Name: トレースのラットにおける視床皮質投射のビオチン標識デキストランの高分子量アミンの運用の改善 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 学ぶラットの視床皮質投射における高分子量ビオチン標識デキストランアミン（BDA）の応用改良法。共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて神経回路の詳細な可視化と局所回路の化学的特性解析を行います。

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本研究は、国家自然科学基金、中国の (プロジェクト コード番号 81373557; 号 81403327) によって賄われていた。

本研究は倫理委員会で、中国中国医学科学院 (参照番号 20160014) によって承認されました。すべてのプロシージャは、ケアおよび実験動物の使用 (国立アカデミー出版、ワシントン d. c.、1996) 国立の機関健康ガイドにしたがって運営しました。4 成熟雄ラット (重量 250 280 g) は、この研究で使用されました。すべての動物は制御温度と湿度、12 h 明暗サイクルで収容され、食料や水への無料アクセスを許可しました。楽器と本研究で使用される材料は、図 1に示しただった。 手術前に脳定位固定装置フレーム、ガラス ピペットなど、すべての楽器は、70% エタノールを使用してクリーニングされました。
1. 手術
<ol><li>VPM 定位アトラス9 (図 2 a) を使用して対象の座標エリアを決定します。</li>
	<li>ガラス マイクロ ピペット (約 10-20 μ m の先端径) と装備 1 μ L マイクロ シリンジを準備 (図 1) と流動パラフィンをテストします。</li>
	<li>7% 抱水クロラール (0.7 mL/100 g) をラットの腹腔内投与による麻酔します。</li>
	<li>深い麻酔が確認されればピンチの尾を持つと逃避反射をペダル、電気かみそりを持つ動物の頭の上を剃る、70% エタノールをそれぞれ続いて 10% ポビドン ヨードと手術部位の 3 回をスクラブします。</li>
	<li>耳に鈍耳バーを配置することによってラットに脳定位固定装置とラットの上顎中切歯口ホルダー (図 1E) に置き、目に眼軟膏を適用します。</li>
	<li>70% のエタノールを使用して再度手術部位の頭の肌をクリーンアップします。無菌条件下で手術を維持するために、滅菌手術用手袋とタオルを使用します。</li>
	<li>矢状縫合 (図 1 f) に沿ってメスで皮膚の矢状切開を行います。</li>
	<li>筋肉や骨膜出血 (図 1 f) コントロールに手術中の滅菌綿棒を使用して頭蓋骨からをこすり。</li>
	<li>アトラス (図 2 a) からあらかじめ定義された座標を使用して、開頭術 (図 1) の場所 (-3.30 mm 前ポイント、2.6 mm 右正中線) を決定します。</li>
	<li>ラウンド先端ビット (#106) (図 1 H) とバリ ドリルを使用して開頭手術を行い (図 1I) 髄膜に到達するまでわずか数分約 1 mm の深さにドリルを続行します。</li>
	<li>注射部位 (図 1I) 経由で大脳皮質を公開する microforceps を用いた硬膜を切除します。</li>
	<li>10 %bda (蒸留水で分子重量の 10,000) ソリューション (図 1 j) とマイクロ注射器で液体パラフィンを変更します。</li>
	<li>マイクロインジェクション装置の上に注射器をマウントし、マイクロ ポンプ (図 1 K) で接続します。 注: 注入ボリュームはマイクロ ポンプの速度に依存します。ここでは 30 nL/min (図 1 L) を調整します。</li>
	<li>、顕微鏡下で 5.8 mm (図 1 M) の深さで脳の皮質表面を通って VPM にマイクロインジェクション装置と手動でガラス マイクロ ピペットを挿入します。</li>
	<li>圧力注入、100 nL 10% のマイクロ ポンプ (図 1 L, M) で 3 分 (35 nL/min) の期間にわたって VPM に BDA。</li>
	<li>注入後、さらに 5 分間位でピペットを維持し、ゆっくりと引き出します。</li>
	<li>滅菌のスレッド (図 1 n) に傷を縫合します。前と手術後の鎮痛のため、ローカル動物の世話委員会ガイドラインに従います。</li>
	<li>それは意識を取り戻すは完全に回復するまで、温かみのあるリカバリ領域にラットを配置します。</li>
	<li>そのケージに戻って回復したラットを返します。</li>
</ol>2. perfusions とセクション
<ol><li>通常 10 日間の生存期間後、安楽死を誘導するために腹腔内投与による 10% ウレタン (2 mL/100 g) の過剰摂取で動物を注入します。</li>
	<li>フード (図 1O) 実験的ラットを灌流します。<ol>
<li>呼吸が止まればははさみや鉗子を使用して中心部にアクセスするラットの胸腔を開きます。左心室、大動脈の方に静脈カテーテルを挿入し、右の耳介を開きます。</li>
		<li>最初 0.9% リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 生理学的温度 (37 ° C) での灌流心臓から出る血になるまで約 1-2 分をオフに、0.1 M のリン酸バッファー (PB, pH 7.4) の 250-300 mL 4% パラホルムアルデヒドを続行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>灌流後、頭部の皮膚を切開、頭蓋骨を開き、ラットの脳を解剖します。後 2 時間室温 (26 ° C)、30% のショ糖 0.1 M PBS (pH 7.4) 脳はソリューション (図 1 P) に浸漬されるまで 4 ° C で 3 日間で cryoprotect で 4% パラホルムアルデヒドで切り裂かれた脳を修正します。</li>
	<li>脳は溶液中浸漬、一度脳を脳行列 (図第 1 四半期) の歯冠方向に 3 つのブロックに分割します。中央ブロックには、VPM と S1 が含まれています。</li>
