Name: げっ歯類からの急性海馬スライスを用いて、シナプスタグ付け/キャプチャとクロス捕獲調査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 学ぶシナプスタグ付けとキャプチャのメカニズムをげっ歯類の急性海馬スライスを用いて。CA1錐体細胞での長期可塑性と記憶形成の関連プロセスを電気生理学的に解明する方法です。

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このビデオ記事はCerebos Pacific Limitedがスポンサーです。この研究は、National Medical Research Council Collaborative Research Grant (NMRC-CBRG-0041/2013) とMinistry of Education Academic Research Fund (MOE AcRF- Tier 1 - T1-2012 Oct -02) の支援を受けています。

すべての動物の手順は、シンガポール国立大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。 人工脳脊髄液の1.準備（ACSF） <ol><li> 、124のNaCl、3.7塩化カリウム（MM）でのMgSO 4・7H 2 O 1.0、2.5のCaCl 2・2H 2 OからなるACSF、1.2 KH 2 PO 4、24.6のNaHCO 3、および10 D-グルコースを準備します。解剖、スライス標本と電気生理学的記録の間の灌流のための両方のために、このACSF 95％O 2および5％CO 2混合物 （カーボゲン）。21を使用した、飽和に泡立てたときにACSFのpHは7.2から7.4の間であることを確認してください。 注：ACSFを測定し、保持するためのクリーンな装置を使用してください。汚れた装置を使用して、濁った溶液又は沈殿物の形成をもたらすことができます。すべての準備のために脱イオン水を使用してください。 </li><li> NaHCO 3を除いた2リットルの10倍のACSFの株式を準備</sUB&gt;とメスフラスコ中のD-グルコース。塩化ナトリウム（144.96グラム）、塩化カリウム（5.52グラム） し 、MgSO 4・7H 2 0（4.92グラム）、塩化カルシウム2・2H 2 O（7.56グラム）、KH 2 PO 4（3.28：次の順序で脱イオン水に試薬を追加2 Lの容積にグラム）とトップアップは、すべての試薬が溶解していることを確認するために、磁気撹拌機を用いて少なくとも30分間連続して攪拌します。 4°Cの中で株式を保存し、2週間以内に使用します。 </li><li>解剖や実験に先立ち、NaHCO 3およびD-グルコースの必要量を加えて一緒にメスフラスコにACSFの株式を希釈します。 1 L溶液は、2.07グラムのNaHCO 3および1.802グラムのD-グルコースを添加した後、1Lに株式の100ミリリットルを希釈。 ACSFは、沈殿物や未溶解粒子を含まない透明な溶液にする必要があります。 </li><li>クール200〜300 mlの氷のACSFの、解剖時に使用されます。解剖のために使用ACSFは2-4℃の間であることを確認してください。 electropの残りのACSFを使用しますhysiological実験。バブルすべてACSF溶液を連続的にカルボゲン（5％CO 2、95％O 2）で飽和します。 ACSFを冷却するために待っている間、解剖領域とスライス室を準備します。 </li></ol>インターフェイス商工会議所の調製注：スライスをインキュベートし、電気生理学的記録（ 図2B）の間にそれらを維持するために使用されるインターフェース脳切片室は、2つの区画で構成されています。下部チャンバは、温度制御装置により32℃に維持した水を蒸留し、連続的にカルボゲンを通気含ま。 <ol><li>温度コントローラに切り替え、32℃で、それをプリセット。流入管を通して蒸留水を実行して、10〜15分間、上部チャンバーを洗浄します。上室は、ネットを配置する前にクリーンであることを確認してください。下部チャンバー内の水位が蒸留水で満たされた約70％であることを確認してください。 </li><li>置きスライス（ 図2C）のための休息面を提供するために、上部チャンバーの純。ソリューションレベルは十分にネットの全領域を湿潤されることを保証するために流出チューブを調整します。上部チャンバー内の加湿カルボゲン雰囲気を維持するためにネット上に蓋を置きます。 </li><li> 1ml /分の流量を調整します。スライスのインキュベーション期間および実験を通して、この流量を維持します。新たに調製した1×ACSFをcarbogenating起動し、ACSFに流入チューブを浸します。 ACSFのための20分は、カルボゲンで、それに充填する上部チャンバーのために飽和させることができるようにします。 </li></ol>急性海馬スライスの調製注：解剖プロトコルは冷たいACSFに動物由来の脳の（1）の取り外しと（2）の単離および海馬のスライスで構成されています。