化学のをクリックして、植物の木質化のダイナミクスを可視化する: 二重分類は至福である!

この二重標識法の全体的な目標は、植物組織の活発な木化ゾーンを観察することです。このワークフローでは、ケミカルレポーター戦略は、生体直交的なクリックケミストリー反応の順次の組み合わせで2つの異なるケミカルレポーターを使用して適用されます。この方法は、植物や壁内のリグニンの空間的または時間的な形成を調節する要因を特定するなど、植物生物学分野における重要な問題を解読するのに役立ちます。

この技術の主な利点は、代謝取り込み中に生成されるリグニンのみを標的とすることです。これにより、サンプル中の既存のリグニンと区別されます。もともとこの方法は木質化フラグを研究するために開発されましたが、シロイヌナズナ、ポプラ、またはリグニンを生成する他の植物などの他の種にも使用できます。

この手法を紹介するために、化学と生物学の界面で研究している博士課程の学生であり、この手法を使用して木化ダイナミクスを研究しているClemence Simon氏にお招きします。まず、アルキンタグ付きGレポーターのマイクロミュラー10個を含む300マイクロリットルの化学レポーター溶液を準備します。アジドタグ付きHレポーターと液体滅菌1/2MS培地のマイクロミュラー10個。

溶液をボルテックスし、トランスファーピペットで48ウェルプレートの1ウェルに移します。Gのマイクロミュラー10個とHのマイクロミュラー10個と液体滅菌1/2MS培地を含む300マイクロリットルのネガティブコントロール溶液を調製します。溶液をボルテックスし、同じ48ウェルプレートの2番目のウェルに移します。

きれいなカミソリの刃を使用して、生後2か月の亜麻の茎を土壌レベルから10センチメートルの高さで切ります。カミソリの刃を使用して、ステムのフリーハンド横断面を50個入念に準備し、すぐに1/2MS培地に入れます。次に、無傷の断面全体を選択し、組織を傷つけないように注意しながら、ケミカルレポーター溶液で満たされたウェルに10個をランダムに分配します。

断面はしっかりときれいにカットする必要があり、断面はまっすぐでなければなりません。組織を無傷に保つためには、安定した手と鋭いカミソリの刃が必要です。事前に練習することをお勧めします。

ネガティブコントロール溶液中に10個の無傷の断面を分配した後、プレートを20°Cの成長チャンバー内で連続光で20時間インキュベートします。翌日、マイクロピペットで各ウェルのモノリグナル溶液を取り出します。500マイクロリットルの1/2 MS培地を各ウェルに加え、10分間穏やかに撹拌します。

次に、マイクロピペットですすぎ液を取り出します。菌株促進アジド-アルキン環化付加溶液1ミリリットルを調製します。シクロオクテンタグ付き蛍光色素と液体滅菌1/2 MS培地の5つのマイクロミュラーが含まれています。

次に、溶液をボルテックスします。代謝取り込みプロトコルの最終洗浄ステップの後、1/2 MS培地を取り出し、マイクロピペットで各ウェルに300マイクロリットルのSPAAC溶液を加えます。48ウェルプレートを箱に入れて光から保護します。

次に、プレートを機械式シェーカーで周囲温度の暗闇で1時間静かに攪拌します。その後、プレートを暗所に置いたまま、前述のように1/2 MS培地で各ウェルを4回洗浄します。アスコルビン酸ナトリウム、硫酸銅、およびアジドタグ付き蛍光色素を含む銅触媒アジドアルキン環化付加溶液1ミリリットルと、液体滅菌1/2MS培地を調製します。

次に、溶液をボルテックスします。1/2 MS培地を取り出した後、プレートを箱に入れ、マイクロピペットで各ウェルに300マイクロリットルのCuAAC溶液を加えます。機械式シェーカーでプレートを周囲温度の暗闇で1時間静かに攪拌します。

メカニカルシェーカーからプレートを取り外し、マイクロピペットで各ウェルからCuAAC溶液を取り出します。次に、500マイクロリットルの1/2 MS培地を加え、暗闇の中で機械式シェーカーでプレートを10分間攪拌します。1/2 MS培地でさらに2回洗浄した後、500マイクロリットルの7:3メタノールと水溶液を各ウェルに加えます。

機械式シェーカーのプレートを暗闇で1時間かき混ぜます。次に、溶液をウェルから取り出します。次に、500マイクロリットルの1/2 MS培地を各ウェルに加え、暗所で10分間撹拌します。

この洗浄を4回繰り返した後、断面を1/2 MS培地に保管し、光から保護します。顕微鏡ガラススライド上に5滴の封入剤を置きます。次に、各化学レポータータグ付き断面をスライド上に慎重に堆積させます。

スライドの反対側の2つの側面にマニキュアを塗ります。気泡が入らないように注意して、スライドをカバースリップで覆います。その後、ペーパータオルで余分な封入剤を取り除

これに続いて、サンプルを4面すべてにマニキュアで密封します。マニキュアが乾いたら、スライドを摂氏4度で暗所に保管し、共焦点顕微鏡で観察します。植物の部分は、乾くとカリカリになる傾向があります。

常に溶液に入れて保管し、カバースリップをマニキュアで四方を密封してください。これにより、取り付けられたスライドの貯蔵寿命が延びます。サンプルスライドを対物レンズの下の顕微鏡ステージに置きます。

サンプルを観察して回転させ、植物組織の目的の領域を特定します。次に、Z軸で最も蛍光率の高い面を選択します。ゲイン、オフセット、レーザー出力を調整して、各チャンネルのグレーレベル範囲全体にわたって最適な信号分布を実現します。

最後に、高品質の共焦点画像を取得します。BLISSは、植物細胞壁内のリグニンの3色の局在化マップを提供し、代謝取り込み中にnovoで産生されるリグニンのみを標的とし、サンプル中の既存のリグニンと区別します。これは、臓器の異なる組織内、組織の異なる細胞タイプ内、または細胞の異なる壁層または下部構造内の活性木質化部位を強調します。

アルキンタグ付きGおよびアジ化物タグ付きHレポーターの取り込みプロファイルは、亜麻の二次木部内の形成層から髄まで、線維気管の最大木質化が発達中に急速に到達するのに対し、レース細胞は寿命のかなり後の段階でリグニンを取り込み続けることを示しています。ケミカルレポーターの比率を変えると、二次木部組織におけるリグニン組成は、細胞壁内のモノリグナル利用可能性に直接依存することがわかります。リグニン重合中のペルオキシダーゼやラッカーゼ特異性ではなく。

ケミカルレポーターの取り込みは、一部の細胞角と中央ラメラ一次細胞壁に限定されますが、すべての靭皮繊維ではありません。亜麻の根では、化学レポーターは、カスパリアンバンドが存在しない内胚葉細胞の壁に組み込まれています。組織構造の視覚化を改善するために、3D Zスタックの再構成も生成できます。

このビジュアルに従って、包括的なデータ処理も実行できます。すべての予防策を講じると、相対的な比較によって一定の結果を得ることが可能であり、異なるサンプル間でサンプルを読み取ることができます。それは、さまざまな分野の積極的なリードのローカリゼーションに加えて行うことができます。

この方法は、細胞壁を研究する私のような植物生物学者にとって素晴らしいツールです。一度マスターすれば、数時間で完了します。非常に感度が高く、さまざまなin vitro in vivo実験モデルシステム全体に適用できます。

ケミカルレポーター戦略をリグニンに適用することで、化学生物学者は木質化のダイナミクスを探求し、多くの点でまだ未知の領域であるこの重合プロセスを制御しているものを見つける道が開かれます。