	<li>歯冠方向にスライディング ミクロトーム凍結段階で 40 μ m で脳の中央部をカットします。(数字 1 rS) 0.1 M PBS (pH 7.4) と 6 も皿に整然としたこれらのセクションを収集します。</li>
</ol>3. 標準 ABC 染色
注: 標準 ABC 手順10と BDA の分類を可視化する、脳のすべての 3 番目のコロナ セクションから無料浮動セクションが使用されました。
<ol><li>約 1 分の 0.1 M PBS でセクションをすすいでください。</li>
	<li>インキュベートの 0.1 M PB で 1 %abc ソリューションのセクション (pH 7.4) 含む 0.3% トリトン X-100 室温で 1 時間。</li>
	<li>3 倍 50 mM Tris バッファー (pH 7.4) のセクションを洗います。</li>
	<li>0.02 %3、tetrahydrochloride 3'-ジアミノベンジジン (軽打)、室温で約 2-5 分の 50 mM Tris バッファーの 0.01% H2O2を含むソリューション内のセクションを染色します。</li>
	<li>3 倍 50 mM Tris バッファー (pH 7.4) のセクションを洗います。</li>
	<li>標準の組織化学的手法 (図 1 t;補足動画ファイル III、血流とのセクションを参照してください) を使用して顕微鏡のスライドのセクションをマウントします。</li>
	<li>一晩常温空気中セクションを乾燥させます。</li>
	<li>アルコール (50%、70%、95%、100%) ソリューションのシリーズに簡単にセクションを脱水します。約 15 のための各ソリューションのスライドを水没 s。各ステップの間を乾燥させるスライドできないようにします。</li>
	<li>キシレンのセクションをオフに 3 回、約 20 分。</li>
	<li>スライスのバルサムの 2 または 3 滴を置くのセクション coverslips を配置します。</li>
</ol>4. 二重蛍光染色 BDA と大脳皮質における基本的な神経要素
注: 一方、二重蛍光染色を行った BDA ラベリングの相関関係を観察するためして蛍光ニッスル染色 AF500/525 counterstained 上記に隣接するセクションの基本的な神経要素ストレプトアビジン AF594 で使用します。
<ol><li>約 1 分の 0.1 M PBS でセクションをすすいでください。</li>
	<li>インキュベート ストレプトアビジン AF594 (1: 500) と 0.1 M PBS の AF500/525 緑蛍光ニッスル染色 (1:1, 000) の混合溶液中のセクション (pH 7.4) 含む 0.3% トリトン X-100 室温で 2 時間。</li>
	<li>3 回で 0.1 M PB (pH 7.4) セクションを洗います。</li>
	<li>標準的な組織化学的手法を用いた顕微鏡のスライドのセクションをマウントします。約 1 時間のための空気の部分を乾燥させます。</li>
	<li>Coverslips を観察する前に蒸留水で 50% グリセリンで蛍光のセクションに適用されます。</li>
</ol>5. 二重蛍光染色 BDA と大脳皮質における介在ニューロン
注: 二重蛍光染色 BDA ラベリングとストレプトアビジン AF594 と PV 免疫血清皮質ターゲットの代表的なセクションの介在との相関を観察するため行った。
<ol><li>約 1 分の 0.1 M PBS (pH 7.4) の代表的なセクションをすすいでください。</li>
	<li>3% ヤギ血清および 0.3% を含むブロック ソリューションのセクションを孵化させなさい 30 分の 0.1 M PBS でトリトン X-100。</li>
	<li>マウス モノクローナル抗-PV IgG (1:1, 000) 0.1 M PBS (pH 7.4) 含有 1% ヤギ血清と 0.3% の溶液にセクションを転送 4 ° C で一晩トリトン X-100</li>
	<li>次の日に 3 回で 0.1 M PBS (pH 7.4) セクションを洗います。</li>
	<li>ヤギ抗 mouse AF488 二次抗体 (1: 500)、ストレプトアビジン AF594 (1: 500) と 4', 6-diamidino-2-phenylindole 塩酸 (DAPI、1:40, 000) 0.1 M PBS (pH 7.4) 含有 1% ヤギ血清 0.3 の混合液にセクションを公開 % トリトン1 h の X-100。</li>
	<li>4.3 から 4.5 の手順を繰り返します。</li>
</ol>6. 観察
<ol><li>VPM、視床皮質軸索および視床ニューロンの画像を取る。<ol>
<li>対物レンズを備えた共焦点イメージング システムと蛍光試料を観察 (4 x、NA: 0.13; 10 x、NA: NA 0.40; 40 x: 0.95)。405 (青)、488 (緑) の励起・発光波長と 559 (赤) nm を使用します。 注: ここでは、共焦点ピンホールは 152 μ m (4 x、10 x) および 105 μ m (40 倍)。イメージ キャプチャの空間解像度は 1024 × 1024 ピクセル (4 x、10 x)、640 × 640 ピクセル (40 倍)。</li>
		<li>各セクションからの厚さ 40 μ m (Z シリーズ)、2 μ m の連続するフレームの 20 の画像を取る。</li>
		<li>共焦点画像処理三次元を次のように分析するためのソフトウェア システムと単一焦点のイメージ画像に統合: 開始フォーカル プレーン セット end フォーカル プレーン セット ステップ サイズ → → 深パターン → イメージ キャプチャ → Z シリーズを選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>デジタル カメラを搭載した光顕微鏡による明視野画像を撮影 (4 x、NA: 0.13; 10 x、NA: NA 0.40; 40 x: 0.95 レンズ)。明るさとコントラスト画像の調整し、ラベルを追加する 500 さん使用の写真編集ソフトウェアの露光時間を使用します。</li>
</ol>

