Name: 神経毒性試験のための、ヒト誘導多能性幹細胞のニューロンとグリアの混合培養物への分化のためのプロトコール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学ぶ、ヒトiPS細胞からニューロンとグリアの混合培養物を作製する神経毒性評価プロトコール。免疫染色と顕微鏡観察により細胞分化を定量化し、薬物安全性試験に応用可能なin vitroモデルを構築する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、IMR90-hiPSCを提供してくれたMarc Peschanski博士（I-Stem、フランス、エヴリー）に感謝したい。 Giovanna Lazzari博士とSilvia Colleoni博士（Avantea srl、Cremona、Italy）; Dr. Simone Haupt（ボン大学、ドイツ）; Tiziana Santini博士（イタリア工科大学ローマ）は、免疫蛍光染色の評価に関するアドバイスを提供してくれました。 RPPA分析と抗体の検証に貢献したBenedetta Accordi博士、Elena Rampazzo博士、Luca Persano博士（パドヴァ大学、イタリア）資金調達：このプロジェクトは、EUが資金を提供するプロジェクト「SCR＆To​​x」（無償資金協力協定第266753号）によって支援されました。

<ol><li>NRC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxicity+Testing+in+the+21st+Century%3A+A+Vision+and+a+Strategy%22">Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy</a>. , National Academy Press. Washington, DC. (2007).</li>
<li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J Mol Med (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li>
<li>Ho, P. J., Yen, M. L., Yet, S. F., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+applications+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+possibilities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges.</a> Cell Transplant. 21 (5), 801-814 (2012).</li>
<li>Krueger, W. H., Swanson, L. C., Tanasijevic, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+artificial+routes+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural and artificial routes to pluripotency.</a> Int J Dev Biol. 54 (11-12), 1545-1564 (2010).</li>
<li>Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+pluripotent+stem+cell+cultures+for+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).</li>
<li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pluripotent+stem+cell+derived+neuronal+model+to+identify+chemically+induced+pathway+perturbations+in+relation+to+neurotoxicity%3A+effects+of+CREB+pathway+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a pluripotent stem cell derived neuronal model to identify chemically induced pathway perturbations in relation to neurotoxicity: effects of CREB pathway inhibition.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 280 (2), 378-388 (2014).</li>
<li>Zagoura, D., Canovas-Jorda, D., Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Bal-Price, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+rotenone-induced+activation+of+the+Nrf2+pathway+in+a+neuronal+model+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the rotenone-induced activation of the Nrf2 pathway in a neuronal model derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Neurochem Int. , (2016).</li>
<li>Standard operating procedure for differentiation of human induced pluripotent stem cells into post-mitotic neurons and glial cells. EURL ECVAM. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570</a> (2016).</li>
<li>Standard operating procedure for expansion of rosette-derived neural stem cells. EURL ECVAM. , Available from:
	 <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571</a> (2016).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Brien, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concordance+of+drug-induced+human+hepatotoxicity+with+in+vitro+cytotoxicity+measured+in+a+novel+cell-based+model+using+high+content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening.</a> Arch Toxicol. 80 (9), 580-604 (2006).</li>
<li>Accordi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+protein+network+activation+mapping+reveals+new+potential+molecular+drug+targets+for+poor+prognosis+pediatric+BCP-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional protein network activation mapping reveals new potential molecular drug targets for poor prognosis pediatric BCP-ALL.</a> PLoS One. 5 (10), e13552(2010).</li>
<li>Vassallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-laboratory+evaluation+of+microelectrode+array-based+measurements+of+neural+network+activity+for+acute+neurotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">A multi-laboratory evaluation of microelectrode array-based measurements of neural network activity for acute neurotoxicity testing.</a> Neurotoxicology. , (2016).</li>
<li>Shamblott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+germ+cell+derivatives+express+a+broad+range+of+developmentally+distinct+markers+and+proliferate+extensively+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (1), 113-118 (2001).</li>
<li>Bryan, H. K., Olayanju, A., Goldring, C. E., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrf2+cell+defence+pathway%3A+Keap1-dependent+and+-independent+mechanisms+of+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The Nrf2 cell defence pathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation.</a> Biochem Pharmacol. 85 (6), 705-717 (2013).</li>
<li>Tufekci, K. U., Civi Bayin, E., Genc, S., Genc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrf2%2FARE+Pathway%3A+A+Promising+Target+to+Counteract+Mitochondrial+Dysfunction+in+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">The Nrf2/ARE Pathway: A Promising Target to Counteract Mitochondrial Dysfunction in Parkinson's Disease.</a> Parkinsons Dis. , 314082(2011).</li>
<li>Kovac, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+regulates+ROS+production+by+mitochondria+and+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (4), 794-801 (2015).</li>
<li>Lee, J. M., Shih, A. Y., Murphy, T. H., Johnson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-E2-related+factor-2+mediates+neuroprotection+against+mitochondrial+complex+I+inhibitors+and+increased+concentrations+of+intracellular+calcium+in+primary+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons.</a> J Biol Chem. 278 (39), 37948-37956 (2003).</li>
