胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化ショウジョウバエ

この実験の全体的な目標は、ショウジョウバエの後期胚における運動ニューロンの投射パターンを分析することです。この方法は、運動軸索の誘導や神経サブキュの形成など、神経発達の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、発生中の胚における運動軸索の正確な視覚化を提供し、軸索経路探索の信頼性の高い分析を可能にし、状態欠陥を標的にすることです。

卵収集プレートを設置した翌日、プレートを新しいプレートに交換し、作りたてのイーストペーストを軽くたたきます。新鮮な皿で3時間後、ハエを新しいフードボトルに移します。そして、卵皿を摂氏25度で一晩インキュベートします。

午前中に、1.8ミリリットルのPBT溶液をプレートに加えます。そして、綿棒を使用して胚を取り除きます。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、胚と溶液をマイクロ遠心チューブに移します。

胚が底に落ち着いたら、できるだけ多くの溶液を吸引します。次に、すすぎごとに1ミリリットルのPBTを使用して胚を2回すすぎます。胚を脱コレオン化するには、最後のすすぎを1ミリリットルの50%漂白剤に置き換え、チューブを室温で3分間揺さぶります。

漂白剤を除去するには、PBTで胚を3回すすぎます。次に、最後のすすぎを半ミリリットルの100%ヘプタンと半ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドと交換します。次に、胚を穏やかに揺らしながら15分間インキュベートします。

インキュベーション後、下にある溶液層を取り除き、500マイクロリットルの100%メタノールを再び加えます。次に、30秒間、チューブを激しく振って胚を脱ビテリン化します。次に、上にある溶液を取り出し、500マイクロリットルの100%メタノールを再び加え、チューブをさらに10秒間振とうします。

チューブを振った後、チューブを軽くたたいて胚が落ち着くのを助け、できるだけ多くの溶液を取り除きます。次に、胚を100%メタノールで簡単にすすぎます。その後、すぐに胚をPBTで3回すすぎます。

次に、胚を1ミリリットルの新鮮なPBTに再懸濁します。そして、胚を摂氏37度で15分間インキュベートし、LacZ染色の準備をします。胚がインキュベートしている間に、1ミリリットルのX-gal染色溶液を調製します。

アリコートを摂氏65度の水浴で曇るまで温めます。次に、それを摂氏37度のヒートブロックに移します。胚を15分間温めた後、PBT溶液を取り除き、1ミリリットルの染色溶液と交換します。

次に、20マイクロリットルのX-gal基板を追加します。約2〜4時間、チューブを摂氏37度で静かに揺らしながら、青い沈殿物が形成されるまでインキュベートします。その後、染色液を取り出し、室温のPBTで胚を3回すすぎます。

すすぎ後、ニードルプローブまたは鉗子を使用して、解剖顕微鏡で胚を手で選別します。目的の染色された胚を、1ミリリットルのピペットを使用して半ミリメートルのマイクロ遠心チューブに集めます。次に、選択した胚を0.4ミリリットルのPBTで洗浄します。

次に、PBTを0.3ミリリットルのブロッキング溶液と交換し、胚を穏やかに攪拌して15分間インキュベートします。15分後、一次抗体を75マイクロリットル加え、インキュベーションを一晩続けます。翌朝、PBTで胚を約2時間洗浄し、約30分ごとに洗浄液を交換します。

洗浄後、二次抗体を含むブロッキング溶液0.3ミリリットルを加え、室温で一晩静かに揺さぶってチューブをインキュベートします。翌朝、PBTで胚を約3時間洗います。洗濯期間中にPBTを少なくとも5回交換してください。

洗浄後、胚を0.3ミリリットルのdab溶液に再懸濁し、2マイクロリットルの3%過酸化水素を加えます。その後、十分な沈殿物が生成されるまで、室温で穏やかに振とうしながら、暗闇でそれらをインキュベートします。これには通常30〜60分かかります。

次に、胚をPBTで4回すすぎ、0.2ミリリットルのマウント溶液に再懸濁します。次に、胚が摂氏4度の暗闇で平衡化するのを待ちます。胚をフィレにするには、スライドガラスで胚をステージングします。

まず、腹側を上にしてグリセロールの滴に移します。次に、解剖顕微鏡で前部と体長の1/4を切り取り、運動軸索のない最も後部の領域を切除します。次に、ニードルプローブを使用して、調製物をグリセロールから取り出し、背側を上にして、視野内で水平に配置します。

次のステップでは、針プローブの中空領域に挿入され、最後に曲げられた細いタングステン針が必要です。タングステン針を使用して、胚の後端に小さな切り込みを入れ、背側の正中線を切り続けます。解剖中は、タングステン針の先端がスライドガラスの表面に触れないようにしてください。

次に、プローブをグリセロール滴下に戻して、背側を上にして配置します。そこで、各体壁を腹側方向に展開することにより、腸を体壁から切り離します。2つの体壁がバラバラになるはずです。

次に、プローブを使用して、ボディウォールのフラップをスライドガラスに慎重に動かします。スライド上で、タングステン針を使用して、内臓を横に押して内臓を取り出します。タングステン針を安定させ、損傷を防ぐために、中空針をプローブしたままにし、タングステン針を操作しながらスライドガラスの表面に対してタングステン針を固定します。

次に、8マイクロリットルの取り付け溶液に調製物を新しいスライドガラスに取り付けます。カバースリップを取り付け、通常のマニキュアで端を密封します。次に、DICの光学系を使用して高解像度で画像をキャプチャします。

記載された方法を用いて、ステージ16の胚をFas2抗体で染色し、運動ニューロンおよび腹部半体セグメントA3およびA4の可視化のために調製した。通常、少なくとも7つの運動ニューロンが伸びて軸索を束ねてISNb神経枝を形成します。この準備では、周囲の多くの神経束も識別されました。分節間神経束が筋肉6と7の選択点に達すると、2つの軸索が選択的に筋束を脱し、筋肉6と7に活力を与えます。

同じことが他の選択ポイントでも発生し、バンドルは背側に伸びます。次に、最後の選択点で、2つの軸索が筋肉12にエネルギーを与えます。対照的に、Sema-1a変異体胚では、同じ軸索が選択したポイントで脱毛できません。

Sema-1エーゲ海製品は、神経発達中に運動軸索と標的筋との間の接続を形成するのに役立つことが知られているため、これは予想外ではありません。したがって、記載された方法は、変異体の表現型を解析するために用いることができる。このビデオを見れば、目的の変異胚を選別する方法、運動ニューロンの軸索突起パターンを免疫染色する方法、固定胚を平坦な調製のために解剖する方法について十分に理解できるはずです。