Name: モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶ 光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における運動ニューロン軸索分枝の定量的可視化法。Hb9::GFPトランスジェニックマウスを用いて、3Dで軸索パターンを観察・解析し、神経発生の理解を深める。

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LSFM 実験とデータ解析をさん・ シュー-chen シェンの援助と中央研究院の一部で楽器サービス部門の高度な光学顕微鏡を使用して行った。イメージング コア施設の IMB の Imaris 画像解析にかなりのテクニカル サポートからスー Ping リーさんに感謝いたします。IMB の科学英語編集コアは、原稿を検討しました。この作品は NHRI (NHRI-EX106-10315NC)、(104-2311-B-001-030-MY3) 最もアカデミア シニカ キャリア ・ デベロップメント賞 (CDA-107-L05) によって資金を供給します。

すべての生きている動物は特定病原体無料 (SPF) 動物施設、承認アカデミアシニカ IACUC によって監督で保管されました。
1. 固定
<ol><li>胚日 12.5 (E12.5) の胚を収集し、首をはねるそれらを骨抜き。</li>
	<li>胚個別の修正 24 ウェル プレート 1 ml/1 リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) x 作りたての 4% のパラホルムアルデヒドの一夜。シェーカーで 4 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>X、5-10 分のためのそれぞれ 1 mL の 1x PBS で少なくとも 3 固定の胚を洗浄し、残留パラホルムアルデヒドを削除するシェーカーで 4 ° C で一晩インキュベートします。</li>
</ol>2. 全取り付ける染色
<ol><li>0.5 %1 mL にそれぞれの胚を permeabilize PBS-トリトン-X-100 (pbst;) シェーカーの 4 ° C で一晩。</li>
	<li>1 ml の 10 %fbs がシェーカーで 4 ° C で一晩 1x PBS で準備の各サンプルをブロックします。</li>
	<li>1 ml 抗 GFP 一次抗体の胚を孵化させなさい (1:1, 000 10% 希釈 FBS) 運動神経の GFP シグナルを強化する一定の揺れで 72 h 4 ° C で。</li>
	<li>一次抗体の孵化後の 0.5 %1 mL で洗う 0.5% の変更、シェーカーで 4 ° C で 1-2 日にわたって PBST pbst; 少なくとも 3 回。</li>
	<li>二次抗体の 1 ml (1:1, 000 10% 希釈 FBS) と一定の揺れで 4 ° C で暗闇の中で一晩インキュベートします。</li>
	<li>0.5 %1 mL で 3 x を洗う pbst; 2-3 日間にわたってシェーカーで 4 ° c。1x PBS でイメージング前日までの 4 ° C でのサンプルを保ちます。 注: 胚は、胚の一部のイメージングによって、クリアする前に小さなセグメントに解剖することができます。前肢は、この実験的アプローチ (図 1 a) に保持されます。</li>
	<li>屈折率 1.49 nD イメージングのため透明な胚のレンダリングに一晩室温で光から保護、1.5 mL チューブの商業消去試薬で胚を孵化させなさい。 注: 消去試薬の量、約 5 回のサンプル ボリューム。</li>
</ol>3. LSFM (2-3 h)
<ol><li>
サンプルのセットアップ
	<ol>
<li>5 X/0.1 を設定用照明光学系と 5 X/0.16 検出光学系。サンプル ホルダーおよびサンプル毛細血管 (1.5 mm 内側直径、緑) を行い、顕微鏡にそれらを置きます。 注: は、詳細なセットアップ手順は、顕微鏡の操作マニュアルを参照してください。</li>
		<li>胚をマウントするには、次のとおり。<ol>
<li>毛細血管の直径を収まるように上の部分を切り取ることで P200 ピペット チップを用意し、尖った部分を取り外します (~ 3 mm) サンプル添付の。</li>
			<li>小さな炎を用いたピペット先端末の鈍化を溶かします。</li>
			<li>炎を消すし、すぐに溶けた端に垂直方向に胚を添付します。</li>
			<li>毛細血管サンプル ピペット チップの上の部分をフィットします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>破片や泡をオフに 1 分のための胚と平衡に商工会議所のバッファーを許可します。</li>
		<li>イメージング ソフトウェアを使用して、[検索] タブで毛細血管を検索を選択し、x、y、サンプル管の位置に z 軸を調整します。</li>
		<li>検索サンプルを選択し、胚に焦点を当てる 0.6 X ズームします。(図 1 b) 2 つの光源の光路とイメージの手足の長い軸が配置されていることを確認する胚を回転させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
