胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化

この実験の全体的な目的は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の後期胚における運動ニューロンの投射パターンを解析することです。この手法は、運動軸索のガイダンスや神経サブサーカス（subcu）の形成など、神経発達分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、発達中の胚における運動軸索を精密に可視化できることであり、これにより軸索の経路探索や標的条件の欠損に関する信頼性の高い解析が可能になります。

卵採取プレートを設置した1日後、プレートを、新しく調製した酵母ペーストを少量塗布した新しいプレートに交換します。新しいプレートに3時間置いた後、ショウジョウバエを新しい餌ボトルに移します。そして、卵プレートを25 °Cで一晩インキュベートします。

朝に、PBT溶液1.8 millilitersをプレートに加えます。次に、綿棒を使用して胚を剥離させます。その後、1 milliliterピペットを用いて、胚と溶液をマイクロ遠心チューブに移します。

胚が底に沈殿したら、溶液を可能な限り吸引して除いた後、1回につき1 mLのPBTを用いて胚を2回洗浄します。胚の卵膜を除去するため、最後の洗浄液を1 mLの50%漂白剤に置き換え、チューブを室温で3分間ロッキングします。

漂白剤を除去するため、胚をPBTで3回洗浄します。次に、最後の洗浄液を0.5 mLの100% heptaneと0.5 mLの4% paraformaldehydeに交換します。その後、胚を緩やかに揺らしながら15分間インキュベートします。

インキュベーション後、下層の溶液を除去し、100% methanolを500 microliters加えます。次に、胚を脱黄卵（devitellinize）させるため、チューブを30秒間激しく振とうします。その後、上層の溶液を除去し、再び100% methanolを500 microliters加えて、さらに10秒間チューブを振とうします。

チューブを振った後、軽く叩いて胚を沈殿させ、溶液をできるだけ多く除去します。次に、100% methanolで胚を短時間すすぎます。その後、すぐにPBTで胚を3回すすぎます。

次に、胚を1 mLの新鮮なPBTに再懸濁します。そして、LacZ染色の準備のため、胚を37 °Cで15分間インキュベートします。胚のインキュベート中に、X-gal染色液を1 mL分量準備します。

分注したサンプルを65°Cの恒温水槽で白濁するまで温めます。その後、37°Cのヒートブロックに移します。胚を15分間温めた後、PBT溶液を除去し、1mLの染色溶液に交換します。

次に、X-gal基質を20 µL加えます。青色の沈殿が形成されるまで、チューブを37 °Cで緩やかに揺らしながら約2〜4時間インキュベートします。その後、染色液を除去し、胚を室温のPBTで3回洗浄します。

洗浄後、解剖顕微鏡下でニードルプローブまたはピンセットを用いて胚を手作業で選別します。染色された目的の胚を、1 mLピペットを用いて0.5 mmマイクロ遠心チューブに回収します。次に、選別した胚を0.4 mLのPBTで洗浄します。

次に、PBTを0.3 millilitersのブロッキング溶液に交換し、胚を緩やかに攪拌しながら15分間インキュベートします。15分後、一次抗体を75 microliters加え、そのまま一晩インキュベーションを継続します。翌朝、約30分ごとに洗浄液を交換しながら、胚をPBTで約2時間洗浄します。

洗浄後、二次抗体を含むブロッキング液を0.3 milliliters加え、チューブを室温で緩やかに揺らしながら一晩インキュベートします。翌朝、胚をPBTで約3時間洗浄します。洗浄期間中、PBTは少なくとも5回交換してください。

洗浄後、胚を0.3 millilitersのdab溶液に再懸濁し、3% hydrogen peroxideを2 microliters加えます。その後、十分な沈殿が生成されるまで、室温で緩やかに揺らしながら暗所でインキュベートします。これには通常30〜60分かかります。

次に、胚をPBTで4回洗浄し、0.2 millilitersの封入液に再懸濁します。その後、胚を4 degrees Celsiusの暗所で平衡化させます。胚をフィレにするため、ガラススライド上に配置します。

まず、個体をグリセロールの一滴の中に移動させ、腹側を上にします。次に、解剖顕微鏡下で、前方部分と体長の1/4を切り取り、運動軸索が存在しない最後端領域を除去します。その後、ニードルプローブを用いて、標本をグリセロールから出し、背側を上に向け、視野内に水平に配置します。

次のステップでは、ニードルプローブの中空領域に挿入し、先端を曲げた微細なタングステン針を使用します。タングステン針を用いて、胚の後端に小さな切り込みを入れ、背側の正中線に沿って切開していきます。解剖中、タングステン針の先端がガラススライドの表面に触れないように注意してください。針がガラスに当たると容易に曲がってしまうためです。

次に、プローブを用いて個体をグリセロール滴に戻し、背側を上に向けます。そこで、各体壁を腹外側方向に展開して、腸を体壁から分離させます。これにより、2枚の体壁が分かれます。

次にプローブを用いて、体壁フラップを慎重にガラススライド上に移動させます。スライド上でタングステン針を使い、内臓を側方に押し出すことで除去します。タングステン針を安定させ、破損を防ぐため、中空針をプローブした状態にし、タングステン針を操作する際はガラススライドの表面に押し当てて固定してください。

次に、新しいガラススライド上に、8 µLの封入液を用いて試料を封入します。カバーガラスを被せ、縁を市販のマニキュアで封止します。その後、DIC光学系を用いて高解像度で画像を撮影します。

記載の方法を用いて、ステージ16の胚をFas2抗体で染色し、運動ニューロンおよび腹部半節A3およびA4の可視化のための調製を行った。通常、少なくとも7つの運動ニューロンが軸索を伸展・束状化させ、ISNb神経枝を形成する。本調製物では、周囲の多くの神経束も確認できた。節間神経束が筋肉6および7の分岐点に達すると、2つの軸索が選択的に脱束状化し、筋肉6および7を支配する。

束が背側へ伸長する際の他の分岐点においても同様のことが起こります。そして最後の分岐点において、2本の軸索が筋肉12に神経支配を与えます。対照的に、Sema-1a変異体胚では、同じ軸索が分岐点で脱束することができません。

Sema-1 aegean産物は、神経発達時に運動ニューロン軸索と標的筋肉との間の接続形成を促進することが知られているため、これは予想される結果です。したがって、本手法を用いて変異体の表現型を解析することが可能です。このビデオを視聴することで、目的の変異胚の選別方法、運動ニューロンの軸索投射パターンの免疫染色方法、および固定胚のフラットプレパレーションのための解剖方法について十分な理解が得られるはずです。