ニューロンは、生存したままで分離し、すぐに冷たいACSFで脳を配置し、全体を完了するために、3-5分以内にスライスを含むプロセス。 <ol><li>風邪ACSFに脳の除去<ol><li> 図1（a）に示すようにして解剖ツールをレイアウト。解剖プロセスを促進するための使用のために応じてツールを配置します。開始する前に、すべての解剖ツールは準備ができていることを確認します。 </li><li>しっかりと固定し、カッティングエッジが均一に整列されていることを確認し、手動組織チョッパー（ 図1B）に、酢酸エチル、無水エタノール及び蒸留水で洗浄カミソリの刃を、マウントします。テストブレードがしっかりと固定されていることを保証するために、フィルター紙を細断。その開始位置にスライドバーニアマイクロメータを設定します。 </li><li>誘導室中の二酸化炭素（CO 2）を用いて動物を安楽死させると、包帯はさみやギロチンで首を切ります。アイリスのはさみを使用して、頭蓋骨上の皮膚や被毛を削除します。 brainstem.Makeに目に沿って小さな切開を除去するために、後部を切断してください頭蓋骨の右側と左側に長い切開を電子。 注意！それの損傷を防ぐために、実験のために使用された側にのみ小さな切開を行います。はさみを挿入する場合、適用される力は、脳への損傷を避けるために上向きであることを確認してください。 </li><li>慎重に皮質を明らかにするために頭蓋骨の右側に左から骨鉗子骨と頭蓋骨を削除します。硬膜の薄い層は、見ることができます。慎重に骨鉗子と正面プレートを取り外します。正面プレートと一緒に硬膜の大部分を削除します。 注意！硬膜は脳組織をスライスしないように注意してください。 </li><li>特にへらの平坦な端部と皮質と小脳の間の接合部に、もしあれば、残りの硬膜を削除します。ステップ3.1.5と3.1.6の場合は、それを損傷しないように離れて脳から、上向きすなわち圧力を維持します。へらを使用して、静かに冷たいで満たされたペトリ皿に脳をスクープし、ACSF（2-4°C）をcarbogenated、ナンプラーアルミ冷却ブロック上をced。 </li></ol></li><li>海馬の単離<ol><li>メスを用いて、脳（約1/4）の前方部分を削除するには、小脳、別のカットを削除するには、ストレートカットを行います。正中線に沿って浅いカットを行います。 </li><li>慎重に背側海馬を明らかに正中線から開始し、鎌スケーラーと皮質を除去します。海馬上記の皮質の層を削除します。脳をサポートするために、指や角度のついたピンセットを使用してください。海馬交連に小さなカットを行います。なだらかな動きを使用して、背側海馬から始まる鎌スケーラーで海馬を削除します。 注意！ストレッチや海馬を引き裂く避けるために穏やかなこと。 </li><li>鎌スケーラーで分離された海馬の周りの任意の皮質および結合組織を除去します。 </li></ol></li><li>海馬組織をスライスし、インターフェースチャンバー上にスライスを転送します<ol><li> ACSF-の作品を配置します手動スライサーのスライスステージ上浸したろ紙（グレード1、30ミリメートル）。スクープとろ紙上に海馬組織を配置します。海馬は采に約70 Oの角度でスライスされるように、スライサーの刃との関係で適切な方向で海馬を整列させるためにろ紙を移動します。 </li><li>少し湿った海馬を残して折り畳まれたろ紙（グレード1、85ミリメートル）と海馬組織を囲む余分な溶液を吸い取ります。横方向に海馬スライス開始します。スライスとスライス形態は明らかではない海馬の先端から組織を捨てること。 </li><li>厚さ400μmのスライスに残りの組織をスライス。穏やかなスワイプの動きを用いたソフト剛毛ブラシでブレードから優しく海馬スライスをピックアップし、冷たいcarbogenated ACSFで満たされた小さなビーカーにスライスを配置します。手順を実行し3.3.1-3.3.3、可能な限り迅速に海馬組織が空気に露出しているため。 注意：一般的に海馬の3分の2がスライスされて、明確な形態​​を有する4~6切片を調製することができます。 </li><li> （先端2〜3センチ離れて切断することによって作られた）幅広い先端で清潔なプラス​​チック製パスツールピペットを用いて、スライス室で静かにネット上にスライスを転送します。慎重に曲がった先端で小さな注射器を使用してネット上のスライスの位置を調整します。電極の位置と記録を容易にするようにスライスを配置します。スライスが十分にACSFに囲まれているが、水没または浮動（ 図2C-D）されていないことを確認します。チャンバーをカバーし、2〜3時間のスライスをインキュベートします。 注：健康スライスにおける錐体細胞層は、いくつかの透明性を示すべきです。 </li></ol></li></ol> 4.録音CA3-CA1シナプスの応答注：フィールドの潜在的な記録のために使用される電気のセットアップは 、図2Aに示されています。ファーラ電気的干渉は、電気の設定を適切に接地した後に制御を超えている場合はその日のケージを強くお勧めします。