画像の取得
	<ol>
<li>[取得] タブで、検出目標など光路パラメーターを定義、ブロック フィルター、ビームスプリッター、カメラ、およびレーザーのレーザーします。 注: この実験で GFP チャネルを使用 (励起波長: 488 nm; 発光フィルター: BP 505 に 545 nm、ビームスプリッター: SPS LP 560)。</li>
		<li>シャドウ削減のピボット スキャンをチェックします。</li>
		<li>取得設定を定義する: ビット深度 16 ビット;ズーム、0.36-0.7 X;片面照射 (左/右) またはデュアル サイド イルミネーション。</li>
		<li>連続] をクリックし、シャープな画像を取得するレーザー強度、露出時間、レーザー出力、光シートの位置を設定します。 注: レーザー出力は、光損傷を最小限に抑えるため可能な限り低く保持されます。</li>
		<li>画像の取得を終了するを停止を押します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
多次元買収
	<ol>
<li>Z スタックを定義するには、最初と最後のイメージの Z 位置を移動します。最適なスライス数を設定するのにをクリックします。</li>
		<li>選択した z スタックを取得する実験の開始をクリックします。</li>
		<li>それが終わったら、.czi 形式で画像を保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
画像処理 (オプション)
	<ol>
<li>デュアル サイド イルミネーションが適用される場合、 Lightsheet 処理したチャネルの下デュアル サイド融合を続行します。Multiview の処理は、複数の角度からの画像を結合する複数のビューを取得する場合に必要です。</li>
		<li>下にチャンネルを最大強度投影投影軸に沿って最高強度のピクセルからのデータを使用して 2D イメージを作成します。</li>
		<li>コピーチャネルの下には、元のセットから画像のサブセットを選択するサブセットをクリックします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 軸索分枝 (それぞれの個々 の神経の 30 分) の定量化
<ol><li>画像解析ソフトウェアで画像ファイルを開く (デフォルトでは、XYZ データを含むイメージを開くサーパス モードでは、3 D レンダリングされたビューとして)。</li>
	<li>画像の色、明るさを調整し、ディスプレイの調整ウィンドウを使用して比較 (編集 |表示ディスプレイの調整) 局所濃淡のコントラストに基づくフィラメントを検出します。</li>
	<li>新しいフィラメントを追加アイコンをクリックし、ドロップ ダウン メニューでAutopath (ループなし)アルゴリズムを選択します。</li>
	<li>(この場合は金利の分割軸索) に関心の領域を選択します。次へ完了をクリックします。</li>
	<li>スライスモードを使用して測定することができます最大かつ最も細い直径の測定を割り当てることによって開始とシード ポイントを定義します。</li>
	<li>関心領域の端に開始ポイントを割り当てます。手動で追加または開始点の除去を達成するため、最初のポインター モードを変更 (の移動 |Select) と、 Shift + 右クリックで関心のあるポイント。</li>
	<li>シード ポイント表示の楔形のすべてがマークされていることを確認するための手動のしきい値を選択します。ポインター モードを変更 (の移動 |Select)、 Shift + 左クリックで関心のあるポイント シード ポイントを追加・削除する手動でして。 注: 隣接神経からのバック グラウンド ノイズと信号を手動で削除することが重要です。</li>
	<li>スタート地点の周りのシード ポイントを削除] ボックスを確認します。</li>
	<li>離れすぎているし、バック グラウンド ノイズを表すポイントの除外を許可するように削除切断セグメントをチェックしてください。除外の上限を定義する次のステップで最大のギャップの長さを示します。</li>
	<li>バック グラウンド減算は、ガウス フィルターを使用してすべてのボクセルの背景強度を推定するためのしきい値を調整します。</li>
	<li>近似の断面積アルゴリズムを用いたデンドライト径自動しきい値を設定します。</li>
	<li>背骨の計算の手順をスキップします。</li>
	<li>処理を完了し、目的のスタイルと色を選択します。</li>
	<li>再建された軸索のみを表示するプロパティで [ボリューム] ボックスをオフにします。</li>
	<li>[統計] タブには、詳細を選択します。No.フィラメントを使用します。デンドライト ターミナル ポイントモーター軸索分枝の指標として運動神経終末を定量化します。 注: 統計的注釈を追加することができます希望する場合。</li>
	<li>.Tif ファイルとして再建された軸索のイメージをエクスポートします。</li>
</ol>