<li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Nrf2%2Fsmall+Maf+heterodimer+mediates+the+induction+of+phase+II+detoxifying+enzyme+genes+through+antioxidant+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements.</a> Biochem Biophys Res Commun. 236 (2), 313-322 (1997).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2%2FARE+pathway+activation%2C+HO-1+and+NQO1+induction+by+polychlorinated+biphenyl+quinone+is+associated+with+reactive+oxygen+species+and+PI3K%2FAKT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Nrf2/ARE pathway activation, HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling.</a> Chem Biol Interact. , 56-67 (2014).</li>
<li>Cannon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+reproducible+rotenone+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 34 (2), 279-290 (2009).</li>
<li>Sherer, T. B., Kim, J. H., Betarbet, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+rotenone+exposure+causes+highly+selective+dopaminergic+degeneration+and+alpha-synuclein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation.</a> Exp Neurol. 179 (1), 9-16 (2003).</li>
<li>Testa, C. M., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotenone+induces+oxidative+stress+and+dopaminergic+neuron+damage+in+organotypic+substantia+nigra+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures.</a> Brain Res Mol Brain Res. 134 (1), 109-118 (2005).</li>
<li>Tukey and Dunnett methods. GraphPad. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.graphpad.com/guides/prism/7/statistics/index.htm?stat_the_methods_of_tukey_and_dunne.htm">http://www.graphpad.com/guides/prism/7/statistics/index.htm?stat_the_methods_of_tukey_and_dunne.htm</a> (2017).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+induction+of+neural+conversion+in+human+ESCs+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+a+single+chemical+inhibitor+of+transforming+growth+factor+beta+superfamily+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors.</a> Stem Cells. 28 (10), 1741-1750 (2010).</li>
<li>Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Generating+and+Using+hiPSC+Derived+NPCs+for+the+Study+of+Neurological+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases.</a> J Vis Exp. (96), e52495(2015).</li>
<li>Jiang, Y., Zhang, M. J., Hu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+functional+neurons+and+glia+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Specification of functional neurons and glia from human pluripotent stem cells.</a> Protein Cell. 3 (11), 818-825 (2012).</li>
<li>Parsons, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+human+neuronal+progenitors+and+neurons+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells+with+small+molecule+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction.</a> J Vis Exp. (56), e3273(2011).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li>
<li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5 (7), e11853(2010).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+human+dopaminergic+neurons+derived+from+embryonic+stem+cells%3A+MPP%2B+toxicity+and+GDNF+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2708-2715 (2006).</li>
<li>Paşca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Almeida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+key+pathological+features+of+frontotemporal+dementia+with+C9ORF72+repeat+expansion+in+iPSC-derived+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons.</a> Acta Neuropathol. 126 (3), 385-399 (2013).</li>
<li>Urbán, N., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+embryonic+and+adult+brain%3A+same+regulators%2C+different+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles.</a> Front Cell Neurosci. 8, 396(2014).</li>
<li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (6), 528-534 (2011).</li>
<li>Krencik, R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li>
<li>Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrf2-antioxidant+response+element+signaling+pathway+and+its+activation+by+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress.</a> J Biol Chem. 284 (20), 13291-13295 (2009).</li>
<li>Bal-Price, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+adverse+outcome+pathways+relevant+to+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity.</a> Crit Rev Toxicol. 45 (1), 83-91 (2015).</li>
<li>Cabezas, R., El-Bacha, R. S., Gonzalez, J., Barreto, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functions+in+astrocytes%3A+neuroprotective+implications+from+oxidative+damage+by+rotenone%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functions in astrocytes: neuroprotective implications from oxidative damage by rotenone.</a> Neurosci Res. 74 (2), 80-90 (2012).</li>
<li>Swarnkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+activation%3A+a+key+step+in+rotenone+induced+cytotoxicity+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Astrocyte activation: a key step in rotenone induced cytotoxicity and DNA damage.</a> Neurochem Res. 37 (10), 2178-2189 (2012).</li>
<li>Canovas-Jorda, D., Louisse, J., Pistollato, F., Zagoura, D., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+toxicology%3A+the+role+of+stem+cells+in+the+development+of+chronic+toxicities%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Regenerative toxicology: the role of stem cells in the development of chronic toxicities.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (1), 39-55 (2014).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

