ラマンイメージングと多変量解析を組み合わせて、植物細胞壁のリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを視覚化する

この実験の全体的な目標は、ラマンイメージングと多変量解析により、植物細胞壁中のリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを視覚化する一般的な方法を提示することです。この方法は、主要な化学成分が植物細胞壁にどのように分布しているかなど、植物バイオマス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、最小限のサンプル調製で、サンプルに関する労力のかからない非破壊情報を取得できることです。

まず、植物サンプルから小さな組織ブロックを切り取ります。組織を沸騰した脱イオン水に30分間浸します。その後、直ちに室温で30分間脱イオン水に移します。

ティッシュが容器の底に沈み、ティッシュの空気が取り除かれ、ティッシュが柔らかくなったことを示すまで、この手順を繰り返します。PEGと脱イオン水、および純粋なPEGの20%50%70%および90%aliquotsを準備します。溶液を摂氏65度に保ちます。

一連の等級付けされたPEG浴で組織をインキュベートして水を置換し、PEGが浸潤するのを待ちます。20%PEGで1時間、50%PEGで1時間半、70%PEGで2時間、90%PEGで2時間、100%PEGで10時間乾燥させます。次に、カセットをオーブンで摂氏65度に予熱します。

PEGを含むティッシュブロックをカセットに注ぎ、予め温めたピンセットまたは針を使用してティッシュブロックを希望の位置に置きます。カセットをゆっくりと冷まし、使用するまでティッシュを室温で保管してください。鋭利なカミソリの刃を使用して、標的組織を含むPEGブロックを小さなブロックに解剖します。

小さなPEGブロックをミクロトームに取り付け、PEGブロックから薄い切片を切り取ります。次に、ウォッチクラスで切片を脱イオン水で10回すすぎ、組織からPEGを取り除きます。次に、切片をトルエンとエタノールで6時間浸して、抽出物を取り除きます。

ビーカーに脱イオン水65mL、酢酸0.5mL、塩化ナトリウム0.6gを混合して反応液を調製します。5 mLバイアルに1切片と3 mLの反応液を加えます。バイアルの上部にねじ込みます。

次に、バイアルを摂氏75度の水浴で2時間加熱して、組織のリグニンを取り除きます。切片を脱イオン水で時計のグラスで10回すすぎます。次に、未処理で脱木した切片をガラス顕微鏡スライドに移します。

ブラシや針を使ってセクションを慎重に広げます。余分な脱イオン水はティッシュペーパーで取り除きます。次に、切片を酸化重水素に浸します。

サンプルをガラスカバースリップで覆います。酸化重水素の蒸発を防ぐために、カバースリップをマニキュアで密封します。共焦点ラマン顕微鏡の装置操作ソフトウェアを開きます。

レーザーをオンにし、100倍の顕微鏡対物レンズで結晶とシリコンのサービスに焦点を当てます。キャリブレーションボタンをクリックして、機器をキャリブレーションします。装置を光学顕微鏡モードに切り替え、顕微鏡lをオンにしますlamp.

顕微鏡スライドをステージに取り付け、カバースリップを対物レンズに向けて取り付けます。20倍顕微鏡対物レンズでサンプルを観察し、対象領域を特定します。液浸顕微鏡対物レンズに切り替えます。

カバースリップに液浸油を塗布し、サンプルの表面に焦点を合わせます。次に、装置をラマンテストモードに切り替え、顕微鏡ランプをオフにします。長方形のツールを使用してマッピング領域を選択しました。

ステップ サイズを変更して、取得されるスペクトルの数を決定します。ステップサイズは、対物レンズの開口数によって計算されるスポット径よりも大きくする必要があることに注意してください。これより小さいサイズは、オーバーサンプリングになります。

最適なスペクトルパラメータを設定して、最適なS/N比とスペクトル品質を取得し、サンプルの適合性に応じて適切な取得時間を確保します。一般に、532ナノメートルのレーザー波長、100%のフィルター、300の穴、100のスリット、1840の逆センチメートルの分光計、1200Tの溝、60倍のオイル対物レンズ、および2秒の取得時間を使用して、機器ソフトウェアにイメージングパラメータを入力します。データ処理の前にスペクトルデータを保存し、テキストプロトコルで説明されているようにデータ分析に進む前にデータをユニバーサル形式に変換します。

ポプラ細胞壁の元のラマンスペクトルをここに示します。ベースラインドリフトとコズミックスパイクを含む2つの主要なノイズ信号は、実際の信号とともにチャネルに波及します。これらは、データ分析の前に削除する必要があります。

Savitzky-Golayアルゴリズムやウェーブレットアルゴリズムなどのノイズリダクション技術を適用して、これらのノイズ信号を除去することができます。リグニンイメージングでは、芳香環対称伸張振動による1600逆センチメートル付近のスペクトルピークを考慮してください。多糖類イメージングには、CHとCH2の伸びがあるため、逆センチメートル2889センチメートル付近のスペクトルピークを使用します。

ただし、セルロースとヘミセルロースのラマンイメージを直接生成することはできません。脱リグニンは、それらのスペクトル特性を明らかにするために必要な手順です。一般的に、私たちはこの方法に不慣れです。

サンプルセクショニングの取り扱いと外観、およびデータ分析のトレーニングが必要なため、苦労しています。このビデオを見れば、in-situ法を使用して植物細胞壁に関する化学情報を取得する方法について十分に理解できるはずです。この手順に続いて、植物細胞壁の難しさのような追加の質問に答えるために、化学的前処理のような他の方法を実行することができます。

この方法は、植物細胞壁の内部構造的性質とトポケミストリーについての洞察を提供することができますが、他の生物学的サンプルにも適用できます。