<ol><li>Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24449832">How to make spinal motor neurons.</a> Development. 141, 491-501 (2014).</li>
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<li>Nagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECEL1+mutation+implicates+impaired+axonal+arborization+of+motor+nerves+in+the+pathogenesis+of+distal+arthrogryposis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis.</a> Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).</li>
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<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).</li>
<li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nat Methods. 12, 30-34 (2015).</li>
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<li>De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+motor+neuron+pool+identity+and+muscle+nerve+trajectory+defined+by+postmitotic+restrictions+in+Nkx6.1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity.</a> Neuron. 57, 217-231 (2008).</li>
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<li>Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet-based+fluorescence+microscopy+for+three-dimensional+imaging+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).</li>
<li>Pantazis, P., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+whole-embryo+imaging%3A+a+quantitative+transition+is+underway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).</li>
<li>Reynaud, E. G., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+first+light+sheet+based+fluorescence+microscopy+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop.</a> Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

特定の状況で変更は、プロトコルのいくつかの手順を受ける場合があります。たとえば、固定の期間はたてパラホルムアルデヒドを使用して 1 つ以上の日に 2 h から様々 な胚の年齢によって異なります。抗体タンパク質架橋に敏感なため、全体のマウント染色前に固定されるので、代替の固定剤としてメタノールを使用できます。染色時に高い信号対雑音比、洗剤の濃度を最適化する必要がある (0.1 0.5%)。求による追加洗車手順前に、と抗体の孵化後も信号対雑音比を増やすことができます。さらに、組織のクリア ステップと光パスが深い軸索投射の全体を通じてブロックされたであることを確認することが重要です。組織の透明性を高めるためには、再サンプル溶液中に浸漬によってクリアリングの効果を逆転させる、商業決済エージェントで潜伏中に PBS の最小限の導入を確保するため重要です。そうでなければ、高い屈折または清算期間と消去試薬をお勧めします。一方、画像集録中のパラメーターは、異なるサンプルの間で異なります。デュアル サイドの照明と多視点画像より被写し界深度と拡張された詳細イメージングが可能ことがあります。しかし、以来、さまざまな角度から照明を同時に取得すると、単一側面のイ...

