Name: 蛍光遺伝子にコードされた pH インジケーターとキイロショウジョウバエのマルピギー氏管の上皮細胞で光の定量化の細胞内 pH (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 学ぶ 蛍光遺伝子pHインジケーターpHerryを用いたDrosophila melanogasterマルピギー氏管の細胞内pH定量法。上皮細胞の基底側プロトン輸送をリアルタイムで評価し、昆虫腎臓モデルでのイオン輸送機構を解明する。

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MFR. AJR を DK100227 は、T32 DK007013 によって支えられ、この仕事は、NIH の DK092408 によって支えられました。著者は、CapaR GAL4 と c724 GAL4 博士ジュリアン A.T. ダウを感謝したいショウジョウバエ株。我々 はまた実験飛ぶ十字架を維持支援のためヤコブ B のアンダーソン氏を感謝します。

著者が明らかに何もありません。

ショウジョウバエMTs で pH は私の定量化の成功は健康抽出された MTs と取り付けと郭清 (図 A - C) の質によってまったく異なります。したがって、組織としての慎重な取り扱いは説明が不可欠です。新鮮な PLL でコーティング スライド大幅にソリューションにさらされて以前のスライド援助 MT マウントよりもはるかに多くの接着剤をする傾向にあります。注意取り付けは MT の明瞭な区分 (図 D) の識別にも役立ちます。健康的な MTs mCherry 集計を削減し、それぞれ酸押出のより一貫した多くの定量化を降伏によって pHerry と機能的アセスメントの校正を容易にします。いくつかのケースで mCherry 集計を避けることは不可能です、実験条件が本質的に MT 上皮を損傷したり、蛍光レポーターの重要な過剰発現を生成これらのケースで擬似レシオ メトリック校正正規化蛍光比 1.0 pH私7.0 に対応、ポイント校正の定量化 (<s...

このプロトコルの目的は、遺伝子にコードされた pH インジケーター (GEpHI) を用いた細胞内 pH (pHi) の定量化と基底モデル昆虫 (+ H+輸送を評価するためのこのメソッドの使用方法を示すキイロショウジョウバエ) 腎構造のマルピギー氏管 (MT)。MTs は、ショウジョウバエの排泄器官として、いくつかのキーの点1に哺乳類のネフロンに機能的に似ています。MTs は、胸郭、ハエの腹部の (前部と後部) の尿細管の 2 組として配置されます。各 MT の単一細胞上皮管が根尖を明確なの代謝活性の主細胞から成る (内腔) 介在の星状細胞と同様、基底 (hemocoel) 極性と。発達個別のセグメント、特に初期拡張尿管2に結合分泌の主要なセグメント、経過セグメントは、セグメントおよび形態学的、機能的には、3 前方 MTs が構成されます。携帯電話のスケールで内腔の上皮細胞のイオン輸送、頂端膜 V-atpase3アルカリ金属/H+交換と基底 Na+K+で実現-atp アーゼの4、チャンネル5、Na+は、内向き整流性 K+ -Cl−/HCO3−交換 (NDAE1)6、および Na+K+を駆動-2 Cl−共輸送 (NKCC;Ncc69)7、星状細胞仲介 Cl- 、水輸送8,9。この複雑なアクセス可能な生理学的システムは、ショウジョウバエの遺伝学的および行動の多様なツールセットと組み合わせた場合の内因性イオン伝導機構の調査のための優秀な機会を提供します。
このプロトコルのための理論的根拠は動作し、他のモデルのシステム ツールのエクスポートの統合セルからの潜在性の上皮膜イオン輸送を研究するため遺伝子組み換え可鍛性システムを記述します。PHerry10の式、グリーンの pH に敏感な超黄道 pHluorin11,12 (セフ) と赤の pH に依存しない mCherry13MTs での融合から派生した GEpHI を許可の H+輸送の定量化高 K+/nigericin 校正テクニック14を介して単一の mt 野細胞。多くのイオン輸送体は、H+同等を移動、細胞内 pH は私の定量化はさまざまなトランスポーターを介してイオン移動の関数表現として機能します。ショウジョウバエMT モデル システムはまた組織特異遺伝子15と細胞イメージング全体オルガン試金17と組み合わせて使用することができますが、RNA 干渉 (RNAi)16式の強力な遺伝的ツールを提供しています,18,分子から行動への垂直統合の堅牢なツールセットを作成する尿細管機能の19 。これは対照的に他の多くのプロトコルに歴史的にそのような測定が複雑に依存している、上皮の生物学の評価とマイクロ郭清、洗練されたイオン選択性電極20,21, を大変なの略します。高価な pH 感受性色素を22制限荷重要件と異種組織の細胞特異性悪い。GEpHIs は、広く pH私携帯型23の様々 な測定に使用されています。初期の作品は固有 pH 感受性の緑色蛍光タンパク質 (GFP) pH私培養上皮細胞24を監視するを悪用されるが、過去 20 年を見た使用ニューロンで25、グリア26、菌類27 GEpHIs、植物細胞28。GAL4/UA 式システム15とショウジョウバエMT の生理ユーザー補助の遺伝的構造の細胞ターゲットの可能性の組み合わせはこの pHの調査のための理想的な準備をする私規制と上皮膜イオン輸送。
pH私規制は何十年も研究されている、生活に不可欠です。MT の準備では、pH私の調節の生理学を教えるが、また実行する堅牢なモデル洗練された pHi規制前のヴィヴォとin vivoの調査を提供しています。このプロトコルはショウジョウバエNH4Cl パルス酸法21の読み込みを使用して MT の上皮細胞の基底膜で H+運動の定量化をについて説明しますが、pH 指示薬としては遺伝子エンコードすると、任意の影響を受けやすい遺伝子導入とライブ イメージングの準備にこれらのメソッドとその理論的枠組みを適用できます。

