スライス パッチ ・ クランプの技術学習によって誘発される可塑性を分析するため

こんにちは、三島大です。ここでは、未訓練動物でのパッチクランプデータと比較することで、訓練済み動物における脳スライスの作製方法を説明します。これにより、学習によって誘発されるシナプス可塑性を解析することが可能です。

こんにちは、木田裕幸です。本実験では、ローターロッド試験を用いて、走行運動の神経メカニズムについて検討しました。ローターロッド試験は、げっ歯類の運動認知能を評価するために広く用いられています。

この方法の利点は、ローター速度を上げることで、試験中の探索レベルを変化させられることです。ローターロッド試験。モータータスクの前に、ローターロッド装置を300秒間で4から40 rpmまで加速する加速モードに設定してください。

ラットに各テストにつき10回の試行を行わせた。試行間のインターバルは30秒とした。最初のトレーニングセッションでは、ラットは低速であっても通常は棒から落下し、時には逆方向に歩くことがある。

しかしながら、トレーニングを繰り返すことで、ラットはより速い速度で歩行できるようになります。ロッド上の潜伏時間を測定することにより、そのスキルの習得状況を推定することが可能です。ここでは、ローターロッド試験の結果を示します。

この図に示すように、2日間のトレーニングで運動スキルを習得するのに十分です。初回試行時の潜時と比較して、事後解析の結果、トレーニング最終日の試行において有意な改善が認められました。棒上の潜時を測定することで、ラットのスキル学習能を推定することができます。

次に、抑制回避試験について説明します。この試験は、文脈学習能を分析するのに有用です。抑制回避装置は、落とし戸で仕切られた明室側と暗室側で構成されています。

トレーニングセッション中、ラットを明室に配置し、環境に慣れるまで短時間待機させます。扉が開くと、ラットは自らの意思で暗室に入ることができます。暗室に入ると扉が閉じ、ラットに2秒間の弱電撃を与えます。

試験完了後、30分間ケージに戻したあと、ラットを再び装置の明所（lighted area）に配置します。電気ショックから30分後、訓練されたラットは一貫して、暗所（dark area）に入るまでの潜時が長くなることを示しました。ここでは、抑制回避試験の結果を確認できます。

電気ショックの後、ラットは暗いエリアを避け、通常であれば好まない明るい側に留まることを学習しました。この暗い側を避ける傾向は、文脈記憶の獲得を示しています。トレーニング後の脳切片。

切開に先立ち、すべてのハサミ、止血鉗子、ビーカーを砕氷で冷却します。ここでは、解剖に向けた準備内容を確認できます。脳の解剖は、可能な限り迅速に行う必要があります。

深く麻酔した後、ラットを砕氷を入れた浅いトレイに置き、腹腔を開くために切開を行います。横隔膜を切開した後、さらに外側を切開します。胸腔を開くには、止血鉗子を用いて肋軟骨をクランプして固定してください。

心臓を露出させた後、18ゲージのステンレス製針を左心室の後部に挿入します。針先は大動脈の壁を通して見える必要があります。右心耳を切断した後、灌流を開始します。

針とシリンジの両方に、あらかじめガス飽和させた氷冷解剖緩衝液を満たしておいてください。灌流前に、気泡を完全に取り除いておく必要があります。まず、頭蓋骨の後方を切開します。

次に側面を切開し、続いて中央を切開して脳を露出させます。摘出後、脳を気泡を含ませた氷冷バッファーに5分間浸します。解剖を進める前に、フィルターペーパーを氷冷バッファーで湿らせておいてください。

次に、脳を氷冷したステンレス製ステージ上に配置します。脳切片の切断角度を正確に確保するためには、切断ステージの角度が極めて重要です。角度が不適切であると、標的となる錐体ニューロンを切断してしまう可能性があります。

トリミング後、Vibratomeのステージ上にシアノアクリレート系接着剤を1滴滴下します。強固に接着させるため、フィルターペーパーを用いて余分な解剖用バッファーを除去してください。Vibratomeを使用し、バブリングさせた氷冷バッファー中で維持しながら、薄い脳切片を作成します。

標的領域は一次運動野です。標的となる脳領域は、アイリス剪刀を用いて切り出すことができます。インターフェースチャンバーは、プラスチック製の食品容器を用いて作製可能です。

ガスを封じ込めるために、インターフェースチャンバーの蓋が必要です。スライスは赤外線DIC顕微鏡を用いて観察します。ここでは、一次運動野における第2/3層ニューロンの例を確認できます。

パッチレコーディング用ピペットを適切な細胞内液で満たします。電流クランプ分析に使用する溶液は、電位クランプ分析に使用するものとは異なります。代表的な結果を示します。

カレントクランプ法は、細胞の固有の特性を解析するのに有用です。ローターロッド訓練後、一次運動皮質の第2/3層ニューロンからカレントクランプデータを取得することができました。パネルAは、電流注入によって誘導された典型的なトレースを示しています。

パネルBは、注入電流とスパイク数の関係を示しています。1日訓練したラットはスパイクの誘発が少なかった一方、2日訓練したラットは未訓練のラットよりも多くのスパイクを誘発しました。下のパネルに見られるように、1日訓練したラットは、より低い静止電位、より高いスパイク閾値、およびより深い後過分極を示しました。

2日間のトレーニングを受けたラットは、より高い静止膜電位と膜抵抗を示しました。ボルテージクランプ法は、学習誘発性のシナプス可塑性を解析するのに有用です。ここでは、文脈的トレーニング後のCA1ニューロンからのデータを確認できます。

グルタミン酸またはGABAの単一小胞によって誘発されるCA1ニューロンからのミニチュアポストシナプス電流を測定しました。パネルAおよびBは、ミニチュアポストシナプス電流の代表的なトレースを示しています。テトロドトキシン存在下において、同一のニューロン内で-16 mVでのミニチュアEPSCと0 mVでのミニチュアIPSCを順次測定しました。

パネルCは、未訓練、訓練済み、非ペアリング、およびウォークスルー群のラットにおけるミニチュアEPSCおよびミニチュアIPSC振幅の2次元プロットを示しています。パネルDは、ミニチュア頻度のプロットを示しています。下段のパネルに見られるように、文脈訓練によって興奮性および抑制性シナプスの両方が有意に強化され、ニューロンへのシナプス入力の多様性が促進されました。

要約すると、カレントクランプ法は、学習によって誘発される細胞特性の変化を分析するのに有用です。また、ボルテージクランプ法は、興奮性および抑制性シナプスにおける学習誘発性可塑性を分析するための強力なツールとなります。これらの分析の詳細な結果については、以下の論文をご参照ください。