脊髄 MNs は中枢神経系の一部が、動きを制御する末梢の筋肉を刺激します。発展途上の脊髄における MN 前駆細胞 (Pmn) は脊索と隣接する体節から発せられる信号によって確立されます。ポスト mitotic の MNs を区別すべてが最終的に一連の脊髄1,2rostrocaudal 軸 MN サブタイプに上昇を与える Pmn から生成されます。脊髄 MNs 地形的、解剖学的にも整理されています。周囲3の彼らのそれぞれのターゲットの位置と相関する形態での配置。その筋の目標に達して、時に軸索を受信を拡張し、分岐するように誘導する細胞および外因性神経栄養因子の筋肉にさらに。分岐の欠陥と神経支配神経筋接合部 (NMJ) を形成する失敗に貢献するかもしれない。たとえば、グリア由来神経栄養因子 (GDNF)-誘導 Pea3 は皮膚大殿 (CM) に軸索分枝に不可欠なと広背筋 (LD) 筋肉4,5。さらに、食事ノックアウト マウス胚は誕生6、7の直後に呼吸障害や死亡の原因と、横隔膜の横隔神経の欠陥の分枝を示します。したがって、MN 成熟 (すなわち、軸索投射および分岐) のこの最後のステップは、神経細胞と標的細胞の間の通信を確保する重要です。
分枝パターンを表示するのには研究者では、共焦点レーザー顕微鏡や断面、ホール マウント標本8,9,10の 2 光子蛍光顕微鏡が行う通常。これらの顕微鏡検査の技術の両方を許容解像度と深度貫入を生成します。2 光子蛍光顕微鏡は、2 つの低エネルギー光子11の同時吸収による蛍光物質の励起を含みます。2 光子励起近赤外放射を使用するので減少励起周波数は減らされた散乱と最大 1 mm 以上の深さでイメージングできるように組織のより良い組織浸透に貢献します。共焦点顕微鏡は、焦点のずれた信号し、フォーカル プレーン12内の光を収集するだけのフィルターによって削除します。このアプローチでは、Z スタック関数を介して三次元 (3 D) 画像を生成する別の焦点面からのサンプルの画像を結合できます。それにもかかわらず、光の大部分はブロックされ、高い数値の開口部あいまいなフィールドの深さと、信号強度が低下します。もっと重要なは、両方の技術は重度の生成や毒性に貢献する時点で一枚の平面のイメージが作成された場合でも、全体の標本が照明を受け取るので。
これらの欠点を回避するために LSFM は、支持された代わりに、高速、光効率の高い, という利点を持つと以下の光毒性13,14になっています。さらに、LSFM は、多視点画像をことができます。このアプローチは、3 D 空間で広まったモータ軸索と分散端末を可視化に特に適しています。サンプルは縦の軸線および x、y、および z 軸に沿って動きの周りの回転を可能にするステージ上にマウントされるため、LSFM は他の 2 つのオプションを上回ります。このセットアップだけでなく、両者フラット スライド上のサンプルの実装サンプルの最小ブロック表示が、また望ましい照明パス、2 光子および共焦点の顕微鏡検査の欠点の選択ことができます。したがって、LSFM は軸索分枝の 3 D 画像処理およびマウス胚における運動神経終末の定量化のための最適なツールです。

<table><tbody><tr><td>Hb9::GFP</td><td>ジャクソン研究所</td><td>005029</td><td>胚の日 12.5 (E12.5)</td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td></td><td></td>の胚を<td>採取します 200ml の場合: ddH2O に 20ml 10X PBS、8g PFA を加えます。NaOH(10N)でpHを7.4に調整します。フィルター滅菌し、-20°Cで保管します。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水10X(PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>1Lの場合:NaCl 80 g、KCl2 g、Na2HPO4 14.4g、KH2PO4 2.4 gを加え、ddH2Oを補充します。オートクレーブしてRTで保管します。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Σ</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャー</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>ヒツジ ポリクローナル抗GFP</td><td>AbD Serotec</td><td>4745-1051</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ アンチヒツジ</td><td>Invitrogen</td><td>A-11015</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>RapiClear 1.49 クリアリング試薬</td><td>SunJin Lab</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml microチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>ThermoFisher</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>5 SA ピンセット</td><td>ideal-tek</td><td>3480641</td><td></td></tr><tr><td>アイリス はさみ striaght シャープ/シャープ</td><td>Aesculap</td><td>BC110R</td><td></td></tr><tr><td>マイクロサージェリー メス、使い捨て</td><td>Aesculap</td><td>BA365</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>TKS</td><td>RS-01</td><td></td></tr><tr><td>ライトシート Z.1 顕微鏡</td><td>カールツァイス顕微鏡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イマリス 8.4.0 画像解析ソフトウェア</td><td>Bitplane, チューリッヒ, スイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP マウス)</td><td>ジャクソン研究所</td><td>005029</td><td></td></tr></tbody></table>

モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

運動と脊椎動物の複雑なタスクを制御の支配のターゲットと通信するための軸索を脊髄運動ニューロン (MNs) に拡張します。したがって、どのようにモーター軸索に移動、arborize とその周辺の筋肉を刺激するターゲット開発と変性の間の分子機構を明らかにするため重要です。Hb9::GFPマウスの遺伝子組み換えの行は、萌芽期の開発の間にモーター軸索の軌跡を視覚化する提供して長い軸索ターミナル楔形の完全なスペクトルの詳細な説明のパターンの複雑さのため不完全なまま、現在の光学顕微鏡の限界。ここでは、光シート蛍光顕微鏡 (LSFM) と, 定性的かつ定量的視覚化モータ軸索を開発するロバストな画像解析を組み合わせた改良されたプロトコルについて述べる。このシステムは、遺伝的変異体またはミネソタ病気モデルHb9::GFP線、モーター軸索ナビゲーションおよび楔形の欠陥につながる新規の分子メカニズムを明らかに越えるに簡単に適用できます。

LSFM では、マウスで MN 軌道と軸索分枝の 3次元可視化詳細な胚を提供しています。[明るい] フィールドで、組織は商業消去試薬に浸漬されて後完全に透明に表示します。1 週間前にイメージング試薬をクリア内のストレージの後収縮またはサンプルの腫れが気づかなかっただった。蛍光チャネルの下で運動ニューロンは transgenically 表現される GFP (映画 1) が付いています。いくつかのインスタンスでは、軸索の構造の詳細が損なわれます。たとえば、図 2は、低品質の画像を表します。いくつかの要因には、画像品質が低下します。まず、十分な透過および洗浄ステップは高いバック グラウンド信号を可能性があります。第二に、不十分なオフになって組織を光の散乱は、不鮮明な画像になります。最後に、最適なサンプル画像集録中の位置可能性があります光散乱を増やすか光のパスをブロックします。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa...

ここでは、運動ニューロンの投影と形質転換Hb9::GFPマウス胚における軸索分枝を可視化するためのプロトコルについて述べる。運動ニューロンの免疫染色後は、後続の定量分析のため光シート蛍光顕微鏡画像の胚を使用されます。このプロトコルは、中枢神経系の他のニューロンのナビゲーション プロセスに適用されます。

