神経毒性試験のための、ヒト誘導多能性幹細胞のニューロンとグリアの混合培養物への分化のためのプロトコール

この手順の全体的な目標は、ヒトが誘導した多能性幹細胞コロニーに由来する神経幹細胞を、ニューロン細胞とグリア細胞の混合培養に分化することです。このモデルは、薬物および化学物質の毒性スクリーニングに適しています。このin vitroモデルは、ニューロンとグリアの分化の過程で活性化されるシグナル伝達経路の化学的誘起摂動の評価に適用できます。

このシステムの主な利点は、人工多能性幹細胞に由来するヒトモデルを使用しており、従来使用されていたがん細胞や動物の初代培養に代わるもので、ニューロン細胞とグリア細胞の混合集団における神経毒性を研究することができることです。この手順は、ポスドクのFrancesca Pistollatoと研究室の大学院生であるCarolina Nunesによってデモンストレーションされます。まず、hiPSCコロニーを通過させることから始めます。

層流キャビネット内の4倍倍率の実体顕微鏡下で作業し、30ゲージの針が付いた1ミリリットルのシリンジを使用します。幹細胞のコロニーを約200ミクロン×200ミクロンの正方形に切断します。コロニーを切り取るには、同じサイズの断片を得るための優れた手作業が必要です。

市販の切削工具の使用が役立ちます。次に、200マイクロリットルのピペットを使用して、下の培地を静かにピペッティングしてピースを持ち上げることにより、コロニーの破片を皿の表面から取り除きます。約100個のコロニー断片を、4ミリリットルの完全hiPSC培地で満たされた適格なマトリックスDMEM F12コーティング60mmディッシュに移します。

次に、新しい皿を摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。毎日全培地交換を行い、位相差顕微鏡を使用して4倍および10倍の倍率でコロニーの形態を検査します。分化手順のゼロ日目に、60ミリメートルのペトリ皿あたり3ミリリットルの培地を追加して、hiPSC培地をリフレッシュします。

次に、前と同じように200ミクロンの断片を切り取ります。切り離した破片と培地を15ミリリットルのチューブにピペットで移します。2ミリリットルの完全hiPSC培地で皿をすすぎ、すべての断片を回収します。

その後、Gの112倍で1分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、フラグメントを 5 ミリリットルの完全 hiPSC EB 培地に穏やかに再懸濁します。60mmの超低付着組織培養皿に全量をプレート

皿を摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。翌日、倒立顕微鏡で細胞を確認します。1日目の胚体は、ここに見られるように、丸みを帯びて互いに区別して見えるはずです。

次に、胚体と培地を皿からピペットで移し、15ミリリットルのチューブに移します。胚様体をGの112倍で1分間遠心分離します。2日目には、事前に調製した60mmディッシュから標準マトリックスコーティング溶液を吸引し、5ミリリットルの完全神経上皮誘導培地(NRI)をディッシュに加えます。

4倍の倍率で実体顕微鏡下で作業し、200マイクロリットルのピペットを使用して、約50個の浮遊胚体を採取し、1つのコーティングされた皿に移します。次に、皿を摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。翌日、分化手順の3日目に、10倍の倍率で顕微鏡下で皿をチェックし、胚様体がすべて付着していることを確認します。

次に、完全なNRI培地を使用して、全培地交換を静かに行います。NRI培地は、ロゼット状の神経上皮凝集体が見える7日目まで、1日おきに交換してください。7日目に、培地で希釈した100マイクロリットルの標準マトリックスを各ウェルにピペッティングして、96ウェルプレートをコーティングします。

8日目に、無菌状態で10倍の倍率で実体顕微鏡下でロゼット様凝集体を断片に切断します。ロゼットは針で触れると皿から簡単に外れる傾向があることに注意してください。この場合、取り外したロゼットを針先で部分的に分解します。

ロゼットが部分的に付着したままになる場合は、200マイクロリットルのピペットを使用して、ロゼットの破片の取り外しを完了します。ロゼットの挿し木は、神経酸化皮の誘導体を切断しないようにするために、優れた手作業のスキルと精度が必要です。次に、ロゼットの破片とその培地を15ミリリットルの円錐管に集めます。

2ミリリットルのNRIメディウムで皿をすすぎ、すべての破片を回収します。次に、ロゼットの破片をGの112倍で1〜2分間スピンダウンします。上清を吸引した後、カルシウムとマグネシウムを含まない予熱した1 X DPBSの1ミリリットルにペレットを穏やかに再懸濁します。

ロゼットの破片をゆっくりと上下にピペットで動かして、部分的に解離させます。次に、4ミリリットルの完全NRI培地を加え、トリパンブルーと自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。次に、96ウェルプレートから標準マトリックスコーティング溶液を吸引し、NRI培地で1平方センチメートルあたり約15,000細胞の密度で細胞をウェルに沈着させます。

プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。10日目に、完全なニューロン分化培地を使用して全培地交換を行います。この代表的な画像は、ネスチンを緑色に、β 3 チューブリンを赤色で染色した in vitro で 12 日後のロゼットを示しています。

ここでは、in vitroで28日間増殖した細胞を、ベータ3チューブリンを赤、NF200を緑で染色しました。この代表的な画像は、in vitroで21日後にNSCから分化した神経細胞をNF200に赤、towを緑で染色したものです。ここでは、同じ培養物からのグリア細胞をGFAP用に赤色で染色します。

このヒストグラムは、IMR90 hiPSC誘導体およびIMR90 hiPSC由来のNSCから分化した細胞におけるネスチン、MAP 2、GFAP、γ-アミノ酪酸、小胞性グルタミン酸トランスポーター1、チロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞の定量を比較したものです。10倍対物レンズを使用して撮影されたこれらの位相コントラスト画像は、ニューロン幹細胞が21日間分化していることを示しています。これらの手順に従うことにより、定量的リアルタイムPCRや多国間再解析などの他の読み取りを行い、神経細胞やグリア細胞の生理機能や表現型を評価し、化学物質の影響を評価することができます。

化合物の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。そのため、特に化学処理を行うときは、常にゴーグル、手袋、またはフローフードの下のマスクを使用して、関連する予防措置を講じる必要があります。このビデオを見た後、神経毒性試験の開発に適したモデルであるin vitroモデルであるヒト人工多能性幹細胞から始まるニューロンとグリア細胞の混合分化集団を取得する方法をよく理解できるはずです。