この研究は、IMR90-hiPSCを分裂後ニューロンおよびグリア細胞に分化させるための、堅牢で比較的迅速なプロトコールを記載する。以前に公開されたhESCおよびhiPSCに基づくニューロン分化プロトコールは、通常、高い割合の神経前駆体25,26およびかなりの数の神経標的細胞27,28,29,30,31,32,33を産生する。同様に、本明細書に記載の分化プロトコルは、グリアおよび恒常的な割合のネスチン+細胞と共に、GABA作動性、グルタミン酸作動性およびドーパミン作動性ニューロン細胞の異種培養物を作製するのに適している。グルタミン酸作動性（〜35-42％）およびGABA作動性（〜15-20％）神経細胞の存在は、この培養は前脳、皮質様の特徴を有し、ドーパミン作動性ニューロン（〜13〜20％）の不連続数の存在も中脳特異性を示し得る。さらに、ネスチン+細胞の適度な割合の永続性は、神経新生の研究、および主として前脳34の海馬および脳室下領域（SVZ）の両方に限定されるNSCに対する化学物質の考えられる効果に適していると考えられる。さらなる免疫細胞化学および遺伝子発現分析は、分化した細胞誘導体の領域特異性をより明確にするのに役立つであろう。 この文書に記載されている分化プロトコルの2つの最も重要なステップは、（i）均質な断片へのhiPSCコロニーの切断（均質な大きさのEBの生成に重要である）、および（ii）神経外胚葉構造）、NSC分化のためにはかなりの手作業スキルが必要分化時に得られるニューロンおよびグリア細胞の割合を減少させる可能性のある中胚葉および内胚葉細胞の収集を避けるために、 増殖中（未分化コロニーまたはNSCとして）およびすべての分化段階中に細胞の表現型を特徴付けることは重要である。特に、ニューロン/グリア細胞誘導体の遺伝子およびタンパク質発現プロファイルは、ニューロン関連シグナル伝達経路のアップレギュレーションおよび活性化を示すが、多能性マーカーの発現は減少しなければならない。 EBおよび神経外胚葉誘導体（ロゼット）の生成は、手作業で挑戦的であり、変動する傾向があり得る。この理由から、我々は、ロゼット由来NSCの拡大およびニューロン/グリア細胞へのそれらのさらなる分化のためのプロトコールを開発した。 この分化プロトコルの可能な限界は、主に（i）d（ii）成熟したニューロンネットワーク機能の欠如（バーストの欠如によって示されるように）のいずれかである。さらに、星状細胞の特定の亜集団は、初代前駆細胞またはNSCとして機能し得る35 。この分化した細胞培養物においてネスチン/ GFAP二重陽性細胞は観察されなかったが（データ示さず）、これらの混合培養物中のGFAP +細胞は星状細胞前駆体および星状細胞であると仮定される。分化の時間を伸ばすことによって、星群の数は増加し、その形態は、Zhangのグループ36,37の以前の研究によってすでに示されているように、より成熟する可能性がある。 新しい毒性試験のパラダイムでは、生物学的経路の化学誘起摂動に関する知識は、化学的逆行を評価する際に最も重要である。したがって、 インビトロ試験システムは、有害な結果経路（AOP）の概念に従って、シグナル伝達経路の障害に悪影響を関連付ける。概念の証明として、ロテノンは、酸化ストレスまたは求電子ストレスに対する細胞防御に関与するNrf2経路の活性化を評価するために使用することができ、酸化ストレスは、関連する様々なAOPにおける重要かつ共通の主要事象である発生および成人神経毒性39 。 ロテノンは、Nrf2タンパク質の核移行およびNQO1およびSRXN1を含むNrf2標的酵素の発現の増加によって示され得るNrf2経路の活性化を誘発すべきである。ロテノンは、星状細胞の活性化を示すGFAPタンパク質レベルの用量依存的増加を誘導することが見出されている（ 40,41） 。ロテノンはまた、ドーパミン作動性（TH + ）細胞の数を減少させ、これは、previこのタイプのニューロンは酸化ストレスに特に敏感であるため、ロテノン依存性ドーパミン作動性細胞死を示すインビトロおよびインビボ研究21,22,23 。 結論として、このhiPSC由来のニューロンおよびグリア細胞培養モデルは、Nrf2経路活性化をもたらす酸化ストレスを誘発する化学物質の神経毒性効果を評価するための貴重なツールである。この分化プロトコルは、神経細胞（GABA作動性、ドーパミン作動性およびグルタミン酸作動性ニューロン）および星状細胞の混合培養物の生成を可能にするので、神経変性疾患などの生理学的および病理学的状態におけるニューロンとグリアとの間のクロストークを研究するのに適している例えば、パーキンソン病）。さらに、有意な割合のNSCの存在は、神経前駆体に対する化学物質の考えられる影響を評価するのに役立つかもしれない化学的に誘発された突然変異またはウィルス感染の主な標的であることが知られている42 。