<ol><li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single-+and+double-labeling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies.</a> J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).</li>
<li>Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).</li>
<li>Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+detailed+structure+of+cortical+and+thalamic+neurons+in+the+adult+rat+brain+with+refined+biotinylated+dextran+amine+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling.</a> PLoS One. 7, e45886(2012).</li>
<li>Zhang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+and+retrograde+tracing+with+high+molecular+weight+biotinylated+dextran+amine+through+thalamocortical+and+corticothalamic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways.</a> Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+amine+anterograde+tracing+of+the+canine+corticospinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract.</a> Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).</li>
<li>Armstrong-James, M., Callahan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamo-cortical+processing+of+vibrissal+information+in+the+rat.+II.+spatiotemporal+convergence+in+the+thalamic+ventroposterior+medial+nucleus+%28VPm%29+and+its+relevance+to+generation+of+receptive+fields+of+S1+cortical+%26%2334%3Bbarrel%26%2334%3B+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical &#34;barrel&#34; neurones.</a> J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).</li>
<li>Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamo-cortical+processing+of+vibrissal+information+in+the+rat.+I.+Intracortical+origins+of+surround+but+not+centre-receptive+fields+of+layer+IV+neurones+in+the+rat+S1+barrel+field+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex.</a> J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).</li>
<li>Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+precision+in+the+thalamic+projection+to+neonatal+mouse+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex.</a> J Neurosci. 15, 549-561 (1995).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , Academic Press. San Diego. (1998).</li>
<li>Davidoff, M., Schulze, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1692015">Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining.</a> Histochemistry. 93, 531-536 (1990).</li>
<li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+axonal+diffusion+of+3000+molecular+weight+dextran+amines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines.</a> J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).</li>
<li>Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+retrograde+axonal+transport+and+subsequent+visualization+of+tetramethylrhodamine+%28TMR%29+-dextran+amine+by+means+of+an+acidic+injection+vehicle+and+antibodies+against+TMR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR.</a> J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).</li>
<li>Medina, L., Reiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efferent+projections+of+the+dorsal+and+ventral+pallidal+parts+of+the+pigeon+basal+ganglia%2C+studied+with+biotinylated+dextran+amine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine.</a> Neuroscience. 81, 773-802 (1997).</li>
<li>DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin+is+expressed+in+a+reciprocal+circuit+linking+the+medial+geniculate+body+and+auditory+neocortex+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit.</a> J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).</li>
<li>Ojima, H., Takayanagi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+two+anterograde+axon+tracers+to+label+distinct+cortical+neuronal+populations+located+in+close+proximity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity.</a> J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).</li>
<li>Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in neuroanatomical tracing.</a> Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).</li>
<li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).</li>
<li>Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracortical+connections+are+altered+after+long-standing+deprivation+of+dorsal+column+inputs+in+the+hand+region+of+area+3b+in+squirrel+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys.</a> J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

