ラマンイメージングと多変量解析を組み合わせて、植物細胞壁のリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを視覚化する
June 10th, 2017
このプロトコルは、ラマンイメージングおよび多変量解析を用いて、植物細胞壁のリグニン、セルロースおよびヘミセルロースを視覚化するための一般的な方法を提示することを目的とする。
この実験の全体的な目標は、ラマンイメージングと多変量解析により、植物細胞壁中のリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを視覚化する一般的な方法を提示することです。この方法は、主要な化学成分が植物細胞壁にどのように分布しているかなど、植物バイオマス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、最小限のサンプル調製で、サンプルに関する労力のかからない非破壊情報を取得できることです。
まず、植物サンプルから小さな組織ブロックを切り取ります。組織を沸騰した脱イオン水に30分間浸します。その後、直ちに室温で30分間脱イオン水に移します。
ティッシュが容器の底に沈み、ティッシュの空気が取り除かれ、ティッシュが柔らかくなったことを示すまで、この手順を繰り返します。PEGと脱イオン水、および純粋なPEGの20%50%70%および90%aliquotsを準備します。溶液を摂氏65度に保ちます。
一連の等級付けされたPEG浴で組織をインキュベートして水を置換し、PEGが浸潤するのを待ちます。20%PEGで1時間、50%PEGで1時間半、70%PEGで2時間、90%PEGで2時間、100%PEGで10時間乾燥させます。次に、カセットをオーブンで摂氏65度に予熱します。
PEGを含むティッシュブロックをカセットに注ぎ、予め温めたピンセットまたは針を使用してティッシュブロックを希望の位置に置きます。カセットをゆっくりと冷まし、使用するまでティッシュを室温で保管してください。鋭利なカミソリの刃を使用して、標的組織を含むPEGブロックを小さなブロックに解剖します。
小さなPEGブロックをミクロトームに取り付け、PEGブロックから薄い切片を切り取ります。次に、ウォッチクラスで切片を脱イオン水で10回すすぎ、組織からPEGを取り除きます。次に、切片をトルエンとエタノールで6時間浸して、抽出物を取り除きます。
ビーカーに脱イオン水65mL、酢酸0.5mL、塩化ナトリウム0.6gを混合して反応液を調製します。5 mLバイアルに1切片と3 mLの反応液を加えます。バイアルの上部にねじ込みます。
次に、バイアルを摂氏75度の水浴で2時間加熱して、組織のリグニンを取り除きます。切片を脱イオン水で時計のグラスで10回すすぎます。次に、未処理で脱木した切片をガラス顕微鏡スライドに移します。
ブラシや針を使ってセクションを慎重に広げます。余分な脱イオン水はティッシュペーパーで取り除きます。次に、切片を酸化重水素に浸します。
サンプルをガラスカバースリップで覆います。酸化重水素の蒸発を防ぐために、カバースリップをマニキュアで密封します。共焦点ラマン顕微鏡の装置操作ソフトウェアを開きます。
レーザーをオンにし、100倍の顕微鏡対物レンズで結晶とシリコンのサービスに焦点を当てます。キャリブレーションボタンをクリックして、機器をキャリブレーションします。装置を光学顕微鏡モードに切り替え、顕微鏡lをオンにしますlamp.
顕微鏡スライドをステージに取り付け、カバースリップを対物レンズに向けて取り付けます。20倍顕微鏡対物レンズでサンプルを観察し、対象領域を特定します。液浸顕微鏡対物レンズに切り替えます。
カバースリップに液浸油を塗布し、サンプルの表面に焦点を合わせます。次に、装置をラマンテストモードに切り替え、顕微鏡ランプをオフにします。長方形のツールを使用してマッピング領域を選択しました。
ステップ サイズを変更して、取得されるスペクトルの数を決定します。ステップサイズは、対物レンズの開口数によって計算されるスポット径よりも大きくする必要があることに注意してください。これより小さいサイズは、オーバーサンプリングになります。
最適なスペクトルパラメータを設定して、最適なS/N比とスペクトル品質を取得し、サンプルの適合性に応じて適切な取得時間を確保します。一般に、532ナノメートルのレーザー波長、100%のフィルター、300の穴、100のスリット、1840の逆センチメートルの分光計、1200Tの溝、60倍のオイル対物レンズ、および2秒の取得時間を使用して、機器ソフトウェアにイメージングパラメータを入力します。データ処理の前にスペクトルデータを保存し、テキストプロトコルで説明されているようにデータ分析に進む前にデータをユニバーサル形式に変換します。
ポプラ細胞壁の元のラマンスペクトルをここに示します。ベースラインドリフトとコズミックスパイクを含む2つの主要なノイズ信号は、実際の信号とともにチャネルに波及します。これらは、データ分析の前に削除する必要があります。
Savitzky-Golayアルゴリズムやウェーブレットアルゴリズムなどのノイズリダクション技術を適用して、これらのノイズ信号を除去することができます。リグニンイメージングでは、芳香環対称伸張振動による1600逆センチメートル付近のスペクトルピークを考慮してください。多糖類イメージングには、CHとCH2の伸びがあるため、逆センチメートル2889センチメートル付近のスペクトルピークを使用します。
ただし、セルロースとヘミセルロースのラマンイメージを直接生成することはできません。脱リグニンは、それらのスペクトル特性を明らかにするために必要な手順です。一般的に、私たちはこの方法に不慣れです。
サンプルセクショニングの取り扱いと外観、およびデータ分析のトレーニングが必要なため、苦労しています。このビデオを見れば、in-situ法を使用して植物細胞壁に関する化学情報を取得する方法について十分に理解できるはずです。この手順に続いて、植物細胞壁の難しさのような追加の質問に答えるために、化学的前処理のような他の方法を実行することができます。
この方法は、植物細胞壁の内部構造的性質とトポケミストリーについての洞察を提供することができますが、他の生物学的サンプルにも適用できます。
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概要
このプロトコルは、ラマンイメージングと多変量解析を用いて植物細胞壁のリグニン、セルロース、ヘミセルロースを可視化する方法を提示します。この技術は、植物バイオマスの化学組成に関する非破壊的洞察を提供します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 植物生物学
- バイオマス研究
- 分析化学
背景
- 植物細胞壁組成の理解はバイオマス利用にとって重要です。
- ラマンイメージングにより植物組織の詳細な化学マッピングが可能になります。
- 多変量解析はイメージングからの複雑なデータの解釈を助けます。
- この方法はサンプル調製を最小限に抑え、非破壊的です。
研究目的
- 植物細胞壁の主要な化学成分の分布を可視化する。
- 植物バイオマスを分析する労力のかからない方法を提供する。
- 植物細胞壁の構造と組成の理解を深める。
使用した方法
- 植物サンプルから小さな組織ブロックを切り取る。
- 組織を沸騰した脱イオン水に30分間浸す。
- 組織を室温の脱イオン水に移し、30分間放置する。
- 可視化にラマンイメージングを、データ解釈に多変量解析を利用する。
主な結果
- リグニン、セルロース、ヘミセルロースの成功的な可視化。
- 細胞壁における化学成分の分布パターンの実証。
- 植物組織を分析する非破壊的方法の提供。
- 植物バイオマス応用におけるさらなる研究の促進。