<table><tbody><tr><td>ポリ-L-リジン(PLL)溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>4°Cで保存;C、再利用できます。</td></tr><tr><td>ニゲリシンナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>注意:手袋をはめて取り扱ってください。20 mMストック溶液のアリコートとして、4°CのDMSOで保存してください。</td></tr><tr><td>接着剤灌流チャンバーカバー、接着剤サイズ1 mm、チャンバー径&times; 厚さ9 mm &times; 0.9 mm、ポート径1.5mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL622105</td><td>必要に応じて灌流システムに合わせて代用することができます。</td></tr><tr><td>シルガード 184 シリコーン エラストマー キット</td><td>エルスワース 接着剤</td><td>184 SIL エラスト キット 0.5KG</td><td>複数のベンダーから入手可能です。</td></tr><tr><td>ヘルピングハンズはんだ付けスタンド</td><td>港湾貨物工具</td><td>60501</td><td>複数のベンダーから入手可能です。</td></tr><tr><td>バルブコントローラ、8対1マニホールド、レサーバ付きオープン重力給水灌流システム</td><td>バイオサイエンスツール</td><td>PS-8S</td><td>同等の灌流システムを使用することができます。</td></tr><tr><td>フローレギュレータ</td>ー <td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>64-0221</td><td>必要に応じて灌流システムに合わせて代用することができます。</td></tr><tr><td>シュナイダーのミディアム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>21720024</td><td>ストアは4°です。滅菌アリコートのC。</td></tr><tr><td>#5 イノックス鋼鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-20</td><td>実験者の快適さに基づいて代用できます。</td></tr><tr><td>35 x 10 mmポリスチレンシャーレ</td><td>コーニングライフサイエンス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック 08-757-100A</td><td>正確なブランドとサイズは重要ではありません。</td></tr><tr><td>75 x 25 mm顕微鏡スライド</td><td>Corning Life Sciences</td><td>2949-75X25</td><td>灌流ウェルが互換性がある限り、正確なブランドとサイズは異なる場合があります。</td></tr><tr><td>Filimentedホウケイ酸キャピラリーガラス、ID 1.5 mm、OD 0.86 mm、厚さ0.32 mm</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0796</td><td>Filimentは不要で、灌流チューブと灌流ウェルに合わせてガラスを代用できます。</td></tr><tr><td>タイゴンチューブ、ID 1/16インチ、OD 1/8インチ、厚さ1/32インチ</td> <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-171-129</td><td>複数のベンダーから入手可能で、灌流システムに合わせて代用できます。</td></tr><tr><td>真空シリコーングリース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td>複数のベンダーから入手可能です。</td></tr><tr><td>プラスチックフローコントロールクランプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-869</td><td>複数のベンダーから入手可能、無菌性は不要</td></tr><tr><td>ガラスロッド、直径5mm</td><td>delphiglass.com</td><td>9198</td><td>正確なサイズは個人の好みであり、複数のベンダーが利用可能</td></tr><tr><td>PAP 疎水性ペン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Z377821</td><td>複数のベンダーから入手可能です。</td></tr><tr><td>シーリングフィルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668</td><td>複数のベンダーから入手可能です。</td></tr><tr><td>15mL Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>複数のベンダーから入手可能です。</td></tr><tr><td>50 mL Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>複数のベンダーから入手可能です。</td></tr><tr><td>HEPES; 4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>複数のベンダーから入手可能。</td></tr><tr><td>MES; 4-モルホリンエタンスルホン酸一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td>複数のベンダーから入手可能です。