米国国立研究評議会の報告書1は、ヒトでの細胞を用いた機構的インビトロアッセイに焦点を当てたアプローチに、動物で観察された表現型変化に基づくアプローチから規制毒性試験に移行する新しい毒性試験のパラダイムを構想しました 。取得された細胞がヒト組織の生理学的条件にさらに近似し、化学的に誘発された有害作用を研究するためのより適切なツールを提供し得るため、多能性幹細胞（PSC）誘導体は、癌細胞モデルの代替物を表し得る。毒性試験の最も有望なPSC培養物の2つの主要なタイプは、現在、基礎研究および再生医療の分野で広く使用されているヒト胚性幹細胞（hESC）およびヒト誘導性多能性幹細胞（hiPSC）である2,3 。この専門知識は、新しいクラスのtoxicoloの開発のために利用できるようになりましたin vivoでの悪影響の発症に関与する摂動した生理学的経路を同定することを目的とした生体外試験である。しかし、hESCに基づく規制安全評価の試験方法は、倫理的懸念や胚由来細胞の使用を規制する様々な国内法制のために、EU加盟国および世界各国で受け入れられる可能性は低い。 hiPSCは、hESC4,5と同様の特徴を有し、治療標的の同定および安全性評価の両方のためのインビトロ方法の大きな可能性を保持する。さらに、hiPSC技術は、限られたドナープールの制約および胚由来細胞に関連する倫理的懸念を緩和する。 hiPSCsの主な課題は、これらの細胞が、毒性学的に関連する細胞誘導体の有意な範囲を再現可能に生成することができ、人間の組織に典型的な特徴および応答を有する。選択されたマーカーの所定のレベルは、一般に、分化プロセス後の細胞集団を特徴づけるため、および分化プロセスの安定性に関する洞察を提供するために使用される。 以前の研究では、ニューロンおよびグリア細胞の混合培養物を生成し、ミトコンドリア呼吸複合体Iの阻害剤であるロテノンの抗酸化物質防御機構の重要な制御因子であるNrf2経路の活性化に対するhiPSCの適合性を評価した多くの細胞型6,7 。 この研究は、ニューロン/グリア分化の際に活性化されるシグナル伝達経路（遺伝子およびタンパク質レベル）に関する詳細を提供する、混合ニューロンおよびグリア培養へのhiPSCの分化に使用されるプロトコールを記載する。さらに、この作品は代表的な結果を示しています。hiPSC由来のニューロンおよびグリア細胞モデルを使用して、ロテノンによる急性（24時間）処置によって誘導されるNrf2シグナル伝達活性化を評価し、酸化ストレス誘導の評価を可能にする。 IMR90線維芽細胞をpMIGベクターを用いて2つの転写因子（Oct4およびSox2）のウイルス形質導入によりI-Stem（フランス）でhiPSCに再プログラムした6 。類似のhiPSCモデルも適用することができる。以下に記載するプロトコールは、hiPSCの神経幹細胞（NSC）への分化のすべての段階、さらに分裂後ニューロンおよびグリア細胞の混合培養物へのまとめである（ステップ1および2、詳細については、EURL ECVAM DBALMウェブサイトも参照のこと）。プロトコル） 8 。 混合ニューロンおよびグリア細胞へのNSCの単離、拡大、凍結保存、およびさらなる分化のためのさらなるプロトコルは、ステップ3および4で詳述される（EURL ECVAM DBALMこのプロトコルの詳細な説明については、bsiteを参照してください）。ステップ5は、コミットメントおよび分化のいくつかの段階の間に細胞の表現型の同一性を評価するために行うことができる分析を記載する。