結論
- この方法は植物細胞壁組成の研究に効果的です。
- ラマンイメージングと多変量解析の組み合わせは貴重な洞察を提供します。
- このアプローチは植物生物学とバイオマス利用の研究を進展させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables non-destructive, label-free visualization of lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls, supporting mechanistic de-risking in biomass conversion and bio-based material development. By providing spatially resolved chemical composition data, it aids in target validation for enzyme engineering and pretreatment optimization. The approach reduces reliance on destructive assays and enhances predictive confidence in early-stage biomass screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of plant cell wall architecture to inform hypotheses about biomass recalcitrance and enzyme accessibility.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating chemical distribution with enzymatic digestibility outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative spectral outputs that can be standardized for high-throughput screening of biomass variants.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through reproducible sample preparation and minimal operator-dependent variability after training.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by linking cell wall composition to phenotypic traits in biomass yield and processing efficiency.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical scaling by delivering consistent, label-free compositional data across sample sets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early biomass characterization and enabling data-driven decisions in enzyme and pretreatment development pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on structural barriers to biomass deconstruction through direct visualization of lignin-polysaccharide networks.
- Screening: Delivers assay-ready, spatially resolved chemical maps that allow comparison of genetic or treatment-induced changes in cell wall composition.
- Analytics: Generates multivariate outputs that quantify component distribution and co-localization, enabling objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by providing compositional benchmarks for assessing biomass suitability in biofuel or bioproduct pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform applicable across multiple biomass feedstocks and project stages.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity in biomass recalcitrance.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through defined spectral acquisition and data processing protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in biomass strain or pretreatment development by providing early compositional risk assessment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of biomass targets based on validated structural and compositional profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Raman spectroscopy, multivariate data analysis, and plant tissue handling.
- Dependent on access to confocal Raman microscopes with appropriate laser wavelengths and objectives.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation, sectioning, and data interpretation to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse plant species or tissue types with varying cell wall complexity.
- Limited by the need for delignification to resolve cellulose and hemicellulose signals, adding procedural steps and potential variability.