</td></tr><tr><td>タップ;N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-3-アミノプロパンスルホン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5130</td><td>複数のベンダーから入手可能です。</td></tr><tr><td>10X/0.45 Air Objective</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-139</td><td>同等の対物レンズを代用できます。40X対物レンズはシングルセルイメージングに使用できます。</td></tr><tr><td>解剖ステレオスコープ</td><td>Zeiss</td><td>Discovery.V8</td><td>任意の解剖立体鏡を使用することができます。</td></tr><tr><td>UAS-pHerry トランスジェニック Drosophila melagnogaster</td> <td>ロメロラボ</td><td></td>から入手可能 <td>初出: 引用 10</td></tr><tr><td>capaR-GAL4 ドライバーライン Drosophila melagnogaster</td><td>ロメロラボ</td><td></td>から入手可能 <td>初出: 引用 32</td></tr><tr><td>c724-GAL4 ドライバーライン Drosophila melagnogaster</td><td>ロメロラボ</td><td></td>から<td>入手可能 初公開:引用2</td></tr><tr><td>単色高感度デジタルカメラ</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam 506 mono</td><td>正確なブランドとモデルは異なる場合があり、ライブ細胞イメージングに適した任意の単色高感度カメラに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>GFP/FITCフィルターセット、470/40 nm ex.、515 nm longpass em.、500 nm dichroic</td><td>Chroma</td><td>CZ909</td><td>任意のGFP/FITCファイラーセットを代用できます。</td></tr><tr><td>RFP/TRITCフィルターセット、546/10 nm ex.、590 nm longpass em.、565 nm dichroic</td><td>Chroma</td><td>CZ915</td><td>GFP/FITCファイラーセットなら何でも代用できます。</td></tr><tr><td>倒立エピフルオレッセント顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z.1</td><td>電動フィルタースイッチを備えた同等の顕微鏡を使用することができます。正立顕微鏡は、オープン灌流浴および水浸対物レンズで使用できます。</td></tr><tr><td>統計解析ソフトウェア</td><td>Microcal</td><td>Origin 6.0</td><td>同等の機能を持つ任意のソフトウェアで代用可能</td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>国立衛生研究所</td><td>ImageJ 1.50i</td><td>同等の機能を持つ任意のソフトウェアで代用可能</td></tr><tr><td>画像取得ソフトウェア</td><td>Zeiss</td><td>Zen 1.1.2.0</td><td>同等の機能を持つ任意のソフトウェアで代用可能</td></tr><tr><td>片刃炭素鋼カミソリブレード</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71960</td>複数の<td>ベンダーから入手可能です。</td></tr><tr><td>顕微鏡用スライドフォルダー</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-04</td><td>複数のベンダーから入手可能です。</td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-110-1231</td><td>複数のベンダーから入手可能です。</td></tr><tr><td>ポリストレンショウジョウバエ飼育バイアル、フラッグ付き</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>32-109BF</td><td>同等のアイテムで代用できます。</td></tr><tr><td>2.5 L ラボ用アイスバケツ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-210-129</td><td>複数のベンダーから入手可能です。</td></tr><tr><td>NMDGです。N-メチル-D-グルカミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>複数のベンダーから入手可能です。</td></tr><tr><td>200 uL バリアピペットチップ</td><td>MidSci</td><td>AV200</td><td>複数のベンダーから入手可能です。</td></tr><tr><td>200 &#956;L可変容量ピペット</td><td>Gilson Incorporated</td><td>PIPETMAN P200</td><td>複数のベンダーから入手可能です。</td></tr></tbody></table>

