スライス パッチ ・ クランプの技術学習によって誘発される可塑性を分析するため

こんにちは、私の名前は満島大です。ここでは、訓練を受けていない動物のパッチクランプデータを比較して、訓練された動物の脳スライスの作り方をご紹介します。学習によるシナプス可塑性を解析することができます。

こんにちは、木田裕之と申します。本実験では、ローターロッド試験を用いて、運動の神経機構を調査しました。ローターロッド試験は、げっ歯類の運動認知を評価するために広く使用されています。

この方法の利点は、ローテーター速度を上げることで、試験中に発見のレベルを変更できることです。ローターロッドテスト。モータータスクの前に、ローターロッド装置を4秒で4〜300rpmの加速モードに設定する必要があります。

ラットは、各テストで10回の試行を実行させられました。試行の間隔は30秒でした。最初のトレーニングセッションでは、ラットは通常、低速でもロッドから落ち、間違った方向に歩くことがあります。

しかし、訓練を繰り返すと、ラットはより速い速度で歩くことができるようになる。ロッドのレイテンシーを測定することで、ラットのスキルの学習性能を推定できます。ここでは、ローターロッドテストの結果を見ることができます。

この図に示すように、運動技能を身につけるには2日間のトレーニングで十分です。最初の試行の遅延と比較して、事後分析では、トレーニング日の最終試行で大幅な改善が示されました。ロッドのレイテンシーを測定することで、ラットのスキルの学習性能を推定できます。

次に、抑制回避テストを紹介します。このテストは、コンテキスト学習のパフォーマンスを分析するのに役立ちます。抑制性回避装置は、トラップドアで区切られた明るい側と暗い側で構成されています。

トレーニングセッション中、ラットは明るい場所に置かれ、環境に順応するまでの時間を短時間与えられます。ドアが開くと、ネズミは自由に暗いエリアに入ることができます。暗いエリアに入ると、ドアが閉められ、ネズミに2秒間の軽度の電気ショックが与えられます。

試験終了後、ラットをケージに30分間戻した後、ラットを再び装置の照明エリアに置きます。ショックの30分後、訓練されたラットは、暗い領域に入る前に一貫して長い潜伏時間を示しました。ここでは、抑制回避テストの結果を見ることができます。

電気ショックの後、ネズミは暗い部分を避け、通常は好まない明るい側にとどまることを学びました。このように暗い面を避ける傾向は、文脈記憶の獲得を示しています。トレーニング後の脳スライス。

切開する前に、すべてのハサミ、止血器、ビーカーを砕いた氷で冷やします。ここでは、解剖の準備を見ることができます。脳の解剖はできるだけ早く行う必要があります。

これを深く麻酔した後、ラットを砕いた氷の入った浅いトレイに入れ、腹腔を開くために切開を行います。横隔膜切開後、さらに横切開を行います。胸腔を開くには、止血剤を使用して肋軟骨を凝集して閉じます。

心臓を露出させた後、18ゲージのステンレス製の針を左心室の後部に挿入します。針の先端は、大動脈の壁を通して見えるはずです。右耳介を切断した後、灌流を開始します。

針とシリンジの両方に、最初にガス化された氷冷解剖バッファーが充填されていることを確認してください。.灌流前に気泡も除去する必要があります。まず、頭蓋骨の後部をカットします。

次に、横方向のカットを行い、続いて中央のカットを行って脳を露出させます。解剖後、脳を泡立つ氷冷緩衝液に5分間置く必要があります。解剖を進める前に、濾紙を氷冷バッファーを使用して濡らしてください。

次に、脳を氷のように冷たいステンレス鋼のステージに置きます。切断ステージの角度は、脳のスライスの正しい切断角度を確保するために重要です。角度を間違えると、標的の錐体ニューロンが切断される可能性があります。

トリミング後、ビブラトーンのステージに瞬間接着剤を1滴置きます。しっかりと接着するために、余分な解剖バッファーは濾紙を使用して除去する必要があります。ビブラトンを使用すると、泡立つ氷のように冷たいバッファーで薄い脳スライスを維持できます。

私たちのターゲット領域は一次運動皮質です。目的の脳領域は、虹彩ハサミを使用してトリミングできます。インターフェースチャンバーは、プラスチック製の食品容器を使用して作成できます。

界面チャンバーの蓋は、ガスを封じ込めるために必要です。スライスは、赤外線DIC顕微鏡を使用して観察します。ここでは、一次運動皮質のレイヤー2/3ニューロンの例を見ることができます。

パッチレコーディングピペットには、適切な細胞内溶液が充填されています。電流クランプ解析のソリューションは、電圧クランプ解析とは異なります。代表的な結果。

電流クランプ法は、固有の細胞特性の解析に役立ちます。ローターロッドのトレーニング後、一次運動皮質のレイヤー2/3ニューロンから電流クランプデータを取得することができました。パネルAは、電流注入によって誘導される典型的なトレースを示しています。

パネルBは、注入された電流とスパイクの数との関係を示しています。1日訓練されたラットは、訓練されていないラットよりもスパイクを誘発しなかったが、2日間訓練されたラットは、はるかに多くのスパイクを誘発した。下のパネルに見られるように、1日訓練されたラットは、安静時能力が低く、スパイク閾値が高く、後分極が深かった。

2日間訓練されたラットは、より高い休息能力と膜抵抗性を示しました。電圧クランプ技術は、学習によって誘発されるシナプス可塑性を解析するのに有用です。ここでは、コンテクストトレーニング後のCA1ニューロンからのデータを見ることができます。

我々は、グルタミン酸またはGABAの単一小胞によって誘導されたCA1ニューロンから、超小型のシナプス後電流を得た。パネルAとBは、ミニチュアのシナプス後電流の代表的な痕跡を示しています。テトロドトキシンの存在下で、マイナス16ミリボルトの小型EPSCと0ミリボルトの小型IPSCを同じニューロンで連続的に測定した。

パネルCは、未訓練ラット、訓練済みラット、非対ラット、およびウォークスルーラットのミニチュアEPSCおよびミニチュアIPSC振幅の2次元プロットを示しています。パネルDは、ミニチュア周波数のプロットを示しています。下のパネルに見られるように、コンテクストトレーニングは、ニューロンへのシナプス入力の多様性を促進する興奮性シナプスと抑制性シナプスの両方を有意に強化しました。

要約すると、電流クランプ技術は、学習によって誘発される細胞特性の変化を分析するのに役立ちます。また、ボルテージクランプ法は、興奮性シナプスと抑制性シナプスにおける学習誘発可塑性を解析するための強力なツールです。これらの分析の詳細な結果は、以下の資料に記載されています。