成功した神経トレース実験のための重要なステップは、適切なトレースを選択します。BDA、高分子量 BDA の家族で (分子量 10,000) は、低分子量 BDA (分子量 3,000)2,3と対照をなして前向性神経経路を介して運ばれる優先的に推奨されました。,11,12,13。 ただし、多くの研究はまた前向性トレース1,2,3と並行して逆行性経路トレースの BDA かもしれない潜在的使用もその高分子量を示唆。VPM と S1 の間相互の神経経路を介して高分子量 BDA は双方向管トレース4</s...

高分子量 BDA (10,000 の分子量)、高感度トレーサーは、20 年以上1中枢神経系の神経の経路をトレースするために使用されています。BDA の使用は一般的な神経路追跡法が、BDA のラベリングの品質を受けます動物の様々 な要因1,2,3。私たちの最近の研究では、BDA のラベルの最適な構造は、適切な投与後の生存時間に関連付けられているだけでなく、染色方法4とも相関を示されています。今、従来のアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体 (ABC)、ストレプトアビジンかに、ストレプトアビジン AF594 まで染色法は以前研究2,3、BDA のラベル付けを明らかにするため使用されました。 4,5。比較では、BDA の蛍光染色を簡単に実行できます。
高分子量 BDA のアプリケーションを拡張するために洗練されたプロトコルは本研究で導入されました。ラット脳における視床 VPM に BDA の注入、BDA ラベリングした二重蛍光染色による、BDA のラベリングの相関関係を観察するため実施しただけでなく、正規標準 ABC 染色法によって明らかにされた、基本的です神経素子または介在ニューロン PV-免疫蛍光ニッスル組織化学やストレプトアビジン AF594 の皮質のターゲットにそれぞれ。VPM と一次体性感覚野 (S1)6,7,8間相互の神経経路を重点的に投影視床皮質軸索で視床ラベリング BDA の着眼点S1 で投影された細胞細胞体。これにより、高分子量 BDA、ニューラル ラベルの高品質を取得するための詳細なプロトコルだけでなく、BDA の蛍光標識の組み合わせと他の蛍光神経マーカーと洗練されたプロトコルを提供する予想組織化学や免疫。この方法は、局所神経回路と共焦点レーザ走査型顕微鏡の下で、化学的性質を研究することが望ましいです。

