ヒト人工多能性幹細胞における複数のミトコンドリアパラメータとその神経およびグリア誘導体のフローサイトメトリー解析
2021年11月8日
この研究では、フローサイトメトリーと2つの蛍光レポーターまたは抗体による二重染色に基づいて複数のミトコンドリア機能パラメーターを測定し、ミトコンドリア体積、ミトコンドリア膜電位、活性酸素種レベル、ミトコンドリア呼吸鎖組成、およびミトコンドリアDNAの変化を検出する新しいアプローチを報告しています。
私たちのプロトコルは、ヒトIPSとその神経および明確な誘導体からの単一細胞レベルで複数のマイクロパラメータを結合するための強力なツールを科学者に提供します。このプロトコルは、フローサイトメトリーを使用して、ミトコンドリア体積あたりの総レベルと特定のレベルの両方でミトコンドリアパラメータの喜びを可能にします。この技術は、他の神経変性疾患からのものを含むいくつかの細胞型に適用することができる。
したがって、それによって、これらの疾患タイプの背後にあるメカニズムへの洞察を提供するのに役立ち、治療スクリーニングにも役立つ可能性があります。まず、細胞を6ウェルプレートの4つのウェルに別々に播種し、50〜60%のコンフルエンシーが達成されるまで細胞をインキュベートします。培養期間の最後に、培地、FCCP、TMRE、MTG、および水戸ソックススプレッドの異なる組み合わせを含む5つの個別の染色液を調製します。
それらをそれぞれのウェルに加え、原稿に記載されているように細胞をインキュベートします。次に、すべてのウェルから培地を吸引し、PBSで洗浄します。細胞剥離のために、1ミリリットルの細胞解離試薬と37°Cで5分間細胞をインキュベートします。
細胞解離試薬を10%FBSを添加した1ミリリットルのDMEMで中和します。それから15ミリリットルのクロニクルチューブに井戸の内容物を集めます。遠心分離によって細胞をペレット化し、細胞ペレットをPBSで1〜2回洗浄します。
すべての上清を吸引し、チューブ内に約100マイクロリットルを残します。細胞ペレットを300マイクロリットルのPBSに再懸濁します。細胞懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移した後、チューブを室温で暗所に保ちます。
テキスト原稿に記載されているバンドパスフィルター設定のフローサイトメーターを使用して細胞を分析します。細胞解離試薬を使用して約100万個の細胞を分離し、前述のように細胞をペレットダウンします。細胞懸濁液をDMEMと10%FBSで中和し、懸濁液を15ミリリットルのチューブに集めます。
細胞を1ミリリットルの1.6%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定します。1ミリリットルの氷冷90%メタノールをマイナス20°Cで20分間透過処理します。次に、1ミリリットルのブロッキングバッファーでサンプルをブロックし、実証されているようにPBSで遠心分離して細胞を洗浄します。
異なるミトコンドリア複合体およびサブユニットを検出するには、テキスト原稿に記載されているそれぞれの一次抗体で細胞を30分間インキュベートします。細胞をPBSで一度洗浄した後、細胞を二次抗体で30分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、実証されたように細胞およびPBSを洗浄し、再懸濁する。
細胞懸濁液を氷上で暗所に保たれた1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移す。次に、フローサイトメーターで細胞を分析し、シグナルを検出し、5 30/30バンドパスフィルターを使用して1つをフィルタリングします。各細胞亜集団について、ヒストグラムプロットを選択し、異なるフィルターチャンネルの蛍光強度またはMFIの中央値を解析します。
TMREレベル、MMP ROS複合体サブユニットおよびTFAMの特定の値を、テキスト原稿に記載されているように計算します。フローサイトメトリーおよび生細胞を用いて、MMPミトコンドリア容積およびROSレベルを調査した。POLG DAニューロンでは、より低い特異的MMPおよびより高い特異的ROSが観察されたが、ミトコンドリア容積、総MMPおよびROSに変化は見られなかった。
POLG星状細胞はMMPを減少させたが、ミトコンドリア容積およびROSに変化はなかった。フローサイトメトリーおよび固定細胞を用いて、MRC複合体サブユニットおよびTFAMのレベルを調べた。DAニューロンは、対照と比較して複合体1およびTFAMの増加を示したが、複合体2レベルに変化はなかった。
POLG星状細胞は、複合体一4および特異的TFAMの減少を示した。細胞密度はMMPおよびMTGとMMP蛍光の関係にも影響を与える可能性があるため、これは細胞特異的です。このプロトコルを他の細胞型に適応させるには、おそらく最適化が必要になるでしょう この手順に続いて、顕微鏡ベースのアシス、例えば共焦点マイクロコピーを実行することができ、ミトコンドリア構造の追加の詳細を提供します。
したがって、この戦略は、既知のミトコンドリア疾患からDAニューロンおよび星状細胞のミトコンドリア機能障害を検出する一方で、これらの技術は、あらゆるタイプの細胞および疾患におけるミトコンドリア機能の探索にも適用できます。
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概要
この研究は、ヒトの誘導多能性幹細胞（iPS）とその神経細胞誘導体におけるミトコンドリア機能パラメータを評価するための新しいフローサイトメトリーベースの方法を提示します。ミトコンドリア膜電位、活性酸素種レベル、およびミトコンドリア呼吸鎖組成の変化を検出でき、神経変性疾患におけるミトコンドリア機能障害の理解に寄与します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- ミトコンドリア機能
背景
- ミトコンドリア機能障害は神経変性疾患と関連しています。
- この研究は単一細胞レベルでのミトコンドリアパラメータを調査します。
- この方法論は疾患メカニズムへの洞察を提供することを目的としています。
- ミトコンドリアの健康状態の評価は治療スクリーニングに役立ちます。
研究目的
- 単一細胞でのミトコンドリアパラメータ測定方法を開発すること。
- 神経変性と潜在的な治療におけるミトコンドリアの役割を理解すること。
- 多様な細胞タイプでのミトコンドリア機能障害の検出を改善すること。
使用された方法
- 使用されたプラットフォームはフローサイトメトリーです。
- ヒトiPS細胞とその神経細胞誘導体が分析されました。
- 主要な手順には細胞培養、特定の蛍光レポーターによる二重染色、ミトコンドリア分析のための抗体ラベリングが含まれました。
- 細胞処理には解離、固定、通過性化、その後の蛍光測定が含まれました。
- プロトコルの細胞タイプ特有の適応が言及されました。
主要な結果
- POLGニューロンとアストロサイトにおいてミトコンドリア膜電位（MMP）と活性酸素種（ROS）レベルに有意な違いが観察されました。
- DAニューロンにおいてミトコンドリア複合体とTFAMレベルの増加が認められ、独特なミトコンドリア適応を強調しました。
- 結果は特定の細胞特性がミトコンドリア機能測定に影響を与えることを示しています。
- ミトコンドリア機能と関連疾患の探索において様々な細胞タイプへの適応の可能性が示唆されました。
結論
- この研究は神経変性疾患モデルにおけるミトコンドリア機能評価のための堅固なアプローチを示しています。
- この発見は細胞の健康と疾患におけるミトコンドリアの役割のさらなる探索を可能にします。