沈め、インターフェース室の多くの異なる種類が市販されています。しかし、インターフェース室は、その中のスライスを呈する、より堅牢なシナプス応答として好ましいです。 <ol><li>電極の位置決め<ol><li>使用する電気機器（刺激剤およびア​​ンプ）の電源を入れます。マウントとマイクロマニピュレーターのプレキシガラスホルダーに刺激と記録電極を固定します。 注：我々は両方の刺激と記録の目的のために5MΩ抵抗の単極、ラッカーでコーティングされた、ステンレス製の電極を使用しています。 </li><li>使用前に、引っ張らガラスキャピラリーの内部でこれらの電極を挿入し、電極先端部（ 図2E）のほんの一部を露出するエポキシ接着剤で固定します。これは、そうでない場合は細い電極に強度を与え、しっかりとELEでそれらを確保するのに役立ちますctrodeホルダー。 </li><li>顕微鏡下でガイド付き、フィールドEPSP（のfEPSP）応答を記録するために、シャファー側枝繊維とCA1の先端樹状領域での記録電極を刺激するためにCA1領域の放線層に刺激電極（複数可）を配置します。 注：電極とスライス上記液面へのアプローチは、すぐにスライス（提供、アンプがスピーカに接続されている）の表面を見つけるのに役立ちますサウンドを提供します。 </li><li>シナプスタグおよび捕捉の実験では、実験の必要性に応じて、記録電極の両側に位置二、三刺激電極（S1、S2またはS3）は、2つ以上の独立したが、重複入力を刺激します。離れて200ミクロン程度の刺激と記録電極を配置します。 </li><li>必要ならば、集合スパイク（ 図3A）を記録するための層の三角骨層内の他の記録電極を見つけ.When両方電極は適切なのfEPSP信号を確実にするために、テスト刺激を与え、取得ソフトウェアを使用して、スライスに触れています。 注：我々はテスト刺激のための二相性、定電流パルス（インパルス持続時間0.1ミリ秒/半波）を使用します。 </li><li>適切なのfEPSP信号が得られると、慎重に深いマニピュレータの微動ノブを使用して、200ミクロン程度の電極を下げます。スライスが回復するために20分を許可します。ペアのパルスの円滑プロトコル27,28と経路独立性をテストします。 </li></ol></li><li>入出力関係<ol><li>現在の強度の範囲で傾斜値を測定することによって、入力ごとに入出力関係（のfEPSPのスロープ対求心性刺激）を決定します。 100μA〜20μAの間でこれを実行します。そして、最大のfEPSPの傾きの40％を取得するために、各入力のための刺激強度を設定します。実験を通じて、この一定に保ちます。 </li><li> 15〜20分後、ベースラインの記録を開始。 Fを監視この期間中に密接にEPSPスロープおよびスロープが設定値から10％以上変動し、新しいベースラインを起動した場合刺激強度をリセットします。録音先に進む前に、少なくとも30分または1時間安定したベースライン。 注：テストまたはベースライン刺激のために、私たちは5分ごとに与えられた0.2 Hzの二相性、定電流パルスの4スイープ（極性あたり0.1ミリ秒）を使用します。これら四つの応答の平均勾配は、その後、1リピートとして考えられています。信号は、差動増幅器によってフィルタリングされ、増幅され、アナログ - デジタル変換器を用いてデジタル化し、カスタムメイドのソフトウェアを使用してオンラインでモニターしました。 </li></ol></li><li> LTP / LTDの誘導刺激プロトコルを使用して 注：タンパク質合成の要件に基づいて、LTPとLTDの両方が早くも分類されていると後期LTP / LTD。その後半メンテナンスのため、後者が必要な翻訳および/ ​​または転写【レビュー4を参照してください ]。電気刺激パラダイムの様々なspecificallことができますyは、LTPとLTDの異なる形式を誘発します。 <ol><li> WTET：100ヘルツ、21二相性定電流パルス（相あたり0.2ミリ秒）。 </li><li> STET：1秒（100 Hz）で10分毎に（相あたり幅0.2ミリ秒パルス）のための100パルスの三つのバースト。 </li><li> 15分の期間にわたって900バースト。 1バーストは、50ミリ秒（20 Hz）との間間隔で3パルス（0.2ミリ幅）で構成されています。インターバースト間隔は1秒（パルス2700の総数）です。 </li></ol></li></ol>スライス室と灌流システムの5.洗浄<ol><li>録音が終わった後、さらに生化学的解析のために海馬スライスを収集したり、他の適切に廃棄します。カーボゲンの電源電圧および温度コントローラの電源を切ります。蒸留水にカーボゲンバブラーを洗ってください。 </li><li>ブラシと蒸留水で徹底的にネットを清掃してください。高い流量で蒸留水で15〜20分間リグを洗ってください。 3-4日に1回、蒸留水を変更また、下部チャンバの区画と真菌の増殖を避けるために、3％過酸化水素溶液で定期的にチャンバを洗浄。 </li></ol>