<table><tbody><tr><td>ビオチン化デキストランアミン(BDA)</td><td>分子プローブ</td><td>D1956</td><td>分子量10,000</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-アレクサ 蛍光 594</td><td>分子プローブ</td><td>S32356</td><td>光から保護</td></tr><tr><td>500/525 緑色蛍光ニッスル染色</td><td>分子プローブ</td><td>N21480</td><td>光から保護</td></tr><tr><td>脳定位固定装置</td><td>ナリシゲ</td><td>SR-50</td><td></td></tr><tr><td>凍結ミクロトーム</td><td>Thermo</td><td>Microm International GmbH</td><td></td></tr><tr><td>共焦点イメージング</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Drill</td><td>Saeyang Microtech</td><td>Marathon-N7</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley</td><td>Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences</td><td>SCKX (JUN) 2012-004</td><td></td></tr><tr><td>VectastainABCキット</td><td>、ベクターラボ、</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>、スーパーフロスト、顕微鏡スライド、</td><td>Thermo</td> <td>#4951PLUS-001</td>、<td>25x75x1mm</td></tr><tr><td>、Photoshop、イラスト</td><td>、Adobe</td><td>CS5</td><td></td></tr></tbody></table>

トレースのラットにおける視床皮質投射のビオチン標識デキストランの高分子量アミンの運用の改善

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

ビオチン標識デキストランの高分子量アミン (BDA) は多くの長年に渡って非常に敏感な神経解剖学的トレーサーとして使用されています。ラベルの記載事項の品質が、ここでは、さまざまな要因によって影響を受けるので、中枢神経系における最適なニューラル ラベリングを勉強するため高分子量 BDA のアプリケーション我々 には、洗練されたプロトコルが提供します。繊細なガラス製ピペットによるラット視床の後内側腹側核 (VPM) に BDA の定位注射後 BDA 蛍光ストレプトアビジン-Alexa (AF) 594 で染色、蛍光ニッスル染色 AF500/525 counterstained。ニッスル染色緑の背景には、体性感覚野における赤 BDA ラベル付け、神経細胞の細胞体や軸索の端末を含むは示されたよりはっきりと。さらに、BDA の蛍光染色を倍増し、BDA のラベリングと皮質のターゲットでは、ローカルの神経を研究する機会を提供する太陽光発電肯定的な介在との相関を観察するカルシウム結合蛋白質パルブアルブミン (PV) を行った回路とその化学特性。したがって、この洗練されたメソッドだけは適していませんが高品質高分子量 BDA 視床と大脳皮質の間の相互の神経経路を介して標識神経を可視化するための同時デモを許可するも蛍光組織化学や免疫と他の神経マーカー。

VPM に BDA の 10 日間のポスト注入の生存は強烈なニューラル ラベル対応する皮質領域に注入側 (図 2) に同側の生産のために十分だった。従来の ABC、蛍光染色し、BDA の手順同様 anterogradely を含む、S1 の神経ラベリングの視床皮質軸索をラベルし、逆行性標識視床細胞 (図 2、D を明らかにしました。).
軸索をラベル付け anterogradely、レイヤー 4、高密度層 6 層 2 から観察され、視床皮質軸索の典型的なタイプは樽地域 (図 2D) で観察されました。高い拡大で軸索のトランク、枝、販促物、小さな下肢 (図 3 a</s...

ここでは、効果的に相互神経経路を通じて染色蛍光ラベリング ビオチン標識デキストラン アミン (BDA) を明らかにする洗練されたプロトコルを提案します。微細構造の解析に適しています bda ラベル付けおよび共焦点レーザー走査型顕微鏡の下で他の神経要素からそれを区別します。