蛍光遺伝子にコードされた ph インジケーターとキイロショウジョウバエのマルピギー氏管の上皮細胞で光の定量化の細胞内 ph

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

上皮膜イオン輸送は本質的な細胞の電気化学勾配の維持と同様、全身のイオンの恒常性に不可欠です。多くのイオン輸送体 (pH私) 細胞内 pH の影響を受けて、トランスポーター活性を評価するための便利なツールは、このように pH は私を監視します。モダンな遺伝子にエンコードされた pH-指標 (GEpHIs) は細胞および細胞内の規模で pH私そのままなセルの光学的定量化を提供します。このプロトコルは細胞 pH私の規制のキイロショウジョウバエのマルピギー氏管 (MTs) で前のヴィヴォライブ イメージングによる pHerry、pKで擬似レシオ メトリック GEpHI リアルタイム定量化をについて説明します、細胞質の pH 変化を追跡に適しています。抽出された大人のフライ MTs は単一細胞層上皮の形態学的、機能的に独立したセクションで構成され、上皮の輸送の調査のためのアクセス可能で、遺伝的に扱いやすいモデルとして利用できます。GEpHIs は、従来の pH に敏感な蛍光染料とイオン選択性電極上のいくつかの利点を提供しています。GEpHIs 適切な促進者の要素が使用異なる細胞集団にラベルを付けることができます。この方、前のヴィヴォ体内、および本質的に不均一であるその場で準備に便利です。GEpHIs もそのままティッシュで繰り返される色素の治療や組織の外部化を必要とせず時間をかけて pHiの定量化を許可します。現在の GEpHIs の主な欠点は、組織の損傷の応答のゾル性細胞質包有物の集約し、過剰発現を構築する傾向です。抽出されたフライ MTs の機能的に異なるプリンシパルと星状細胞に基底プロトン (H+) 輸送の評価を通じて、この議定書では、これらの欠点、彼らのソリューション、および GEpHIs の固有の利点を示した。技術と説明する分析が容易に適応できる幅広い脊椎動物と無脊椎動物の準備と特定のトランスポーターを介してイオン流束の複雑な測定の演習を教えるからアッセイの洗練されたことができます。

健康な組織や前方の MTs を適切に識別、このプロトコルの成功に不可欠です。解剖時に注意が必要なく、直接タッチする MTs とだけハンドルに直接 MTs をグリップとして尿管によってそれらは (図 4 a- B) の破損に 。MTs はスライドにフラットを掃引、細管を可能な限り少し触れられなければならないし、これを回避余分な動きは単一細胞上皮層 (図 4) に損傷を与えます。正常解剖前方 MTs も上皮細胞と形態的に異なる尿細管セグメントの細胞質を赤と緑の蛍光分布が表示されます。不適切な血流によって尿細管損傷またはミスなしの対緑の集計と赤い蛍光性の集計が表示され、誤認後部 MTs が表示されます (図 4) 遠位尿管近位の盲目の端から制服の形態. 
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細胞のイオン輸送は細胞内 pH モニタリングによってしばしば評価される(pH私)。遺伝子 Encoded pH 指示薬(GEpHIs)は、そのまま細胞内 pH の光学的定量化を提供します。このプロトコルは細胞前のヴィヴォライブ イメージング pHerry とキイロショウジョウバエのマルピギー氏管の細胞内 pH の定量化の詳細については、擬似レシオ メトリック遺伝子にエンコードされた pH インジケーター。