- この方法論はミトコンドリア機能障害関連の病理のより良い理解と治療戦略につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This flow cytometry method enables multiparametric mitochondrial profiling in human iPSC-derived neural and glial cells, supporting target validation in neurodegenerative disease models. By quantifying mitochondrial volume, membrane potential, ROS, and respiratory chain components at single-cell resolution, it provides mechanistic de-risking for therapeutic screening. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking mitochondrial phenotypes to disease-relevant cellular states.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring mitochondrial dysfunction in iPSC-derived neurons and astrocytes.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiparametric readouts of mitochondrial health.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that normalize mitochondrial parameters in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated iPSC-derived neural and glial systems for compound screening with mitochondrial endpoints.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs for mitochondrial volume, MMP, and ROS.
- Scalability: Supports high-content flow cytometry screening across multiple cell lines and treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling mitochondrial defects in POLG-associated neurons and astrocytes.
- Operational Value: Enables translational biomarker assessment via TFAM/TOMM20 ratios reflecting mtDNA copy number per mitochondrial volume.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by detecting mitochondrial complex subunit alterations linked to pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for neurodegenerative indications involving mitochondrial dysfunction.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking mitochondrial volume, MMP, and ROS to specific cellular phenotypes in iPSC derivatives.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized staining protocols and flow cytometric readouts of mitochondrial function.
- Analytics: Provides quantitative measurements of mitochondrial respiratory chain subunits and TFAM for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via disease-relevant iPSC models and mitochondrial biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable multiparametric mitochondrial profiling platform applicable across neurodegenerative disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in mitochondrial contributions to neurodegeneration.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined staining panels and flow cytometric gating strategies.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of mitochondrial liabilities in compound libraries.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that rescue mitochondrial complex deficits or ROS elevation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, mitochondrial biology, and iPSC differentiation protocols.
- Dependent on access to flow cytometers with appropriate fluorescence detection channels and compensation controls.
- Necessitates standardization of staining concentrations, incubation times, and gating strategies across laboratories.
- Requires optimization when adapting to non-neural cell types or different mitochondrial disease models.
- Limited by the need for live-cell handling for MMP/ROS measurements and fixed-cell protocols for protein detection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Flow Cytometry Measurement of Mitochondrial Volume, MMP, and Mitochondrial ROS in Live Cells
2:26
Flow Cytometry Measurement of MRC Complex Subunits and TFAM in Fixed Cells
3:49
Flow Cytometry Analysis
4:14
Results: Flow Cytometry Investigation of iPSC-Derived Neural Cells
5:07
Conclusion