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

このビデオの全体的な目的は、中枢神経系における最適な神経標識を研究するための、高分子量BDA適用の改良されたプロトコルを実演することです。この手法は、神経回路を介して神経標識の枠組み構造を可視化することにより、神経ネットワーク分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、局所的な神経回路とその化学的特性を解析する機会が得られることです。ガラス製マイクロピペットを備えた1 µLマイクロシリンジを準備し、液体パラフィンを吸引して動作を確認します。承認されたプロトコルに従ってラットに麻酔を施した後、尾部をピンチして反応がないことを確認し、深い麻酔状態であることを確かめます。次に、電気シェーバーで動物の頭頂部を剃毛し、手術部位を10%ポビドンヨード、続いて70%エタノールで洗浄します。耳に鈍端のイヤバーを挿入し、ラットの上顎切歯をマウスホルダーに固定して、ラットを定位固定装置に固定します。眼には眼軟膏を塗布します。滅菌状態を維持するため、滅菌サージカルグローブおよびドレープを使用します。手術部位の頭部皮膚を70% ethanolで再度洗浄します。メスを用いて矢状縫合に沿って皮膚を矢状に切開した後、滅菌綿棒を使用して、頭蓋骨から筋肉と骨膜を掻き出します。アトラスの既定の座標を用いて、開頭術の部位を決定します。ラウンドチップビット付きのバードリルを使用し、髄膜が見えるまで約1 mmの深さまで穿孔して開頭術を行います。マイクロ鉗子を用いて硬膜を切除し、注入部位上の大脳皮質を露出させます。マイクロシリンジから液体パラフィンを排出し、次に10% BDA溶液を吸い込みます。シリンジをマイクロインジェクション装置に取り付け、マイクロポンプを接続します。実体顕微鏡下で、マイクロインジェクション装置を操作します。充填したガラスマイクロピペットを、脳の皮質表面からVPMに向かって5.8 millimetersの深さまで挿入します。次に、マイクロポンプを使用して、10%BDAを100 nanoliters、3分間かけてVPMに加圧注入します。5分後、ピペットをゆっくりと引き抜きます。滅菌糸で創傷を縫合し、ラットが意識を取り戻し完全に回復するまで、温暖な回復エリアに安置します。ラットを安楽死させた後、はさみとピンセットを用いてラットの胸腔を開き、心臓にアクセスします。静脈カテーテルを左心室から大動脈に向かって挿入し、その後、右心耳を開きます。まず、生理的温度の0.9% salineで約1〜2分間、心臓から流出する血液が透明になるまで灌流させます。その後、0.1 molar リン酸緩衝液で調製した4% paraformaldehydeを250〜300 mLを用いて灌流を続けます。摘出した脳を4% paraformaldehydeに浸し、室温で2時間後固定します。次に、脳を0.1 M PBSで調製した30%スクロース溶液に移し、4°Cで3日間凍結保護します。3日後、脳が溶液中で沈降したら、ブレインマトリックスを用いて脳を冠状方向に3つのブロックに分割します。中央のブロックには、一次体性感覚野における視床後内側腹側核が含まれています。脳の中央ブロックをスライディングミクロトームの凍結ステージに固定し、冠状面で切片を作成します。凍結後、40 µmの厚さで切断します。切片は0.1 M PBSを含む6ウェルディッシュに回収します。切片を0.1 M PBSで約1分間、揺らしながらすすぎ、染色を開始します。次に、切片を0.3% Triton X-100を含む0.1 M PBS中のstreptavidin-AF594とAF500/525グリーン蛍光ニッスル染色の混合溶液に移し、室温で2時間インキュベートします。染色後、0.1 M PBを用いてロッキングしながら切片を3回洗浄します。標準的な組織化学的手法を用いて、切片を顕微鏡スライドに封入します。切片を1時間ほど風乾させます。スライドのイメージング前に、蒸留水で調製した50%グリセリンを蛍光切片に塗布し、カバーガラスをかけます。この代表的な顕微鏡写真では、緑色のニッスル染色の背景に、視床の腹側後内側核におけるBDAの注入部位が赤色で示されています。ここでは、第4層の視床皮質軸索および第5・6層の皮質視床ニューロンを含む、Thorescent BDA標識を示しています。比較として、この顕微鏡写真では、標準的なアビジン・ビオチン・ペルオキシダーゼ法による従来のBDA標識が、Thorescent BDA標識と同様の神経標識パターンを示すことが分かります。Thorescent BDA標識切片の高倍率像では、順行性に標識された軸索樹状突起が赤色で詳細に示されています。ここでは、逆行性に標識された神経細胞体、樹状突起、および樹状突起棘を詳細に示しています。適切に実施すれば、開頭術と定位注入は習熟後20分から30分で完了させることができます。このビデオを視聴することで、神経接続を可視化するための高分子量BDAの適用方法と、神経標識の詳細な構造について十分に理解できるはずです。

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方法は新皮質の所定の機能、マイクロドメインにおける蛍光色素でニューロンを標識に記載されている。まず、内因性シグナル光学イメージング、機能マップを得るために使用されます。その後、2光子顕微鏡は、マップのミクロドメイン内でラベルとイメージニューロンに使用されます。...