蛍光遺伝子にコードされた pH インジケーターとキイロショウジョウバエのマルピギー氏管の上皮細胞で光の定量化の細胞内 pH

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

このイメージングプロトコルの全体的な目的は、遺伝子組み込み型pHインジケーターを用いて細胞内pHの定量化について記述し、この手法を用いて昆虫の腎臓構造モデルであるマルピーギ管における基底側プロトン輸送をどのように評価できるかを示すことです。この手法は、特定の輸送体タンパク質が細胞内pH調節における上皮細胞のプロトン移動にどのように寄与しているかなど、細胞輸送分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、無傷の上皮における機能的に異なる複数の領域にわたる細胞輸送を、迅速かつ容易に評価できることです。この手法は、pH調節や昆虫の上皮に関する知見を得るのに役立ちますが、哺乳類のネフロンや培養上皮細胞などの他の系にも適用可能です。この手順を開始するには、イメージング顕微鏡のステージ上に2セットの半田付け用ヘルピングハンドクランプを、左右に1つずつ配置します。次に、それぞれの曲げガラスキャピラリーと、流入ライン、および真空接続された流出ラインを挿入します。次に、それらをヘルピングハンドに固定し、顕微鏡のイメージングステージに合わせて配置します。シーリングテープに真空グリースを塗り、接着剤付き灌流ウェルディバイダーをテープに押し付けて、底面をグリースでコーティングします。接着剤付き灌流ウェルディバイダーを剥がし、グリースが塗られた面を下にして、poly L lysine コーティング済みのスライドガラスの上に置きます。その後、灌流ウェル用ディバイダーを取り除き、疎水性グリースで描かれた個別の特定ウェルのみを残します。次に、ポリLリジンでコーティングされたスライド上のグリースで囲まれた円形ウェルに、室温のIPBS（昆虫用リン酸緩衝生理食塩水）を200 µL加えます。その後、スライドを実体顕微鏡下に設置し、解剖皿に氷冷したSchneider's mediumを注ぎ、麻酔をかけた雌のハエ1匹をそこに移します。ピンセットでハエの胸部を固定し、もう一方のピンセットで後腹部をそっと掴みます。短い慎重な動作で、ハエの後端を広げます。後腸（hind guard）が見えたら、その遠位端を掴み、後腸を体から繰り返し短く引っ張ることで、下層の気管（tracheales）から腸と前腸（antes）を切り離します。次に、2組目の前部尿管口が腹腔から離れたら、微細鑷子で尿管の前部尿管口をつまみ切ります。尿管の下にガラス棒を滑り込ませて、尿管口の両側に管が垂れ下がるようにして、自由になった前部尿管口をガラス棒ですくい上げます。その後、尿管口を溶液から真っ直ぐ上に持ち上げ、ガラス棒を回転させて、尿管口と尿管が棒の底面に付着するようにします。尿管をスライドの上に真っ直ぐに下ろし、さらに尿管をガラススライドに押し付けることで、尿管を固定し、尿管端の遠位側を密封します。ガラス棒の細い端を使用して、各尿管をスライド表面に沿ってゆっくりと掃くように動かします。尿管を押し潰さないよう、ガラス棒をスライドに接触させながら、遠位から近位に向かって尿管の上を滑らせ、尿管の全長をポリリシンコートスライドの表面に密着させます。この手法の成否は、前方のマルピギー管を正確に同定し、慎重に扱うかどうかに完全に依存しています。管が損傷すると、結果に不整合が生じます。次に、接着剤付きのプロフュージョンウェルディバイダーをスライドに戻し、固定した管の上に少量の液体で満たされた小さなウェルを形成させます。その後、検体を顕微鏡ステージ上に配置します。流入および流出キャピラリーを、それぞれ灌流ウェルの入口と出口の開口部の上に位置させます。この手順において、顕微鏡、光源、およびイメージングシステムをオンにし、次にイメージングソフトウェアを開きます。接眼レンズを覗き、透過光下でantesの管腔がはっきりと見えるまで手動で焦点を調整します。次に、「acquisition」タブをクリックし、「acquisition load」セクションのディミングプルダウンメニューで「2x2」を選択します。照明光を減少させ、光退色を最小限に抑えるために、光路に5%の中性濃度フィルターを挿入します。チャンネルメニューのGFPチャンネルをクリックし、「live」をクリックして、カメラを介して蛍光信号を観察します。その後、タイムスライダーを調整して露光時間を設定し、強度ヒストグラムの最大ピクセル値が最大値の約40%になるようにします。次に「stop」をクリックし、照明を停止します。RFPチャンネルで同様の手順を繰り返し、前方の前者の拡張した初期セグメントが存在すること、および組織損傷や過剰発現を示すcytosolid m cherry凝集塊が存在しないことを確認します。