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</ol>

このビデオの記事のためのオープンアクセスがCerebosパシフィック・リミテッドが主催しています。

急性海馬スライスは、LTPや、STC、クロスキャプチャなどの他の機能的可塑性のプロセスの研究のための優れたモデル系です。それは、海馬の回路の層構造のネットワークの多くを保存し、正確な電極位置を可能にし、血液脳関門なし、と並んで迅速な神経薬理学的操作のためのオープンプラットフォームを提供しています。 この記事では、若い成体ラットから実行可能な急性海馬スライスの調製のための方法論を説明し、STCとクロスタグ付けを調査するためにそれらを使用。これまでの研究は、性別や動物の年齢は電気生理学的研究で使用するために考慮すべき重要な因子であることを強調している。完全に表現成人受容体の機能（5-7週齢のWistar系雄性ラット）で27,28したがって、若い成体動物が使用されている。23非対称性左右の海馬との間の接続にげっ歯類29で指摘されており、NMDA受容体の発現に大きな違いがよく34として報告されています。私たちは以前のLTPの研究と一致するために、右海馬を使用している。23,32しかしながら、海馬のいずれかがあれば、整合性が維持されているとして使用することができます。 任意のプロトコルのように、それは、単離および組織が、伸び損傷し、乾燥または低酸素レンダリングされませんすぐに手続きをスライスするが世話を行うことが非常に重要です。 pH、温度および溶液のイオン組成の変化はスライスし、結果の実行可能性に大きな影響を持つことができます。したがって、このような変動は、避けるべきです。これは、製造工程中に発生するグルタミン酸受容体依存性カルシウム放出の不可逆的神経組織35,36、37でタンパク質合成に影響を与えることができることが観察されました。マニュアル組織スライサーを使用すると、VIと比較して非常に迅速に完了するためのプロセスを可能にすることにより、これを最小化するのを助けることができますbraslicers。しかし、多くの研究室にも効果的にスライスの生存率を維持するために必要な予防措置をvibraslicersを使用しています。考慮すべきもう一つの重要な要因は、実験を開始する前に、長い潜伏期間です。これは準備23時に発生する擾乱後のスライスにおける代謝状態およびキナーゼ活性化レベルの安定性を達成するために本当に重要であることが指摘されています。このような安定性は、長期的な録音の一貫性のために必要です。私たちは、この観察に再強調し、約3時間の長いインキュベーション時間を示唆しています。 刺激パラメータの様々なLTPを誘導することが知られているが、それぞれの場合に誘発される分子機構は（総説については38を参照）と同じでなくてもよいです。これは、順番に、シナプスタグおよび捕捉の実験の結果に影響を与えることができ、耐久性およびLTPの他の特性に影響を与えることができます。したがって、それは、刺激パラダイムと特性を検証することが重要です行う実験室の条件の下で誘発LTPのと一貫性を維持します。 我々は一般的に非常に大きなシナプス前繊維ボレーであり、最大0.5 mVの未満fEPSPsと録音も拒否されている間に繊維ボレーの大幅な変更を伴う実験で実験を考慮していません。さらに、二経路または三経路実験を実行しながら、その経路の独立性を確保することが重要です。これは、対のパルスの円滑プロトコル28を用いて行うことができます。 インターフェイス記録システムの一つの欠点は、チャンバーと周囲との温度と湿度の違いによる長時間録画時間中に電極上に凝縮液滴の形成です。これらの液滴は、慎重に時間から時間にブロットする必要があります。そうしないと液滴はスライス上に滴下し、乱れや信号のさえ喪失を引き起こす可能性があります。我々は通常、このBに取り組みますyが巧み電極に触れることなく、細い濾紙芯を用いて顕微鏡下で導かれた液滴をブロッティング。しかし、最善の解決策は、エジンバラ大学の研究者によって開発されたETCシステムとして、集中型の加熱システムを使用することです。 結びのノートでは、様々な方法論は、異なる実験の目的のために海馬スライスの調製のために使用され、世界中の研究室に存在します。手順のそれぞれは、他の上にいくつかの利点を提供しています。一つ注意深く実験の目的に適合するように、プロトコルの微細な詳細を最適化する必要があります。この記事は、STCやクロスキャプチャなど後期連想プロセスを研究するための方法論のいくつかの側面を改善するのに役立つことを願っています。

脳内の情報の符号化と保存は、神経科学において依然として最も重要で、熱心に追求されている課題です。長年にわたり、長期増強(LTP)と長期うつ病(LTD)は、記憶1,2の主要な細胞相関として浮上してきました。これらの活動依存的な変化は、入力特異性と結合性を示し、ニューロンネットワーク1,3,4の記憶トレースの安定化をもたらす。シナプス可塑性の2つの形態の維持には、可塑性関連製品(PRP)の合成が必要です5-10。新たに合成されたタンパク質と、LTPまたはLTDを発現する特定の活性化シナプスとの相互作用のみを含むシナプスの特異性は、記憶にとって重要です。この特異性は、PRPが最近活性化された「タグ付き」シナプス11,12と相互作用する'Synaptic Tagging and Capture'(STC)の概念によって説明される。STCプロセスは、細胞レベルでの記憶の連想特性のフレームワークを提供します。それは、短期的な可塑性の形態が、結合的かつ時間依存的な方法で、どのように長期的な形態の可塑性に変換されるかという概念的基礎を我々に与えてくれる13。
STCのプロセス中に、一つの入力における強い破傷的変化がタンパク質合成依存性の後期LTPへと導かれる結果となり、その結果、同じニューロン集団への別の独立した入力で誘導されたタンパク質合成非依存の早期LTPが持続的なものへと強化されます13。一過性の神経活動による局所シナプスタグの設定と、強い神経活動による拡散性PRPの合成は、STC13,14の2つの重要なイベントです。最近増強された「タグ付き」シナプスによるPRPの捕捉は、長期的な増強の維持の基本です。STC現象15-17の存在を確認し、候補の「タグ」18および「PRPs」19を特定するために、多くの研究が行われてきた。カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMKII)および細胞外シグナル調節キナーゼ1/2(ERK1/2);CaMKIV、プロテインキナーゼM(PKM)、脳由来神経栄養因子(BDNF)は、それぞれ「タグ」および「PRP」の候補分子の一部です19-21。シナプスタグ付けモデルはさらに拡張され、LTPとLTDの間の正の連想相互作用、つまり「シナプスクロスタグ」22が含まれるようになりました。シナプスクロスタグでは、一方のシナプス入力における後期LTP/LTDは、独立したインプットにおける反対のタンパク質合成非依存性早期LTD/LTPをその長期持続型に、またはその逆に変換する22。
海馬スライス調製は、長期シナプス可塑性の研究において最も広く使用されているモデルです23,24。シナプスタグ付けとクロスタグの概念に関する理解の多くは、海馬のCA1領域で行われた研究から生じており、技術的な複雑さのために、多くの研究室はまだこれらのプロセスを研究することができません。ラット海馬スライスの調製および安定した後期LTP/LTDの長時間の記録のための実験条件は、シナプスタグ付け/クロスタグを研究するために極めて重要である23,25,26。この記事では、ラットの急性海馬スライスからの安定した長期電界電位記録を使用して、CA1錐体ニューロンのSTCやクロスタギングなどの長期可塑性プロセスを研究するための詳細な実験手順について説明します。

