上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル

このインベージョンアッセイの全体的な目標は、細胞を微小環境から引き離すことなく、3D設定で希少細胞と高感度細胞の遊走能力と侵襲能力を定量化することです。この方法は、がん細胞融合製品などのセンシティブイベントやオレイイベントの浸潤能力に関するがん研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、細胞が3D設定を使用して元の微小環境で分析されることです。

この技術の意味は、がん細胞の浸潤と転移を阻害できる薬理学的薬剤のスクリーニングに使用できるため、がんの治療にまで及びます。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。コラーゲン混合物の温度とpHの吸引は、その重合に影響を与え、乱暴な取り扱いによりゲルが剥離します。

まず、35mmの培養皿に10mmのガラス底ウェルに1ミリリットルの1モル塩酸を入れて処理し、ガラスの疎水性を低下させます。15分後、1回の洗浄で1ミリリットルのPBSでプレートを2回洗浄し、続いて1ミリリットルの70%エタノールで1回洗浄します。次に、使用する細胞に特異的な1ミリリットルの培地でプレートをすすぎます。

そして、目的の細胞をプレートに播種します。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。細胞が100%のコンフルエンシーに達したら、新たに調製したラットテールコラーゲン114.5マイクロリットル、10 X DMEM培地16.6マイクロリットル、および33.1マイクロリットルの培養培地に、目的の化学療法誘引剤を添加した培養培地を氷上のマイクロ遠心チューブに組み合わせます。

コラーゲン混合物を14マイクロリットルの重炭酸ナトリウムで中和し、細胞を80マイクロリットルのゲルで覆います。加湿した摂氏37度と5%の二酸化炭素インキュベーターでコラーゲンを重合させます。次に、ゲルの上に還元された2%血清細胞培養培地の2ミリリットルを重ね、コラーゲンを剥がさずに適切な実験時間の間、細胞を慎重にインキュベーターに戻します。

インキュベーションの終わりに、培地を静かに取り出し、1ミリリットルのPBSでゲルを注意深くすすいでください。細胞を1ミリリットルの4パーセントパラホルムアルデヒドで15分間固定し、続いて1回の洗浄につき1ミリリットルのPBSで2回洗浄します。次に、DAPI溶液で室温で20分間細胞を標識し、共焦点顕微鏡でin vitroの三次元コラーゲン浸潤を画像化します。

ここでは、48時間の移動期間にわたる化学療法誘引剤に応答した乳がん細胞株および乳がん細胞融合産物によるコラーゲンゲルへの浸潤の定量化が示されています。特に、化学療法誘引剤に応答して、まれな乳がん細胞融合産物がコラーゲンゲルに移動することも観察されました。この細胞は、ゲル重合後48時間で強固な細胞数とその形態が維持されていることからも明らかなように、コラーゲンゲル実験全体を通じて健康なままです。

この垂直コラーゲンゲルアッセイでは、Zシリーズの細胞移動と、その場で捕捉される移動細胞の形態をイメージングすることにより、浸潤時の細胞移動の動態を分析することもできます。この手順を試みるときは、顕微鏡と互換性のある培養皿を使用することを忘れないでください。この手順に続いて、コラーゲンの強度を変更したり、異なる化学療法誘引剤を使用したりするなどの他の変数を導入して、ECMエンゲージメントが細胞浸潤に及ぼす影響、または異なる化学療法誘引剤が細胞浸潤に及ぼす影響に関する追加の質問に答えることができます。

その開発後、この技術は、生物学と癌の分野の研究者が転移の薬理学的阻害剤をスクリーニングし、in vivoでのすべての炎症反応における創傷治癒を探求する道を開きました。このビデオを見れば、3D設定で、微小な関与で細胞を歪めることなく、希少細胞や感受性細胞の遊走能力と侵襲性を評価する方法を十分に理解できるはずです。人間の癌細胞、塩酸、パラホルムアルデヒド、およびDAPIと一緒に歩くことは非常に危険であり、この手順を実行するときは、ナンバー2のバイオ浄化槽キャビネットやヒュームホールドを使用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。