げっ歯類からの急性海馬スライスを用いて、シナプスタグ付け/キャプチャとクロス捕獲調査

本手順の総合的な目的は、げっ歯類由来の海馬スライスを用いて、CA1錐体ニューロンにおける長期可塑性と、シナプスタギング、キャプチャー、クロスタギングなどの連合プロセスを研究することである。まず、脳を解剖し、低温で酸素供給された人工脳脊髄液中に海馬を迅速に分離する。次に、手動組織スライサーを用いて急性海馬スライスを作製し、インターフェースチャンバー内でインキュベートする。

次に、2本の刺激電極と2本の記録電極をCA1領域に配置し、2つのシナプス入力からのフィールドEPSPおよびポピュレーションスパイク応答を記録します。最後のステップは、特定の時間窓内で、一方のシナプス入力に一過性の可塑性を、もう一方の入力に持続性の可塑性を誘導することです。最終的に、両方の入力からのフィールドEPSP応答を長時間にわたって記録し、シナプスタギングおよびキャプチャ、ならびにクロスカプチャのメカニズムを調査します。

シナプス標識と捕捉（Synaptic tagging and capture）は、特定の時間枠内で短期記憶がどのように長期記憶へと変換されるかという概念的な基礎を提供します。この手法の実験手順は、複数のシナプス入力からの刺激と記録を伴うため習得が困難であり、視覚的な実演が極めて重要です。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるMahesh Shira、machete、およびmaima Sharmaが行います。

この手順を開始するために、A CSFを準備し、95% oxygenと5% carbon dioxideでバブリングします。インターフェースチャンバーの底に、容量の約70%まで蒸留水を満たします。その後、32 °Cに設定された温度コントローラーの電源を入れます。

次に、流入チューブから蒸留水を高流量で流し、上部チャンバーを10～15分間洗浄した後、A CSFを1 mL/minの流量で流します。その後、スライスの静置面とするためにネットを上部チャンバーに設置します。下部チャンバーへのカーボゲン供給を開始し、流入チューブを継続的にカーボゲン処理されたA CSFに浸します。

A CSFにカーボゲンを飽和させ、上部チャンバーを満たすまで20分間放置します。このステップで、ティッシュチョッパーにカミソリの刃を取り付け、切断端が均等に揃っていることを確認します。小さなろ紙を切断してテストし、刃がしっかりと固定されていることを確認してください。

次に、スライディングバーニヤマイクロメーターを開始位置に設定します。安楽死させたラットの頭部を用意し、アイリス剪刀を用いて後頭蓋骨を切断し、脳幹を除去します。その後、頭蓋骨の右側に小さな切開を、左側にそれより長い切開を加えます。

ボーンURを用い、頭蓋骨の左側から右側に向かって慎重に除去します。皮質およびそれを覆う薄い硬膜を露出させるため、細いスパチュラで硬膜を慎重に取り除き、その後ボーンRoで前頭骨板を除去します。続いて、皮質と小脳の接合部にある残りの硬膜をスパチュラの平坦な端で取り除きます。この際、圧力を上向きに維持し、脳を損傷しないように注意してください。

スパチュラを用いて、冷やした炭酸飽和A CSFを満たしたアルミ冷却ブロック上のペトリ皿に脳をそっと移します。11番メスを用いて海馬を単離させるため、直線的に切開して小脳を除去し、さらにもう一度切開して脳の前方部分の4分の1を除去します。その後、正中線に沿って浅い矢状切開を行います。正中線から開始します。

シックルスケーラーを用いて皮質を慎重に取り除き、背側海馬を露出させます。その後、海馬の上にある皮質層を取り除きます。海馬交連に小さな切れ込みを入れます。

シックルスケーラーを用い、背側端から転がすようにして海馬を慎重に摘出します。続いて、摘出した海馬の周囲にある皮質および結合組織を、シックルスケーラーの湾曲した端を用いて除去します。海馬組織をスライスするために、CSFに浸した30 millimeterのワトマンろ紙を、手動スライサーのスライシングステージ上に配置します。

海馬組織をろ紙の上に移動させます。鎌状メスの平らな端を使用して、ろ紙を動かし、スライサーの刃に対して海馬を適切な方向に向けて配置します。これにより、海馬がfiaに対して約70度の角度で切断されるようにします。次に、海馬組織の周囲にある余分な溶液を吸い取ります。

