三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

この手順の全体的な目的は、3次元の創傷関連フィブリン足場における細胞遊走に対し、関心のある特定の処理が及ぼす影響を観察することです。この手法は、繊維ネットワーク構造の変化が細胞遊走や創傷部位のフィブリン血栓にどのように影響するかという、創傷治癒分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法の主な利点は、3Dフィブリン血栓内での細胞遊走を分析するための、簡便で再現性の高い方法を提供することです。一般的に、この手法に不慣れな方は、スフェロイドの転移が困難であるため、苦労することがあります。

まず、凍結保存された新生児ヒト真皮線維芽細胞のバイアルを37 °Cの恒温水槽で加温します。細胞が解凍された直後に遠心分離で回収し、ペレットを新鮮な新生児ヒト真皮線維芽細胞培地を用いて1 x 10⁶ cells/mLの濃度で再懸濁します。その後、細胞をT75培養フラスコに播種し、37 °C、5% CO2条件下で72時間培養します。

培養細胞が80%コンフルエントに達したら、5 mLのtrypsin EDTAを用いて細胞を剥離させます。37 °Cで5分間置いた後、加温した培地5 mLでtrypsinを中和し、40 µLの細胞懸濁液とtrypan blueを1:1の比率で混合します。細胞計数用に10 µLのアリコートを分取して保持しておきます。

遠心分離により細胞を回収し、ペレットを1.25 x 10⁵ cells/mLの濃度で再懸濁します。次に、10 cmペトリ皿の底に5 mLの滅菌PBSを分注します。その後、ペトリ皿の蓋を反転させ、蓋の内表面に細胞懸濁液を20 µLずつ複数滴下します。

すべての液滴を滴下した後、吊り下げ液滴をずらさないように注意しながら蓋を皿に戻し、皿を37 degree celsiusのインキュベーターに静かに置いて72時間培養します。培養終了後、48ウェルプレートの各ウェルのスフェロイド1個あたり100 microlitersの凝血溶液を加え、プレートを静かに揺すって叩き、フィブリン凝血混合液がウェル全体を覆うようにします。その後、プレートをインキュベーターに1時間置いてください。

凝固層が重合したら、光学顕微鏡下で吊り滴培養中のスフェロイドの存在を確認し、48ウェルプレートと吊り滴培養用ディッシュを細胞培養フード内に移動させます。ペトリ皿の蓋を慎重に反転させて吊り滴培養にアクセスし、21ゲージの針を装着した1 mLシリンジを用いて、フィブリンコートされた各ウェルに1滴ずつ移します。スフェロイドの吸引と播種には細心の注意を払います。このプロセスにおいて最も困難で重要なステップは、スフェロイドを破壊せずに転移させることだからです。

顕微鏡下でプレートを観察し、スフェロイドが適切なウェルに正しく播種されていることを確認する。新鮮に調製した凝固溶液100マイクロリットルを、スフェロイドを含む各液滴の上に静かに重層し、再び顕微鏡下でスフェロイドを観察して、それらが依然として損なわれておらず、各ウェルの中心にあることを確認する。その後、48ウェルプレートをインキュベーターに戻し、2層目のフィブリンを重合させる。

1時間後、各ウェルに各スフェロイド実験群に応じた適切な培地を500 µL添加し、プレートを37 °Cのインキュベーターに戻します。明視野顕微鏡を用いて24〜72時間ごとにスフェロイドの画像を撮影し、Zスタックを用いて3D細胞培養の連続的な断面を観察します。その後、適切な画像解析ソフトウェアで、各時点における各スフェロイドの細胞境界をトレースし、計測機能を用いて各スフェロイドの面積増加率を算出します。

目的の促進剤または抑制剤を用いて培養した後、明視野顕微鏡イメージングによってスフェロイドの初期領域を特定し、これを基準として、各時点におけるスフェロイド本体からのその後の細胞遊出度を決定することができます。この代表的な実験では、遊走促進剤に曝露させたスフェロイドは、遊走抑制剤または対照剤に曝露させたスフェロイドと比較して、元のスフェロイド本体から離れる遊走度が有意に増加しました。逆に、遊走抑制剤に曝露させたスフェロイドは、対照処理したスフェロイドと比較して、元のスフェロイド本体から離れる遊走度が有意に減少しました。

この手法を習得し、適切に実施すれば、細胞培養時間を除いて2時間半で完了させることができます。このビデオを視聴することで、3次元in vitro細胞遊走アッセイに向けて、細胞スフェロイドをどのように培養し、包埋させるかについて十分な理解を得ることができるはずです。この手順に続き、組織学的解析や免疫組織化学などの他の手法を行うことで、血栓内のフィブリンネットワーク構造やスフェロイド細胞内のアクチン配向が、細胞遊走の増加または減少にどのように対応しているかという追加の疑問を明らかにすることが可能です。

細胞培養や針の取り扱いは極めて危険であるため、本手順を行う際は、適切な保護具の着用や無菌培養フード内での作業など、常に十分な予防策を講じてください。