トレースのラットにおける視床皮質投射のビオチン標識デキストランの高分子量アミンの運用の改善

このビデオの全体的な目標は、中枢神経系における最適な神経標識を研究するための高分子量BDAの適用のための洗練されたプロトコルを実証することです。この指標は、ニューラルネットワーキング分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。ニューラルラベリングのフレーム構造を神経回路を通じて可視化します。

この技術の主な利点は、局所的な神経回路とその化学的特性を開始する機会を提供することです。ガラス製マイクロピペットを装備した1マイクロリットルのマイクロシリンジを用意し、流動パラフィンを採取して試験します。承認されたプロトコルを使用してラットに麻酔をかけた後、テールピンチに対する反応がないことにより、深部麻酔を確認します。

次に、電気カミソリで動物の頭のてっぺんを剃り、手術部位を10%ポビドンヨードでこすり、続いて70%エタノールでこすります。鈍いイヤーバーを耳に挿入し、ラットの上切歯をマウスホルダーに入れて、ラットを定位固定装置に固定します。眼科用軟膏を目に塗ります。

滅菌状態を維持するために、滅菌手術用手袋とドレープを使用してください。手術部位の頭部皮膚を70%エタノールで再度洗浄します。メスで皮膚を矢状切開した後、矢状縫合糸に沿って、滅菌済みの綿先端のアプリケーターを使用して、筋肉と骨膜を頭蓋骨からこすり落とします。

アトラスから事前に定義された座標を使用して、開頭術の位置を決定します。丸い先端ビットを備えたバリドリルを使用して開頭術を行い、髄膜が見えるまで約1ミリメートルの深さまでドリルで穴を開けます。マイクロ鉗子を使用して硬膜を切除し、注射部位の上に大脳皮質を露出させます。

マイクロシリンジから流動パラフィンを排出し、10%BDA溶液を吸い上げます。シリンジをマイクロインジェクション装置に取り付け、マイクロポンプを接続します。実体顕微鏡で、マイクロインジェクション装置を操作します。

充填されたガラスマイクロピペットを、脳の皮質表面からVPMに5.8ミリメートルの深さまで挿入します。次に、マイクロポンプを使用して、100ナノリットルの10%BDAをVPMに3分間かけて圧力注入します。5分後、ピペットをゆっくりと引き抜きます。

滅菌糸で傷口を縫合し、その後、ラットが意識を取り戻し、完全に回復するまで、ラットを暖かい回復領域に置きます。ラットを安楽死させた後、はさみと鉗子を使用してラットの胸腔を開き、心臓にアクセスします。静脈内カテーテルを左心室に挿入し、大動脈に向かって挿入し、次に右耳介を開きます。

まず、心臓から出る血液が透明になるまで、生理学的温度で約1〜2分間、0.9%生理食塩水で灌流します。次に、250〜300ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドを0.1モルリン酸緩衝液中で続けます。解剖した脳を4%パラホルムアルデヒドで室温で2時間後固定します。

次に、脳を0.1モルPBS中の30%スクロースに移し、摂氏4度で3日間凍結保護します。3日後、脳が溶液に沈んだら、脳マトリックスの助けを借りて脳を冠状方向に3つのブロックに分割します。中央ブロックには、一次体性感覚皮質の視床の腹側後内側核が含まれています。

脳の中央ブロックをスライド式ミクロトームの凍結段階に取り付けて、冠状面に切片化し、凍結時に40ミクロンで切断します。0.1モルPBSを含む6ウェルディッシュに切片を回収します。染色を開始するには、0.1モルPBSで切片をロッキングしながら約1分間すすぎます。

次に、切片をストレプトアビジン-AF594のAF500/525緑色蛍光ニッスル染色液中の0.1%Triton X-100含有0.1モルPBS中の混合溶液に移し、室温で2時間インキュベートします。染色後、切片を0.1モルPBでロッキングしながら3回洗浄します。標準的な組織化学的手法を使用して、切片を顕微鏡スライドに取り付けます。

切片を約1時間風乾します。蒸留水に50%グリセリンをトーレセント切片に塗布し、スライドをイメージングする前にスリップを覆います。この代表的な顕微鏡写真は、緑色Nissl染色の背景に視床の腹側後内側核のBDA注入部位を赤色で示しています。

ここには、第4層の視床コルチコール軸索と第5層と第6層の皮質視床ニューロンを含む、トーレセントBDA標識が示されています。比較のために、この顕微鏡写真は、標準的なアビジン-ビオチンペルオキシダーゼ手順による従来のBDA標識が、トーレセントBDA標識と同様の神経標識パターンを明らかにすることを示しています。この胸部BDA標識切片の高倍率表示は、前方に標識された軸索アーバーを赤で詳細に示しています。

ここでは、逆行性に標識された神経細胞体、樹状突起、樹状突起スパインについて詳しく説明します。一度習得すると、開頭術と脳定位固定装置注射は、適切に行われれば、20〜30分で行うことができます。このビデオを見れば、高分子量BDAを適用してニューロンの結合を復活させる方法と、神経標識の詳細な構造について十分に理解できるはずです。