<table><tbody><tr><td>I. 解剖ツール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.包帯はさみ</td><td>KLSマーティン、ドイツ</td><td>21-195-23-07</td><td></td></tr><tr><td></td><td>B-Braun / Aesculap、ドイツ</td><td>LX553R</td><td></td></tr><tr><td>2。アイリスはさみ</td><td>B-ブラウン/Aesculap、ドイツ</td><td>BC140R、</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>BC100R</td><td></td></tr><tr><td>3。ボーンロンジャー</td><td>World Precision Instruments (WPI), Germany</td><td>14089-G</td><td></td></tr><tr><td>4.Scalpel</td><td>World Precision Instruments(WPI)、ドイツ。</td><td>500236-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>B-ブラウン/Aesculap、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>BB73</td><td></td></tr><tr><td>5.メスの刃#11</td><td>B-Braun/Aesculap, Germany</td><td>BB511</td><td></td></tr><tr><td>6.鎌型スケーラー</td><td>KLS マーティン、ドイツ</td><td>38-685-00</td><td></td></tr><tr><td>7.角度付き鉗子</td><td>B-ブラウン/Aesculap、ドイツ</td><td>BD321R</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8。麻酔/導入チャンバー</td><td>MIP Anesthesia Technologies (現, Patterson Scientific), Oregon</td><td>AS-01-0530-LG</td><td></td></tr><tr><td>II.ACSFコンポーネントケミカル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>2.塩化カリウム(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>3.硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4.7H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>4.塩化カルシウム二水和物(CaCl2.2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>5.リン酸カリウム一塩基性(KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>6.重炭酸ナトリウム(NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>7.D-グルコース無水(C6H12O6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>III.電気生理学機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.顕微鏡</td>オ<td>リンパス、日本</td><td>モデルSZ61</td><td></td></tr><tr><td>2。Temperature Controller</td><td>Scientific Systems Design, Inc., カナダ</td>, <td>PTC03</td><td></td></tr>, <tr><td>3.差動ACアンプ</td><td>AMシステム、米国</td><td>モデル1700</td><td></td></tr><tr><td>4。絶縁パルス刺激装置</td><td>AMシステム、米国</td><td>モデル2100</td><td></td></tr><tr><td>5.オシロスコープ</td><td>ロード &シュヴァルツ</td><td>HM0722</td><td></td></tr><tr><td>6.デジタル-アナログコンバータ</td><td>ケンブリッジエレクトロニックデザイン株式会社 ケンブリッジ、英国</td><td>CED-Power 1401-3</td><td></td></tr><tr><td>7.インターフェース、ブレインスライスチャンバー</td>、<td>サイエンティフィックシステムデザイン社、カナダ</td><td>、BSC01</td><td></td></tr>、<tr><td>8。チューブポンプ</td><td>Ismatec、Idex Health &科学、ドイツ</td><td>REGLO-アナログ</td><td></td></tr><tr><td>9。Carbogenの流量計</td><td>Cole-Parmer</td><td>03220-44</td><td></td></tr><tr><td>10.ファイバーライトイルミネーター</td><td>ドラン・ジェンナー・インダストリー</td><td>ズ ファイバーライト MI-150</td><td></td></tr><tr><td>11.マイクロマニピュレーター</td><td>Marzhauser Wetzlar, Germany</td><td>00-42-101-0000 (MM-33)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>00-42-102-0000 (MM-32)</td><td></td></tr></tbody></table>