神経毒性試験のための、ヒト誘導多能性幹細胞のニューロンとグリアの混合培養物への分化のためのプロトコール

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

ヒト多能性幹細胞は、ヒトベースのインビトロ毒性アッセイに適用することができる様々な細胞型に分化することができる。 1つの大きな利点は、体細胞がヒト誘導性多能性幹細胞（hiPSC）を産生するように再プログラムすることにより、ヒト胚性幹細胞（hESC）の使用に関する倫理的および立法上の問題が回避されることである。 HiPSCは、毒性試験のための試験システムとして、特に神経毒性に関与する異なる経路の評価のために役立ち、異なるタイプのニューロンおよびグリア細胞に拡大し、効率的に分化させることができる。この研究は、ニューロンおよびグリア細胞の混合培養物へのhiPSCの分化のためのプロトコールを記載する。ニューロン分化によって調節および/または活性化されるシグナル伝達経路が規定される。この情報は、新しい毒性試験のパラダイムへの細胞モデルの適用に重要であり、化学物質はその能力に基づいて評価されるrturb生物学的経路。概念の証明として、ミトコンドリア呼吸複合体Iの阻害剤であるロテノンを、酸化ストレスに対する抗酸化応答要素（ARE）駆動の細胞防御機構の重要な制御因子であるNrf2シグナル伝達経路の活性化を評価するために使用した。

ヒトが誘導する多能性幹細胞（hiPSC）は、薬物および化学物質のスクリーニングならびに神経毒性を含む毒性試験のための新しいインビトロモデルの開発のための強力なツールと考えられている。ここでは、hiPSCをニューロンおよびグリアに分化させるための詳細なプロトコールが記載されている。

