顕微鏡を用いたひと脂肪組織血管機能評価
2017年9月29日
ビデオ顕微鏡システムは、生理学的および薬理学的刺激への反応で分離脂肪細動脈の機能特性を調べるに使用されます。この手法は、肥満人間で異なる脂肪組織ドメインにおける微小血管表現型を確認する使用できます。
このビデオ顕微鏡技術の全体的な目標は、薬理学的および生理学的刺激に応答して単離された微小血管の機能特性を調べることであり、ヒトの血管機能障害に寄与する病態生理学および分子メカニズムへの洞察を提供することです。この方法は、全身性疾患に関連している脂肪内の局所微小血管系の機能不全に寄与する分子メカニズムを理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、人体から一定期間取り除いた後も血管が機能し続けることと、その生理学的特性について簡単に検査できることです。
この実験的アプローチの臨床的関連性は、疾患状態によって異なる変化をもたらす経路を特定し、新しい治療標的を発見できる可能性があることです。組織解剖顕微鏡で、マイクロハサミとマイクロ鉗子を使用して、脂肪サンプル内の小さな動脈から周囲の脂肪と結合組織を慎重に除去します。動脈と細静脈を区別することが不可欠です。
動脈は通常、細静脈よりも直径が小さく、より大きなトーンを示し、より堅牢に反応します。動脈が分離されたら、ナイロンまたはシルクの縫合糸を使用して枝を結びます。次に、10ミリリットルの注射器を使用して、チューブに新しいクレブス溶液をゆっくりと充填します。
次に、チャンバー内の圧力リザーバーとガラスキャピラリーピペットにゴムチューブを取り付けます。次に、解剖した動脈を臓器室に移動し、血管をガラス製キャピラリーピペットにカニューレ挿入します。動脈の両端をナイロン縫合糸でピペットに慎重に固定します。
容器が固定されたら、クレブス緩衝液をチャンバーからゆっくりと取り出し、2ミリリットルの新鮮なクレブス溶液をチャンバーに加えます。次に、ビデオカメラを搭載した倒立顕微鏡のステージに臓器室を取り付けます。エッジ検出ソフトウェアを1キロヘルツのサンプリングレートでオンにします。
残りの加圧チューブを2番目のクレブス溶液充填圧力リザーバーに接続し、次に圧力リザーバーを圧力トランスデューサーに接続します。すべてのチューブを接続したら、加熱ブロックを摂氏37度に設定します。次に、圧力制御ユニットを使用して、管腔内圧力を5分ごとに5ミリリットルの水銀まで徐々に上昇させ、分離された血管の内腔内で適切な実験圧力を達成します。
圧力が60ミリリットルの水銀に達したら、血管を20〜30分間平衡化させ、安静時の脂肪動脈の直径を記録します。平衡化期間の終わりに、血管の直径が適切に収縮するまで、5分ごとに1マイクロリットルのエンドセリン1を直接浴に加えることにより、血管を安静時ベースライン直径の約55%に事前に収縮させます。.血流誘発性内皮依存性血管拡張の場合、動脈の管腔内腔に等しい方向と反対方向に連続的な流れを誘導して、60ミリメートル水銀柱の平均管腔内圧を変更せずに血管全体に圧力差を生じさせることができます。.
3〜5分後、流れを介した拡張を測定します。圧力勾配の増分ごとに、5〜6分ごとに10センチメートルの水交換を増やし、最大100センチメートルの水まで増やします。流れを介した血管の拡張を評価した後、圧力リザーバーを同じ高さに戻して、流れの誘導を停止します。
その後すぐに、しかし慎重に、しかし懸濁動脈を乱さずに新しいクレブス溶液とチャンバー溶液を交換し、血管が20〜30分間ベースライン直径に戻り始めるのを待ちます。動脈が安静時ベースライン直径に戻ったら、微妙なコリン媒介性内皮依存性血管拡張を評価できます。これは、前に実証したように、血管をエンドセリン1で静止直径の約55%に事前に収縮させることから始まります。
事前収縮が達成されたら、2マイクロリットルの増量アセチルコリンを直接浴に加えます。.各用量の投与から5分後に動脈径の変化を記録します。.アセチルコリンの用量反応が完了したら、パパベリンと内皮非依存性血管拡張薬を直接浴に順次投与することにより、内皮非依存性血管拡張と血管生存率を評価します。.