その後、「time series」チェックボックスをクリックしてタイムラプスイメージングプロトコルを有効にします。タイムシリーズセクションのプルダウンメニューで期間を10分に調整し、インターバルスライダーをゼロに設定することで、最大の画像取得回数で総撮影時間を設定します。次に、チャンネルセクションでGFPとRFPの両方のボックスにチェックを入れます。適切なバルブコントローラーを起動してプロフュージョンシステムのIPBSラインを開き、「start experiment」をクリックしてイメージングプロトコルを開始します。1分後、適切なバルブを開いてIPBSラインを閉じることで、20秒間塩化アンモニウム後溶液に切り替えます。次に、塩化アンモニウムラインを閉じ、IPBSバルブを再度開くことで、IPBSに戻します。2点校正を行うには、ウェルディバイダーを下層のスライドから剥がして取り除き、イメージングウェルからクランプに固定されたプロフュージョンキャピラリーを取り出します。その後、pH 7.4の校正用IPBSバッファーを200 microliters添加します。次に、イメージングウェルから溶液を取り除き、別の200 µLのキャリブレーション溶液で置き換えます。溶液を完全に交換するため、この操作を4回繰り返します。その後、イメージングを行う前に、調製物とキャリブレーション溶液を30分間インキュベートします。以前に決定したパラメータを用いてイメージングプロトコルを繰り返しますが、画像キャプチャ時間は1分のみに変更してください。次に、pH 9に調整したキャリブレーション用IPBSバッファーを200 µL加えます。イメージングウェルから溶液を取り除き、別のキャリブレーション溶液200 µLと置換します。続いて、イメージングを行う前に、試料を2番目の校正溶液で10分間インキュベートし、イメージングプロトコルを繰り返します。その後、画像解析ソフトウェアでキャプチャしたスタック画像を確認し、MeanROIをクリックして両チャネルのピクセルに飽和がないこと、およびフレームスライダーで画像スタックをスクロールしながら、強度ヒストグラムに報告された値が最大検出値に達していないことを確認します。次に、蛍光強度と蛍光比を時間の関数としてプロットし、画像スタックを解析します。ここでは、指示薬のpH感受性チャネルとpH非感受性チャネルにおける、塩化アンモニウムパルスに対する期待される蛍光応答が確認できます。これらの信号の比率から、細胞内pHの過渡的な変化が明らかになります。この解析を行うには、まずmeanROIをクリックし、フリーフォームツールを選択します。マウスの左ボタンを押しながら50 µmのMTをトレースし、右ボタンをクリックしてROIの描画を完了させます。次に、背景ROIを定義するため、MTに隣接する領域で同様の操作を繰り返します。続いて、「measurements」の下にある「mean intensity」をクリックし、「export」、「data table」、「create」の順にクリックして強度値のテーブルを作成します。設定の時計車アイコンをクリックし、「time」と「mean intensity」以外のすべてのパラメータの選択を解除してください。新しく作成されたデータテーブルのタブを右クリックし、「名前を付けて保存」を選択して、データをcsvファイルとしてエクスポートします。ここに示されているのは、前方の前庭細胞および前方の星状細胞の主細胞における、広視野画像および超楕円蛍光画像です。星状細胞は、初期分節では棒状であり、移行分節では形態が多様で、主分節では明確な細胞突起を示すことに注意してください。このグラフは、関心領域における20秒間、40 millimolar 塩化アンモニウムパルスに応答した、校正済みの細胞内 pH 変化を示しています。点線は、塩化アンモニウム除去後の酸回復相に適用した単一指数近似曲線を表しています。これにより、減衰定数算出されます。このグラフは、前図の指数近似から導出された、細胞内pHの関数としてプロットされた酸排出速度および酸フラックスを示しています。習得すれば、適切に実施することでマルピーギ管の摘出は10分以内に完了できます。この手順を行う際は、成功が完全に解剖の質とpH指示薬の正確な校正にかかっていることを忘れないでください。この調製法は、蛍光カルシウム指示薬やハロゲン化物指示薬などの他の遺伝子符号化バイオセンサーと組み合わせることで、上皮細胞における溶質の移動や細胞内シグナル伝達の研究に利用できます。このビデオを視聴することで、健全なショウジョウバエのマルピーギ管の調製方法、遺伝子符号化pH指示薬のイメージング方法、および上皮細胞におけるプロトン移動の定量化について十分に理解することができます。ニトロイゼンを扱う際は危険が伴い、試料を損傷させる可能性があるため、本手順の実施中は、再利用する器具に汚染が広がらないよう十分な注意を払ってください。