げっ歯類からの急性海馬スライスを用いて、シナプスタグ付け/キャプチャとクロス捕獲調査

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

シナプスのタグ付けと捕捉(STC)とクロスタギングは、特定の時間枠内でニューロンでシナプスの特異性と結合性がどのように達成されるかを説明する細胞レベルでの2つの重要なメカニズムです。これらの長期的な可塑性に関連するプロセスは、細胞レベルでの記憶形成と持続性の基礎を研究するための主要な候補モデルです。STCとクロスタグには、(1)特定の刺激パターンによって引き起こされるシナプスタグの設定、および(2)シナプスタグが新たに合成された可塑性関連タンパク質(PRP)と相互作用するシナプスキャプチャの2つの連続プロセスが含まれます。STCとクロスタギングの概念に関する理解の多くは、海馬のCA1領域で行われた研究から生じており、技術的な複雑さのために、多くの研究室はまだこれらのプロセスを研究できていません。海馬スライスの調製と安定した後期LTP/LTDの記録のための実験条件は、シナプスタグ付け/クロスタグを研究するために非常に重要です。このビデオ記事では、ラットの急性海馬スライスからの安定した長期電界電位記録を使用して、CA1錐体ニューロンのSTCやクロスタギングなどの長期可塑性プロセスを研究するための実験的手順について説明します。

記載された方法は、LTP / LTDなどのシナプスタグ付けおよび成体ラットの急性海馬スライスからのクロスキャプチャとしての連想相互作用の長期的なフォームを研究するために使用されている。23この技術は、両方のラット（Wistar系）を用いた実験のために有効であることが分かっていますマウスの様々な30,31を株。方法論は、最大8〜12時間の安定したLTP記録のために正常に使用されています。32 早期LTPの;（ 図3B、黒丸 S2）、それによって形質転換しそうでなければ減衰形（1入力（S1）の弱い強直誘発によって設定された「タグ」は、「PRPの「別の独立しているが、重複入力の強い強直誘発により誘導されるをキャプチャ長期的な1（ 図3B、白丸）にS1で-LTP）（WTETによって誘発される早期LTPの比較については20,33を参照してください ）。弱いによって捕獲のPRP強直誘発セットタグは必ずしもイキによって誘発される後期LTPから来る必要はなく、またSLFSによって誘発される後期株式会社によって提供することができます。 LTPとLTDとの間に正の連想このタイプの相互作用は、「クロスタグ付け/キャプチャ」と呼ばれています。 S1でWTET誘発性の早期LTPはS2でSLFSによって誘発される後期株式会社が提供するのPRP（ 図3C、黒丸）を捕捉することにより後期LTP（ 図3C、白丸）に強化されます。自身のベースラインと比較した場合に統計的に有意な増強またはくぼみは、両方の場合において、S1及びS2に維持された（ウィルコクソン検定、P &lt;0.05）。 が発生するタグ-PRPの相互作用のために、2つのイベント（弱前強い/強い・ビフォア・弱）の時間的順序は、二つのイベント間の時間ウィンドウは30〜60の範囲内にある限り、重要ではありません分。それはでは、第3の独立しているが、重複シナプスを含めることが賢明だろう入れて、レコーディングの安定性を監視するために、ベースラインコントロールとして使用します。 LTP / LTDの早期及び後期のフォームを誘導するために使用される電気刺激プロトコルは、STCの実験で使用する前に、一貫性と信頼性のための単一入力の実験で検証する必要があります。また、これらの実験の成功は、スライスの品質に大きく依存しているため、プロトコルに記載スライス標本の方法論の重要性を強調したいと思います。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig1.jpg" /> 海馬の解剖に使用される図1（A）ツール：（a）は、包帯はさみ（b）のアイリスはさみ（C）骨骨鉗子（d）の薄いヘラ、ソフト（E）スカルペル番号11（F）鎌状スケーラー（G）シャーレやビーカーに合わせて-bristleペイントブラシ（H）プラスチックパスツールピペット（I）ろ紙（85ミリメートル）（J）ろ紙（30ミリメートル）（k）のガラスビーカー（L）アルミ冷却ブロック（m）をペトリ皿。（B）手動組織チョッパー。 （a）は、プラットフォーム（b）は、ブレードホルダー（C）バーニアマイクロメートル、解像度10ミクロンで腕を切断。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig2.jpg" /> 図2電気生理学セットアップ（A）刺激剤からなるフィールドポテンシャルの記録のための（b）は、差動増幅器（c）は、アナログ-デジタル変換器（D）オシロスコープ（E）取得ソフトウェア（F）を有するコンピュータVibration-耐性テーブルトップ（G）&gt; 4倍の倍率（H）インターフェイス脳スライスチャンバー（I）ACSFとカーボゲン供給のための潅流システム（J）温度コントローラ（k）は、照明源（L）電極ホルダーとマニピュレータと顕微鏡。 （B）インタフェース脳スライスガラスキャピラリーに封入されたインターフェースチャンバー内のチャンバー。（C）＆（D）海馬スライス。（E）ステンレス鋼電極 ​​。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig3.jpg" /> 図3（A）フィールド電位記録用横断海馬スライスと電極位置の略図：この表現では、二つの刺激電極（S1及びS2）を刺激するためにCA1領域の放線状層中に配置された2つの独立したが、重複CA1錐体ニューロンへのシナプス入力。 2つの細胞外記録電極、頂端樹状コンパートメントからレコードフィールドEPSP（興奮シナプス後電位）に1と錐体細胞から体細胞集団のスパイクを記録するために別の体は、それぞれ放線層と層の三角骨に配置されています。 CA1-アンモン角領域1、CA3-アンモン角領域3、DG-歯状回、SC-シャファー側枝繊維、S1-刺激電極1、S2刺激電極2（B）弱いSTCを研究するための強力なパラダイムの前に：弱い強直誘発（WTET）は後期LTPを誘導するために30分でS2（黒丸）の強力な強直誘発（STET）に続く早期LTPを誘導するためのS1（白丸）に適用されます。 S1で初期LTPはタグ付けを示す後期LTPに強化され、クロスタグを研究するための強力なパラダイムの前に（N = 6）（C）弱相互作用をキャプチャします：早期LTPが続くS1（白丸）にWTETによって誘導されます30分後にSLFSを使用してS2の後半-LTDの誘導（黒丸）によります。 S1では、初期LTPは、クロスタグとキャプチャを示す6時間持続する後期LTPに変換された（n = 6）。シングル矢印は早期LTPを誘導するために適用される弱い強直誘発を表します。矢印のトリプレットを表します後期LTPを誘導するための強力な強直誘発。破線矢印はSLFSは後期LTDを誘導するための代表的なシナプスの入力に印加された時点を表します。エラーバーはSEMを示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