特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識

コレラ毒素とビオチン化デキストランアミン二重標識が続く仮性狂犬病ウイルスとペリフェラルターゲットからトレース経シナプス

外科的方法は、新生児ラットにおいて腹側頭骨を露出させるために記載されている。このアプローチを使用すると、麻酔仔の脳幹における急性電気生理学及び二光子顕微鏡実験を行うために開頭術を開くことが可能である。...

新生児げっ歯類の腹スカルに開頭術を行うには方法

神経回路網の構造を理解するために、個々のニューロンの機能的および形態学的特徴付けが必要である。ここで、我々はまだ、細胞内で樹状および軸索建築の事後再構築のために、ニューロンを標識する能力を維持し、細胞外の構成で電気生理学的記録を可能にするjuxtasomalビオシチンラベルを示しています。...

Juxtasomalビオシチン標識は、個々の皮質ニューロンの構造機能相関を研究するために、

免疫組織化学プロトコルは、網膜中の特定のタンパク質の局在化を研究するために使用される。カルシウムイメージング技術は、網膜神経節細胞および軸索のカルシウム動態を研究するために使用される。...

ホールマウントラット網膜における免疫組織化学的およびカルシウムイメージング法

病的な条件下での脳の再編成を研究するために、血液脳関門を迂回して脳に直接タンパク質を送達するためのミニ浸透ポンプを使用しました。次に、トラクトトレーサーを注入して、タンパク質の影響下での脳の接続性の変化を研究します。...

ミニ浸透圧の移植は、病態生理学的状態で脳の再編成を検討するためにポンプ冊子トレーサーの配達

我々は、in vitroでの調製物を用いて脳核に順行性または逆行性トレーサー注射を介して、神経細胞とそのプロセスを標識する技術が記載されています。我々 は 、nラベリング精度を高めるために、蛍光標識されたマウスの変異体および基本光学機器を利用して、トレーサーエレクトロ体 ​​外 I既存の方法を変更しました。...

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

このプロトコルは、オープン頭蓋骨外傷性脳損傷のマウスモデルの方法論を示し、培養ヒト誘導多能性幹細胞由来細胞を傷害部位に移植する。これらの手順からの結果の行動および組織学的検査も簡単に説明される。...

ヒト誘導多能性幹細胞由来神経細胞の治療移植によるマウス脳損傷の制御された皮質衝撃モデル

現在のプロトコルは、海馬への腹側テグメンタル領域(VTA)グルタミン酸突起をトレースするための簡単な方法を示しています。VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激をCA1記録と組み合わせて、VTAグルタミン酸末端が生体内での推定ピラミッド発火率を調節する方法を示した。...

海馬の腹側テグメンタル領域グルタミン酸末端のインビボ解剖学的および機能的なトレース

ここでは、インタクトな脳構造の一部として標的分子を観察することを可能にする疎水性組織クリアリング法を提示する。この技術は現在、両方の男女のF344/...

ラット脳組織の疎水性組織除去法

シリアル2光子断層撮影法(STPT)イメージングは、2光子イメージングと自動ステージ制御およびミクロトームスライスを組み合わせて、組織の塊を3次元形状でイメージングする技術です。ここでは、マーモセットの脳がその構造的特徴をよりよく理解するために、それを実装するためのプロトコルについて説明します。...

神経解剖学的解析のためのマーモセット脳全体の連続2光子断層撮影法

学ぶラットの視床皮質投射における高分子量ビオチン標識デキストランアミン（BDA）の応用改良法。共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて神経回路の詳細な可視化と局所回路の化学的特性解析を行います。

トレースのラットにおける視床皮質投射のビオチン標識デキストランの高分子量アミンの運用の改善

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