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

このプロトコルの全体的な目標は、マウス胚のライトシート顕微鏡と画像解析ソフトウェアを使用して、運動ニューロンの軸索分枝パターンの定性的および定量的評価を可能にすることです。この方法は、複雑な運動と協調した運動ニューロンの発生を理解するのに役立ちます。この手法の主な利点は、運動ニューロンの軸索樹状化パターンをさまざまな角度から観察および画像化し、個々の神経を定量的に分析できることです。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるYa-Ping YenとEe Shan Liauです。この手順を開始するには、胚を24ウェルプレートに個別に固定し、新たに調製した4%パラホルムアルデヒドをPBS中のウェル1ミリリットルで摂氏4度でシェーカーで一晩固定します。翌日、固定胚を少なくとも3回、それぞれ5〜10分間、1ミリリットルの1X PBSで洗浄し、摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、各胚を0.5%PBSTの1ミリリットルで、シェーカーで摂氏4度で一晩透過化します。1X PBSで調製した10%FBSの1ミリリットルで各サンプルを4°Cで一晩シェーカーでブロックします。その後、各胚を1ミリリットルの抗GFP一次抗体と摂氏4度で72時間、絶えず振とうしながらインキュベートします。一次抗体のインキュベーション後、各胚を0.5%PBST1ミリリットルで1ミリリットル、摂氏4度、シェーカーで1〜2日間洗浄します。その後、1ミリリットルの二次抗体を添加し、4°Cの暗闇で一晩、絶えず振とうしながらインキュベートします。翌日、各胚を0.5%PBSTの1ミリリットルで、摂氏4度のシェーカーで2〜3日間にわたって少なくとも3回洗浄します。次に、各胚を屈折率1.49 ndの市販の清澄試薬で、室温で光から保護された1.5ミリリットルのチューブで一晩インキュベートします。5X/0.1 照明光学系と 5X/0.16 検出光学系を設定します。サンプルホルダーとサンプルキャピラリーを組み立てます。サンプルチャンバーに清澄溶液を充填して調製します。胚をマウントするには、P200ピペットチップをキャピラリーの直径に合うように上部を切り取り、サンプル付着用の尖った部分を取り外して準備します。次に、ピペットチップの鈍い端を小さな炎で溶かします。炎を消し、溶けた端に胚を垂直にすばやく取り付けます。ピペットチップの上部をサンプルキャピラリーに取り付け、準備したサンプルチャンバーを顕微鏡に入れます。イメージングソフトウェアを使用して、[Locate]タブの[Locate Capilery]を選択し、X、Y、Z軸を調整します。次に、[Locate Sample]を選択し、0.6倍にズームして胚に焦点を合わせます。チャンバーバッファーをしばらくの間胚と平衡化させて、破片や気泡を取り除きます。画像取得の場合は、[Acquisition] タブで、Detective Objectives、Laser Blocking Filter、Beam Splitter、Cameras、Lasers などのライトパス パラメーターを定義します。シャドウリダクションの[ピボットスキャン]チェックボックスをオンにします。次に、アクイジション設定、ビットベプスから16ビット、0.36〜0.7倍の範囲へのズーム、シングルサイトイルミネーションまたはデュアルサイトイルミネーションを定義します。[連続]をクリックし、[レーザー強度]、[露光時間]、[レーザー出力]、および[ライトシート位置]を設定します。続いて、Stop を押して画像取得を終了します。透明なサンプルが最短の光路内に配置されていることを確認して、個々の運動神経の微細な樹状構造の画像を詳細に取得できるようにすることが重要です。多次元集録の場合は、最初と最後の画像のz位置を移動してZスタックを定義します。「最適」をクリックして、スライス番号を設定します。次に、[実験の開始] をクリックして、選択した Z スタックを取得します。完了したら、画像をczi形式で保存します。軸索の樹状化を定量化するには、想像解析ソフトウェアで画像ファイルを開きます。[ディスプレイ調整] ウィンドウを使用して画像の色、明るさ、コントラストを調整し、ローカル強度のコントラストに基づいてフィラメントを検出します。次に、「Add New Filaments」アイコンをクリックし、ドロップダウンメニューから「Autopath Algorithm」を選択します。関心領域を選択し、スライスモードを使用して測定できる最大直径と最小直径の測定値を割り当てることにより、開始点とシード点を定義します。関心領域の端に始点を割り当てます。開始点を手動で追加または削除するには、最初にポインター モードを変更し、選択をナビゲートしてから、目的のポイントで Shift キーを押しながら右クリックします。次に、シードポイントの手動しきい値を選択して、表示されているすべてのアーボライゼーションがマークされていることを確認します。次に、シードポイントを手動で追加または削除します。[切断されたセグメントを削除] ボックスをオンにし、開始点の周囲のシード ポイントを削除します。その後、バックグラウンド減算のしきい値を調整し、プロセスを終了します。正確な定量化のためには、バックグラウンドアーチファクトを除去し、検出器の経路が真の軸索アーボリゼーションを反映していることを確認する必要があります。最後に、希望のスタイルと色を選択します。[統計]タブで、[詳細]を選択し、フィラメント番号、樹状突起終点を使用して、運動軸索の樹状化の指標として運動神経終末を定量化します。次に、再構築した軸索の画像をtiffファイルとしてエクスポートします。LSFMは、マウス胚における運動軸索の樹状形成を詳細に3D可視化します。運動ニューロンを上記のプロトコルに供し、トランスジェネニック発現GFPで標識する。軸索のアーボリゼーションをより詳細に画像化し、定量化を行うために、倍率を調整して、微細なアーボライズされたすべての構造を明らかにすることができます。最後に、個々の前肢神経の軸索枝形成パターンを画像解析ソフトウェアを使用して再構築できます。ソフトウェアのオートパスアルゴリズムは、フィラメントをトレースし、軸索終末の総数を定量化します。このビデオを見れば、ライトシート蛍光顕微鏡を使用してマウス胚のサンプルを調製し、運動ニューロン軸索を画像化する方法について十分に理解できるはずです。また、MRSによって個々の運動神経の樹木形成パターンを定量的に評価する方法も知ることができます。