このビデオ記事は、げっ歯類の急性海馬切片を使用したCA1錐体ニューロンのシナプスタグ付け、捕捉、交差タグ付けなど、長期的な可塑性とそれに関連するプロセスを研究するための実験的手順について説明しています。

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

本手順の総合的な目的は、げっ歯類由来の海馬スライスを用いて、CA1錐体ニューロンにおける長期可塑性と、シナプスタギング、キャプチャー、クロスタギングなどの連合プロセスを研究することである。まず、脳を解剖し、低温で酸素供給された人工脳脊髄液中に海馬を迅速に分離する。次に、手動組織スライサーを用いて急性海馬スライスを作製し、インターフェースチャンバー内でインキュベートする。次に、2本の刺激電極と2本の記録電極をCA1領域に配置し、2つのシナプス入力からのフィールドEPSPおよびポピュレーションスパイク応答を記録します。最後のステップは、特定の時間窓内で、一方のシナプス入力に一過性の可塑性を、もう一方の入力に持続性の可塑性を誘導することです。最終的に、両方の入力からのフィールドEPSP応答を長時間にわたって記録し、シナプスタギングおよびキャプチャ、ならびにクロスカプチャのメカニズムを調査します。シナプス標識と捕捉（Synaptic tagging and capture）は、特定の時間枠内で短期記憶がどのように長期記憶へと変換されるかという概念的な基礎を提供します。この手法の実験手順は、複数のシナプス入力からの刺激と記録を伴うため習得が困難であり、視覚的な実演が極めて重要です。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるMahesh Shira、machete、およびmaima Sharmaが行います。この手順を開始するために、A CSFを準備し、95% oxygenと5% carbon dioxideでバブリングします。インターフェースチャンバーの底に、容量の約70%まで蒸留水を満たします。その後、32 °Cに設定された温度コントローラーの電源を入れます。次に、流入チューブから蒸留水を高流量で流し、上部チャンバーを10～15分間洗浄した後、A CSFを1 mL/minの流量で流します。その後、スライスの静置面とするためにネットを上部チャンバーに設置します。下部チャンバーへのカーボゲン供給を開始し、流入チューブを継続的にカーボゲン処理されたA CSFに浸します。A CSFにカーボゲンを飽和させ、上部チャンバーを満たすまで20分間放置します。このステップで、ティッシュチョッパーにカミソリの刃を取り付け、切断端が均等に揃っていることを確認します。小さなろ紙を切断してテストし、刃がしっかりと固定されていることを確認してください。次に、スライディングバーニヤマイクロメーターを開始位置に設定します。安楽死させたラットの頭部を用意し、アイリス剪刀を用いて後頭蓋骨を切断し、脳幹を除去します。その後、頭蓋骨の右側に小さな切開を、左側にそれより長い切開を加えます。ボーンURを用い、頭蓋骨の左側から右側に向かって慎重に除去します。皮質およびそれを覆う薄い硬膜を露出させるため、細いスパチュラで硬膜を慎重に取り除き、その後ボーンRoで前頭骨板を除去します。続いて、皮質と小脳の接合部にある残りの硬膜をスパチュラの平坦な端で取り除きます。この際、圧力を上向きに維持し、脳を損傷しないように注意してください。スパチュラを用いて、冷やした炭酸飽和A CSFを満たしたアルミ冷却ブロック上のペトリ皿に脳をそっと移します。11番メスを用いて海馬を単離させるため、直線的に切開して小脳を除去し、さらにもう一度切開して脳の前方部分の4分の1を除去します。その後、正中線に沿って浅い矢状切開を行います。正中線から開始します。シックルスケーラーを用いて皮質を慎重に取り除き、背側海馬を露出させます。その後、海馬の上にある皮質層を取り除きます。海馬交連に小さな切れ込みを入れます。シックルスケーラーを用い、背側端から転がすようにして海馬を慎重に摘出します。続いて、摘出した海馬の周囲にある皮質および結合組織を、シックルスケーラーの湾曲した端を用いて除去します。海馬組織をスライスするために、CSFに浸した30 millimeterのワトマンろ紙を、手動スライサーのスライシングステージ上に配置します。海馬組織をろ紙の上に移動させます。鎌状メスの平らな端を使用して、ろ紙を動かし、スライサーの刃に対して海馬を適切な方向に向けて配置します。これにより、海馬がfiaに対して約70度の角度で切断されるようにします。次に、海馬組織の周囲にある余分な溶液を吸い取ります。折りたたんだろ紙を用いて、海馬を横断的にスライスし、スライスの形態が不明瞭な海馬の極端な端の部分の組織は廃棄します。