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

本手順の全体的な目的は、ヒト人工多能性幹細胞コロニー由来の神経幹細胞を、ニューロンおよびグリア細胞の混合培養へと分化させることです。このモデルは、薬剤および化学物質の毒性スクリーニングに適しています。また、このin vitroモデルは、ニューロンおよびグリア細胞への分化過程で活性化されるシグナル伝達経路に対し、化学物質によって誘導される摂動を評価するために適用可能です。本システムの主な利点は、従来使用されてきたがん細胞や動物の初代培養に代わる、ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）由来のヒトモデルを使用することで、神経細胞とグリア細胞の混在集団における神経毒性を研究できる点にあります。本手順は、当研究室のポストドクターであるFrancesca Pistollatoと、大学院生のCarolina Nunesによって実演されます。まず、hiPSCコロニーの継代から開始します。ラミナーフローキャビネット内で、実体顕微鏡を用い4倍の倍率で、30ゲージの針を装着した1 mLシリンジを使用して作業を行います。幹細胞コロニーを約200 µm × 200 µmの正方形に切り出します。均等なサイズの断片を得るために、コロニーの切り出しには優れた手技が求められます。市販のカッティングツールを使用すると効率的です。次に、200 µLピペットを用い、コロニー断片の下の培地を穏やかにピペッティングして断片を浮かせ、ディッシュ表面から回収します。約100個のコロニー断片を、4 mLの完全hiPSC培地を満たした、マトリックスDMEM F12でコーティング済みの60 mmディッシュに移します。次に、新しいディッシュを37°C、5% CO₂条件下でインキュベートします。毎日全量培地交換を行い、位相差顕微鏡の4倍および10倍の倍率でコロニーの形態を観察します。分化誘導プロトコルの0日目に、60 mmペトリディッシュあたり3 mLの培地を加えてhiPSC培地を更新します。その後、前と同様に200 micronの断片を切り離します。切り離した断片と培地を15 milliliterチューブにピペッティングで移します。ディッシュを2 millilitersの完全hiPSC培地で洗浄し、すべての断片を回収します。次に、112 ×gで1分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、断片を5 mLの完全hiPSC EB培地で緩やかに再懸濁します。全量を60 mmの超低接着組織培養ディッシュに播種します。ディッシュを37°C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートします。翌日、倒立顕微鏡で細胞を確認します。1日目の胚様体は、ここで示されているように、互いに独立した球状に見えるはずです。次に、ディッシュから胚様体と培地をピペットで吸い取り、15 milliliterチューブに移します。胚様体を112 times Gで1分間遠心分離します。2日目に、あらかじめ準備しておいた60 millimeterディッシュから標準マトリックスコーティング溶液を吸引し、5 milliliterの完全神経上皮誘導培地（NRI）をディッシュに加えます。実体顕微鏡を用い、4倍の倍率で観察しながら、200 µL ピペットを使用して約50個の浮遊胚様体を回収し、コーティング済みのディッシュ1枚に移します。その後、ディッシュを37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。翌日、分化誘導プロセスの3日目に、10倍の倍率で顕微鏡下でディッシュを確認し、すべての胚様体が接着していることを確かめます。その後、完全NRI培地を用いて、慎重に培地全量交換を行います。NRI培地を1日おきに交換し、ロゼット状の神経上皮凝集塊が観察される7日目まで維持します。7日目に、各ウェルに培養液で希釈した標準マトリックスを100 microlitersずつピペッティングし、96ウェルプレートをコートします。8日目に、滅菌条件下で、ステレオ顕微鏡を用いて10倍の倍率で、ロゼット状の凝集体を断片化します。ロゼットは針で触れるとディッシュから剥がれやすいことに注意してください。その場合は、針の先端を用いて、剥がれたロゼットを部分的に解離させます。ロゼットが部分的に付着したままである場合は、200 µLピペットを用いてロゼット断片を完全に切り離してください。ロゼットの切断には、神経外胚葉由来の組織を誤って切断しないよう、優れた手技と精度が必要です。次に、ロゼット断片とその培地を15 mLコニカルチューブに回収します。すべての断片を回収するため、ディッシュを2 mLのNRI培地で洗浄します。次に、ロゼット断片を112 ×gで1〜2分間遠心分離します。上清を吸引した後、カルシウムおよびマグネシウムを含まない、あらかじめ温めておいた1 X DPBS 1 mLでペレットを穏やかに再懸濁します。ロゼット断片をピペッティングして緩やかに部分的に解離させます。次に、完全NRI培地を4 mL加え、トリパンブルーと自動細胞カウンターを用いて細胞数をカウントします。続いて、96ウェルプレートから標準マトリックスコーティング溶液を吸引し、NRI培地を用いて、細胞密度が約15,000 cells/cm²になるように各ウェルに細胞を播種します。プレートを37°C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートします。10日目に、完全神経分化培地を用いて全培地交換を行います。この代表的な画像は、in vitroで12日間培養し、nestinを緑色、beta three tubulinを赤色に染色したロゼットを示しています。ここでは、in vitroで28日間培養した細胞を、β3-tubulinを赤色、NF200を緑色で染色しています。この代表的な画像は、in vitroで21日後にNSCsから分化した神経細胞を、NF200を赤色、Tauを緑色で染色したものです。ここでは、同一培養物由来のグリア細胞をGFAPで赤色に染色しています。このヒストグラムは、IMR90 hiPSC誘導体およびIMR90 hiPSC由来NSCから分化した細胞における、nestin、MAP two、GFAP、γ-アミノ酪酸、小胞性グルタミン酸トランスポーター1、およびチロシン水酸化酵素陽性細胞の定量比較を示しています。10倍の対物レンズを用いて撮影されたこれらの位相差顕微鏡像は、21日間分化させた神経幹細胞を示しています。これらの手順に従うことで、定量リアルタイムPCRや多角的再解析などの他のリードアウトを実施し、神経細胞およびグリア細胞の生理学的特性や表現型を評価し、化学物質の影響を検討することが可能です。化学化合物の取り扱いは非常に危険であることに留意してください。そのため、特に化学処理を行う際は、常にフローフード内でゴーグル、手袋、マスクなどの適切な予防措置を講じる必要があります。このビデオを視聴することで、神経毒性試験に適したin vitroモデルである、ヒト人工多能性幹細胞から神経細胞とグリア細胞の混合分化集団を得る方法について十分に理解できるはずです。

protocol-for-differentiation-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、マイクロ流体デバイス内でグルタミン酸作動性ニューロンと小児高悪性度神経膠腫(pHGG)細胞を共培養する技術を紹介しています。ヒト人工多能性幹細胞をマイクロ流体系に導入し、インキュベートして成熟した皮質グルタミン酸作動性ニューロンへの分化を促進します。その後、pHGG細胞を成熟ニューロンに導入し、共培養を確立し、ニューロンとpHGG細胞との相互作用を可能にします。...