折りたたんだろ紙を用いて、海馬を横断的にスライスし、スライスの形態が不明瞭な海馬の極端な端の部分の組織は廃棄します。次に、1回スライスするごとにバーニヤマイクロメーターを調整し、残りの組織を 400 micron の厚さでスライスします。カット後、柔らかい毛のブラシを使用して、スライスをブレードから冷えた炭酸ガス含有 A CSF が入った小型ビーカーへ慎重に移動させます。

次に、清潔なプラスチック製パスピペットを用いて、スライスをスライスチャンバー内のネット上にそっと移動させます。太いチップを使い、電極の配置と記録確認が容易になるようにスライスの位置を慎重に調整し、スライスがA CSFの層に十分に囲まれているが、完全に浸かっていない状態であることを確認します。その後、チャンバーに蓋をし、シナプス tagging and capture 実験ではスライスを2〜3時間インキュベートします。

顕微鏡下で、Schaffer側枝を刺激するために2本の刺激電極をCA1領域のstratum radiatumに配置し、記録電極を刺激電極の中間にあるCA1の頂端樹状突起領域に配置します。fEPSP応答を記録するには、ポピュレーションスパイクを記録するために別の記録電極をstratum pyramidale層に配置してください。

すべての電極がスライスに接触したら、テスト刺激を与え、両方の入力で適切なフィールドEPSP信号が得られるか確認します。適切なf-EPSP信号が得られたら、マニピュレーターの微動ノブを使用して、電極をさらに約200 µm慎重に下げます。その後、スライスを回復させるために20分間待ちます。

その後、20 µAから100 µAまでの範囲の電流強度でフィールドEPSPの傾きを測定し、入出力関係を決定します。次に、各入力について、最大フィールドEPSP傾きの40%を誘発する刺激強度を、実験全体の一定刺激として設定します。15～20分後、ベースラインの記録を開始し、一方の入力におけるLTP/LTD誘発前に、少なくとも30～60分間の安定したベースラインを記録します。その後、単一の高頻度刺激からなる弱いテタヌスプロトコルを用いて、初期LTPを誘発させます。

もう一方の入力で、初期LTP誘導の30分後までベースラインの記録を継続している間に、10分のインタートレインインターバルを設けた繰り返し高頻度刺激を含む強力なテタヌスプロトコルを用いて、入力S2に後期LTPを誘導します。その後、電場EPSP応答を長時間にわたって記録し、シナプスタギングおよびキャプチャーによって入力S1の初期LTPが後期LTPへと変換される様子を確認します。同様に、クロスキャプチャー実験では、まず一方の入力に初期LTPを誘導し、その30分後に、15分間にわたる900バーストからなる強力な低頻度刺激プロトコルを用いて、もう一方の入力に後期LTDを誘導します。

次に、フィールドEPSP反応を長時間記録し、クロスキャプチャーによる入力S1の初期LTPから後期LTPへの転換を明らかにします。この構成では、独立しつつも重複する2つのシナプス入力を刺激するため、2本の刺激電極をCA1領域の放射状層（stratum radiatum）に配置します。また、CA1錐体ニューロンに対して2本の細胞外記録電極を配置します。

一つは頂端樹状突起コンパートメントからf-EPSPを記録するための電極であり、もう一つは放射状層（stratum radiatum）および傍細胞層（stratum pyramidale）にそれぞれ位置する錐体細胞体から体細胞集団スパイクを記録するための電極です。この図は、シナプスタギングおよびキャプチャを研究するためのweak-before-strongパラダイムを示しています。

早期LTPを誘発するためにS1に弱いテタヌス刺激を与え、続いて30分後に後期LTPを誘発するためにS2に強いテタヌス刺激を与えます。この図は、クロスタギングを研究するための「弱い刺激の後に強い刺激を与える」パラダイムを示しています。S1に弱いテタヌス刺激を与えることで早期LTPが誘発され、続いて強い低頻度刺激プロトコルを用いてS2に後期LTDを誘発させます。S1において30分後、早期LTPは6時間持続する後期LTPへと変換され、クロスタギングとキャプチャーが起こることが示されます。

この解剖およびスライス作製の技術を習得すれば、3〜5分という非常に短い時間で完了させることができます。これにより、長期的な記録に向けてスライスの生存率を維持することが可能です。また、本手法を用いることで、シナプスタギングおよびキャプチャープロセスに対するさまざまな薬理剤の影響を検証することもできます。

このビデオを視聴することで、長期的な機能的可塑性実験の実施方法、およびシナプス標識と捕捉のプロセスについて深く理解することができます。