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生物学

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

この記事では、雌のショウジョウバエからの前方マルピーギ尿細管(MT)の解剖と、Rossanoらによるプロトコルの例について説明しています。(2017)では、灌流チャンバーでのライブイメージングのためにMTを準備しています。...

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このビデオは、成虫のショウジョウバエの細菌性食作用を測定するために設計されたin...

成虫のショウジョウバエにおける細菌性食作用を定量するためのIn vivoアッセイ

出典:Wagner, K. et al., Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-tagged Proteins. J. Vis. Exp.

ショウジョウバエの視細胞における膜タンパク質輸送の研究

pH感受性蛍光体で膜タンパク質の細胞外ドメインをラベリング、superecliptic pHluorin（SEP）は、細胞内局在、発現、および人身売買を決定することができます。全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の撮像SEP-標識されたタンパク質は、末梢ERおよび原形質膜中のタンパク質レベルの定量化を可能にします。...

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

ショウジョウバエmelanogaster光受容体からの全細胞記録は、様々な条件下での自然発生的な暗いバンプ、量子隆起、光に対する肉眼的応答、および電流 - 電圧関係の測定を可能にする。 D. melanogaster遺伝子操作ツールと組み合わせて、この方法は、遍在するイノシトール - 脂質シグナル伝達経路およびその標的であるTRPチャネルの研究を可能にする。...

全細胞電圧クランプ記録のための電気生理学的方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;感光体

ライブショウジョウバエ卵巣組織の上皮幹細胞系列の細胞内 pH のイメージングのためのプロトコルを提供します。定量的蛍光イメージングを用いたバイオ センサー pH センサー、mCherry::pHluorin、イメージを表現する遺伝子組換えハエを生成し、標準曲線を生成 pH...

ライブショウジョウバエ卵巣組織の卵胞幹細胞系列のイメージング細胞内 pH の方法

このプロトコルでは、食細胞の認識および微生物感染症のクリアランスを定量化する大人のショウジョウバエの体内貪食アッセイについて説明します。...

ミバエショウジョウバエVivo で貪食能アッセイを使用しての細胞性免疫能を評価します。

初期のショウジョウバエの胚では、多くの細胞小器官は運動性である。原則として、それらは特定の蛍光プローブを介して生きたまま画像化することができるが、卵殻は胚への直接適用を妨げる。このプロトコルは、マイクロインジェクションを介してそのようなプローブを導入し、次いで粒子画像速度測定を介してバルクオルガネラ運動を分析する方法を記述している。...

ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

ここでは、eGFP蛍光を用いた ショウジョウバエ...

eGFPタグ付きタンパク質を用いた ショウジョウバエ 光受容体細胞における膜タンパク質トラフィッキングの研究

このプロトコルでは、従来のGFP/mCherryタグアプローチでは検出が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾のライブイメージングを可能にするために、カスタマイズされた抗体ベースの蛍光標識とショウ ジョウバエ...

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

学ぶ 蛍光遺伝子pHインジケーターpHerryを用いたDrosophila melanogasterマルピギー氏管の細胞内pH定量法。上皮細胞の基底側プロトン輸送をリアルタイムで評価し、昆虫腎臓モデルでのイオン輸送機構を解明する。

蛍光遺伝子にコードされた pH インジケーターとキイロショウジョウバエのマルピギー氏管の上皮細胞で光の定量化の細胞内 pH

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