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神経科学

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の生体内で個々の神経細胞や神経堤細胞のイメージングを説明します。このメソッドは、蛍光共焦点タイムラプス顕微鏡を使用して細胞の行動とアクチンの局在を調べるために使用されます。...

細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング

このビデオは、マイクロ流体チャンバーシステムを使用して運動ニューロンの軸索輸送を追跡する方法を示しています。これは、ポリマー被覆ウェル内でマウス胚性脊髄組織を栄養培地で培養し、軸索成長を誘導することを含みます。ライブイメージングにおける蛍光色素染色オルガネラの動きは、双方向の軸索輸送を確認します。...

マイクロ流体デバイスを用いた運動ニューロンにおけるオルガネラの軸索輸送の追跡

Source: Liau, E. S. et al. マウス胚における運動軸索ナビゲーションの可視化とマウス胚における軸索樹状化の定量化 J. Vis. Exp. (2018).

ライトシート蛍光顕微鏡による運動ニューロンの投射と軸索分岐の可視化

出典:Boyer, N. P. et.al., 切除マウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと分析. J. Vis. Exp. (2020)...

有髄マウス軸索におけるニューロフィラメント輸送の蛍光光活性化イメージング

出典:Jeong, S. Visualization of the Axonal projection pattern of the Embryonic motor neurons in Drosophila.J. Vis. Exp.

ショウジョウバエにおける胚性運動ニューロンの軸索投影パターンの可視化

ここでは、遺伝子操作マウスの開発における感覚軸索成長表現型を評価する効果的な方法として、全動物の末梢侵害受容器軸索突起のイメージングのために胎児マウスを遺伝子型決定し、染色し、準備するための最適化されたプロトコルを提示します。...

マウスの胚感覚軸索投影のホールマウントイメージング

光学顕微鏡技術と生化学的アッセイを組み合わせることで、ネトリン依存性軸索分岐におけるSNARE媒介性エキソサイトーシスの関与を解明します。この技術の組み合わせにより、軸索の分岐と細胞形状の変化を制御する分子メカニズムの同定が可能になります。...

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

この研究は、後期第16段階ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学法を詳述している。 FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、神経発達中にモーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供する。...

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

このプロトコルは、DNA/DOTAP混合物を1日齢のXenopus...

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

ここでは、出生後のマウス網膜外植体における神経突起形態形成をタイムラプス共焦点顕微鏡により調べる方法を提示する。我々は、膜標的蛍光タンパク質を Cre依存的に発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた網膜細胞型の疎標識および取得およびそれらの微細プロセスのためのアプローチを説明する。...

遺伝子標的網膜細胞集団のスパースアデノ随伴ウイルス標識を用いた神経樹木化のタイムラプスイメージング

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

学ぶ 光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における運動ニューロン軸索分枝の定量的可視化法。Hb9::GFPトランスジェニックマウスを用いて、3Dで軸索パターンを観察・解析し、神経発生の理解を深める。

モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化

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