次に、1回スライスするごとにバーニヤマイクロメーターを調整し、残りの組織を 400 micron の厚さでスライスします。カット後、柔らかい毛のブラシを使用して、スライスをブレードから冷えた炭酸ガス含有 A CSF が入った小型ビーカーへ慎重に移動させます。次に、清潔なプラスチック製パスピペットを用いて、スライスをスライスチャンバー内のネット上にそっと移動させます。太いチップを使い、電極の配置と記録確認が容易になるようにスライスの位置を慎重に調整し、スライスがA CSFの層に十分に囲まれているが、完全に浸かっていない状態であることを確認します。その後、チャンバーに蓋をし、シナプス tagging and capture 実験ではスライスを2〜3時間インキュベートします。顕微鏡下で、Schaffer側枝を刺激するために2本の刺激電極をCA1領域のstratum radiatumに配置し、記録電極を刺激電極の中間にあるCA1の頂端樹状突起領域に配置します。fEPSP応答を記録するには、ポピュレーションスパイクを記録するために別の記録電極をstratum pyramidale層に配置してください。すべての電極がスライスに接触したら、テスト刺激を与え、両方の入力で適切なフィールドEPSP信号が得られるか確認します。適切なf-EPSP信号が得られたら、マニピュレーターの微動ノブを使用して、電極をさらに約200 µm慎重に下げます。その後、スライスを回復させるために20分間待ちます。その後、20 µAから100 µAまでの範囲の電流強度でフィールドEPSPの傾きを測定し、入出力関係を決定します。次に、各入力について、最大フィールドEPSP傾きの40%を誘発する刺激強度を、実験全体の一定刺激として設定します。15～20分後、ベースラインの記録を開始し、一方の入力におけるLTP/LTD誘発前に、少なくとも30～60分間の安定したベースラインを記録します。その後、単一の高頻度刺激からなる弱いテタヌスプロトコルを用いて、初期LTPを誘発させます。もう一方の入力で、初期LTP誘導の30分後までベースラインの記録を継続している間に、10分のインタートレインインターバルを設けた繰り返し高頻度刺激を含む強力なテタヌスプロトコルを用いて、入力S2に後期LTPを誘導します。その後、電場EPSP応答を長時間にわたって記録し、シナプスタギングおよびキャプチャーによって入力S1の初期LTPが後期LTPへと変換される様子を確認します。同様に、クロスキャプチャー実験では、まず一方の入力に初期LTPを誘導し、その30分後に、15分間にわたる900バーストからなる強力な低頻度刺激プロトコルを用いて、もう一方の入力に後期LTDを誘導します。次に、フィールドEPSP反応を長時間記録し、クロスキャプチャーによる入力S1の初期LTPから後期LTPへの転換を明らかにします。この構成では、独立しつつも重複する2つのシナプス入力を刺激するため、2本の刺激電極をCA1領域の放射状層（stratum radiatum）に配置します。また、CA1錐体ニューロンに対して2本の細胞外記録電極を配置します。一つは頂端樹状突起コンパートメントからf-EPSPを記録するための電極であり、もう一つは放射状層（stratum radiatum）および傍細胞層（stratum pyramidale）にそれぞれ位置する錐体細胞体から体細胞集団スパイクを記録するための電極です。この図は、シナプスタギングおよびキャプチャを研究するためのweak-before-strongパラダイムを示しています。早期LTPを誘発するためにS1に弱いテタヌス刺激を与え、続いて30分後に後期LTPを誘発するためにS2に強いテタヌス刺激を与えます。この図は、クロスタギングを研究するための「弱い刺激の後に強い刺激を与える」パラダイムを示しています。S1に弱いテタヌス刺激を与えることで早期LTPが誘発され、続いて強い低頻度刺激プロトコルを用いてS2に後期LTDを誘発させます。S1において30分後、早期LTPは6時間持続する後期LTPへと変換され、クロスタギングとキャプチャーが起こることが示されます。この解剖およびスライス作製の技術を習得すれば、3〜5分という非常に短い時間で完了させることができます。これにより、長期的な記録に向けてスライスの生存率を維持することが可能です。また、本手法を用いることで、シナプスタギングおよびキャプチャープロセスに対するさまざまな薬理剤の影響を検証することもできます。このビデオを視聴することで、長期的な機能的可塑性実験の実施方法、およびシナプス標識と捕捉のプロセスについて深く理解することができます。

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