い端を使用して、スライド面を横切って各細管を優しく掃き取ります。ロッドをスライドに押し付けて細管を押しつぶさないようにし、ロッドを細管の上部にスライドさせ、遠位から近位に移動して、各細管の全長をポリリジンコーティングスライドの表面に取り付けます。

この技術の成功は、マルピーギ前部尿細管の正確な同定と慎重な取り扱いに完全に依存しています。損傷した尿細管は、一貫性のない結果をもたらします。次に、接着剤の豊富ウェルディバイダーをスライドに戻し、取り付けられた尿細管に十分に充填された小さな流体を形成します。

その後、標本を顕微鏡ステージに置きます。流入キャピラリーとアウトフローキャピラリーを、それぞれプロフュージョンウェルの入口と出口の開口部に配置します。この手順では、顕微鏡、光源、イメージングシステムの電源を入れてから、イメージングソフトウェアを開きます。

接眼レンズを覗き込み、アンティのルーメンが透過光の下にはっきりと見えるまで、手動でピントを調整します。次に、アクイジション・タブをクリックし、調光プルダウン・メニューでアクイジション・ロード・セクションの「2x2」を選択します。光路に5%の減光フィルターを挿入して、照明光を減らし、光の退色を最小限に抑えます。

チャンネルメニューのGFPチャンネルをクリックし、ライブをクリックしてカメラで蛍光シグナルを観察します。その後、タイムスライダーを調整して露光時間を設定し、強度ヒストグラムの最も明るいピクセル値が最大値の約40%になるようにします。次に、[停止]をクリックしてイルミネーションを停止します。

RFPチャネルで手順を繰り返し、前歯部の拡張した初期セグメントの存在と、組織の損傷または過剰発現を示す細胞固形mチェリー凝集体の欠如を確認します。その後、時系列チェックボックスをクリックして、タイムラプスイメージングプロトコルを有効にします。プルダウンメニューの時系列セクションでデュレーションを10分に、インターバルスライダーをゼロに調整して、最大画像取得の合計キャプチャ時間を設定します。

次に、チャネルセクションのGFPボックスとRFPボックスの両方をオンにします。適切なバルブコントローラーをアクティブにして、プロフュージョンシステムのIPBSラインを開き、クリックしてイメージングプロトコルを開始します。1分後、適切なバルブを開き、IPBSラインを閉じることにより、塩化アンモニウムポスト溶液に20秒間切り替えます。

次に、塩化アンモニウムラインを閉じ、IPBSバルブを再度開いてIPBSに戻ります。2点キャリブレーションを実行するには、ウェルディバイダーを下にあるスライドから剥がして取り外し、クランプ内のプロフュージョンキャピラリーをイメージングウェルから取り外します。その後、200マイクロリットルのキャリブレーションIPBSバッファーをpH 7.4に適用します。

次に、イメージングウェルから溶液を取り出し、さらに200マイクロリットルのキャリブレーション溶液と交換します。このプロセスを4回繰り返して、完全な溶液交換を確実にします。次に、調製およびキャリブレーション溶液をインキュベートしてからイメージングします。

以前に決定したのと同じパラメータを使用してイメージングプロトコルを繰り返しますが、画像キャプチャは1分のみ変更されます。次に、200マイクロリットルのキャリブレーションIPBSバッファーをpH 9に加えます。イメージングウェルから溶液を取り出し、さらに200マイクロリットルのキャリブレーション溶液と交換します。

その後、調製物を第2のキャリブレーション溶液で10分間インキュベートしてからイメージングし、イメージングプロトコルを繰り返します。その後、フレーム スライダーで画像スタックをスクロールしながら、MeanROI をクリックして、どちらのチャネルのピクセルも飽和していないこと、および強度ヒストグラムで報告された値が検出可能な最大値に達していないことを確認して、画像解析ソフトウェアでスタックされた画像を確認します。次に、蛍光強度と蛍光比をプロットして画像スタックを分析し、時間の関数であり、ここでは、指示薬のpH感受性チャネルとpH非感受性チャネルにおける塩化アンモニウムパルスに対する予想される蛍光応答を確認します。

これらのシグナルの比率は、細胞内のpH過渡性を明らかにします。この分析を実行するには、まず [meanROI] をクリックし、自由形式ツールを選択します。マウスを左クリックしたままにすると、50 μm の MT をトレースし、右クリックして ROI の描画が終了します。

次に、MT に隣接する領域でこれを繰り返して、バックグラウンド ROI を定義します。次に、測定の下の平均強度をクリックし、エクスポート、データテーブル、作成をクリックして強度値のテーブルを作成します。設定クロックホイールアイコンをクリックし、時間と平均強度を除くすべてのパラメータの選択を解除します。

新しく作成したデータテーブルのタブを右クリックし、[名前を付けて保存]を選択し、データをcsvファイルとしてエクスポートします。ここに示すのは、広視野像であり、前アンテの細胞と前アンテの星状細胞の原理細胞における超楕円型蛍光フッ素である。星状細胞は、最初のセグメントでは棒状になり、移行セグメントでは可変になり、メインセグメントでは明確な細胞突起を示すことに注意してください。

このグラフは、関心領域における20秒間の40ミリモル塩化アンモニウムパルスに対する較正された細胞間pHの変化を示しています。破線の曲線は、塩化アンモニウムの回収後の酸回収フェーズに適用される単一の指数関数的適合を示します。そこから、減衰した定数値が導出されます。

このグラフは、細胞内 pH の関数としてプロットされた酸の押し出し速度を示し、このグラフは、前の図の指数関数的な近似から導き出された細胞内 pH の関数としてプロットされた酸フラックスを示しています。一度習得すると、マルピーギ尿細管の抽出は、適切に実行されれば、10分以内に行うことができます。この手順を試みる際には、成功が完全に解剖の品質とpHインジケーターの正確なキャリブレーションにかかっていることを覚えておくことが重要です。

この調製物は、蛍光カルシウムやハロゲン化物インジケーターなどの他の遺伝的にコードされたバイオセンサーと組み合わせて、上皮細胞の溶質運動と細胞内シグナル伝達を研究することができます。このビデオを見れば、健康なショウジョウバエのマルピーギ尿細管の調製方法、遺伝的にコードされたpHインジケーターの画像化方法、上皮細胞内のプロトン運動の定量化方法について十分に理解できるはずです。ニトロイゼンでの作業は危険で損傷を与える可能性があるため、この手順を実行する際には、再利用する機器を汚染しないように予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。