グルタミン酸作動性ニューロンと小児高悪性度神経膠腫細胞の共培養

このビデオは、非トランスジェニックおよびトランスジェニックヒト多能性幹細胞(hPSC)から神経前駆細胞を生成する方法を示しています。hPSCは、ニューロン分化培地を使用して神経前駆細胞に分化されます。非トランスジェニック細胞では低分子を用いて分化が誘導されますが、トランスジェニックhPSCは、ニューロン分化特異的な転写因子のプロモーターを誘導する抗生物質を添加することで分化します。...

非トランスジェニックおよびトランスジェニックヒト多能性幹細胞の神経前駆細胞への分化

このビデオは、胚様体(EB)を神経上皮凝集体に分化させ、その後のニューロン細胞とグリア細胞への分裂のプロセスを示しています。この方法により、in...

ヒト人工多能性幹細胞由来胚様体からのニューロンおよびグリア細胞の生成

プロトコルは、ヒト胚性幹細胞およびトランスクリプトーム研究に基づいて、2つのin vitro発生毒性試験システム（UKKとUKN1）を記述します。試験系は、ヒトの発生毒性の危険性を予測し、動物実験、コストおよび化学安全性試験のために必要な時間を短縮するために寄与することができます。...

化学物質安全性のスクリーニングおよびシステム生物学データの生成のために発生毒性アッセイベースのヒト多能性幹細胞

マウスES細胞を、機能的なシナプスと創発的なネットワーク挙動を示す高純度ニューロンの集団に分化するためのカスタムプロトコルが記述されています。電気生理学的分析は、ボツリヌス神経毒血清型/ A-/...

幹細胞由来の中枢神経系ニューロンのネットワーク化培養における生物学的神経毒の機能評価

錐体ニューロンの樹状突起棘は、哺乳類の脳皮質の中で最も興奮性シナプスのサイトです。この方法は、人工多能性幹細胞由来のヒト皮質錐体グルタミン酸作動性ニューロンにおける脊椎形態の3次元定量分析を記載します。...

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

このプロトコルは、以前にインビトロで神経前駆体から数週間分化していたヒト幹細胞由来ニューロンを再中断および培養するための詳細な手順を説明する。この手順は、光顕微鏡検査および高含有量スクリーニングと互換性のある形式で、神経伝達物、シナプス、および後期発現ニューロンマーカーのイメージングベースのアッセイを容易にします。...

ニューウトジェネシスとシナプス成熟の高含有量スクリーニングに対するヒト多能性幹細胞由来ニューロンの分化後再形成

ミトコンドリアの輸送および形態の障害は、様々な神経変性疾患に関与している。提示されたプロトコルは、遺伝性痙攣対麻痺におけるミトコンドリア輸送および形態を評価するために、誘導多能性幹細胞由来前脳ニューロンを使用する。このプロトコルは、軸索に沿ったミトコンドリア人身売買の特徴付けとその形態の分析を可能にし、神経変性疾患の研究を容易にする。...

遺伝性痙性対麻痺におけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおけるミトコンドリア輸送と形態学の解析

ヒト誘導多能性由来のアストロサイトとニューロンおよびそれらの共培養を電気生理学的記録のために脊髄に分化させる方法を記載する。...

領域特異的ヒト多能性幹細胞由来アストロサイトおよびニューロンを用いたALSモデリングのための電気生理学的基盤の確立

この研究では、フローサイトメトリーと2つの蛍光レポーターまたは抗体による二重染色に基づいて複数のミトコンドリア機能パラメーターを測定し、ミトコンドリア体積、ミトコンドリア膜電位、活性酸素種レベル、ミトコンドリア呼吸鎖組成、およびミトコンドリアDNAの変化を検出する新しいアプローチを報告しています。...

ヒト人工多能性幹細胞における複数のミトコンドリアパラメータとその神経およびグリア誘導体のフローサイトメトリー解析

学ぶ、ヒトiPS細胞からニューロンとグリアの混合培養物を作製する神経毒性評価プロトコール。免疫染色と顕微鏡観察により細胞分化を定量化し、薬物安全性試験に応用可能なin vitroモデルを構築する方法です。

神経毒性試験のための、ヒト誘導多能性幹細胞のニューロンとグリアの混合培養物への分化のためのプロトコール

さらに動画を探す