血流の増加と純粋なストレスに対する内皮依存性血管拡張反応、またはアセチルコリンは、ヒトの肥満の内臓動脈と皮下脂肪動脈で有意に鈍化します。しかし、パパベリンに応答した内皮非依存性血管拡張は、2つのディポーズ間で差的に変化することはなく、内臓領域の血管機能障害は、少なくとも疾患の初期段階では、内皮レベルでの機能障害が主に結果であることを示唆しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、3〜5時間で完了できます。
この手順を試みるときは、血管にわずかな損傷があっても結果が歪む可能性があるため、時間をかけて勤勉であることを忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、血管のsiRNAトランスフェクションなどの他の方法を実行して、特定の遺伝子がヒトの疾患の血管運動機能に与える影響に関する追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、脂肪組織生物学と微小循環の分野の研究者が、脂肪組織の微小環境がヒトの肥満の局所血管の健康に与える影響を調査する道を開きました。
このビデオを見た後、生体から除去されたヒト血管の無傷の部分全体の病態生理学を直接調査する方法、つまり非侵襲的イメージングでは再現できないプロセスについて十分に理解できるはずです。
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概要
本記事では、さまざまな刺激に対する単離脂肪組織細動脈の機能的特性を分析するためのビデオ顕微鏡システムの利用について解説します。この手法は、肥満者の微小血管表現型に関する知見を提供し、血管機能不全の理解に寄与します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 血管生物学
- 生理学
背景
- ビデオ顕微鏡法により、単離した微小血管の観察が可能です。
- この手法は、全身性疾患に関連する血管機能不全の理解に役立ちます。
- 血管の機能的特性は、体外に摘出した後で評価することができます。
- 疾患条件下で変化したパスウェイを特定することは、治療ターゲットの発見において極めて重要です。
研究目的
- 薬理学的および生理学的刺激に対する微小血管の反応を調査すること。
- 血管機能不全の分子メカニズムに関する知見を提供すること。
- 脂肪組織内における局所的な微小血管機能不全への理解を深めること。
使用方法
- 組織剥離のためのマイクロシザーおよびマイクロフォープの使用。
- 細動脈周囲の脂肪および結合組織の慎重な除去。
- 細動脈と細静脈の判別が不可欠である。
- 組織剥離顕微鏡下での単離した細動脈の観察。
主な結果
- 単離した細動脈の機能的特性を効果的に研究できる。
- 血管機能不全の病態生理に関する知見が得られた。
- 治療的介入のための潜在的な経路が特定された。
- 本手法は、疾患メカニズムの理解における臨床的妥当性を示した。
結論
- ビデオ顕微鏡法は、微小血管機能を研究するための貴重なツールです。
- この手法は、脂肪組織と全身性疾患との関連性を理解するのに役立ちます。
- 本手法により、新たな治療標的の発見につながる可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
この手法により、ヒト脂肪組織の微小血管系の直接的な機能評価が可能となり、肥満や代謝性疾患に関連する血管機能不全のメカニズム的な知見を得ることができます。貯蔵部位特異的な反応を比較することで、心血管系および代謝性疾患の治療薬開発におけるターゲットの検証とリスク低減を支援します。本アプローチは、内皮機能を評価するためのヒトに関連したシステムを提供し、前臨床から臨床へのトランスレーションに寄与します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的活用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：内皮細胞依存性の血管拡張経路を解析し、脂肪組織に起因する血管機能不全のメカニズムを明らかにする。
- 運用的価値：生体に近い圧力条件下で、ヒトの無傷の細動脈を用いて機能的な標的検証を可能にする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： アセチルコリンなどの血管拡張薬や血流介在性刺激に対する定量的な用量反応データを生成します。
- 運用の価値： 圧力制御ビデオ顕微鏡を用いた血管反応性アッセイを標準化し、再現性のある測定結果を得ることができます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 内臓脂肪蓄積を内皮機能不全に結びつけ、代謝性心血管リスクの疾患関連モデリングを裏付ける。
- 実用的価値： 介入に対する血管反応の縦断的評価を容易にし、予測バイオマーカーの評価を可能にする。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、代謝性疾患経路におけるメカニズムの結節点として脂肪組織の血管系を検証する初期探索段階に適合し、リード化合物の同定および前臨床段階での優先順位付けに寄与します。
- 発見生物学： ヒトの微小血管機能不全におけるエンドセリン-1およびアセチルコリン経路の仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 制御された管腔内圧および血流条件下で、再現性のある血管拡張測定を実現します。
- 分析： 直径変化の読み取り値を提供し、異なる部位や表現型における内皮機能の定量的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 脂肪組織の微小環境を全身の血管転帰へと結びつけ、リスク調整に基づいた推進上の意思決定を支援します。
- エンタープライズ再利用： 肥満、介入、および疾患モデルにおける血管表現型を評価するための、再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 内皮細胞特異的な応答を単離することで、脂肪組織と血管系のクロストークにおけるメカニズムの曖昧さを軽減する。
- 運用的価値： 圧力調節チャンバーとエッジ検出ビデオ顕微鏡により、標準化を確保する。
- 戦略的価値： ヒトに関連する微小血管環境で標的を検証することで、GO/NO-GO判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 内臓脂肪組織における内皮機能不全を標的とする化合物の、リスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 顕微鏡下での微小血管の解剖およびカニュレーションの専門知識が必要である。
- 圧力変換システム、ビデオキャプチャ機能付き倒立顕微鏡、およびエッジ検出ソフトウェアに依存する。
- 血管の調製、加圧プロトコル、および刺激投与について、チーム間での標準化が必要である。
- 異なる脂肪貯蔵部位および血管径の範囲（50–350 µm）に対する適応上の検討が含まれる。
- 分離後の血管の生存期間に制限があるため、迅速な実験遂行が求められる。
