上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル
2018年3月12日
このプロトコルでは、細胞の微小環境を維持しながら三次元の設定のセルの移行と侵略の機能を定量化に使用できる反転垂直浸潤能の測定法について説明します。この試金は稀および/または敏感な細胞に適しています。
このインベージョンアッセイの全体的な目標は、細胞を微小環境から引き離すことなく、3D設定で希少細胞と高感度細胞の遊走能力と侵襲能力を定量化することです。この方法は、がん細胞融合製品などのセンシティブイベントやオレイイベントの浸潤能力に関するがん研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、細胞が3D設定を使用して元の微小環境で分析されることです。
この技術の意味は、がん細胞の浸潤と転移を阻害できる薬理学的薬剤のスクリーニングに使用できるため、がんの治療にまで及びます。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。コラーゲン混合物の温度とpHの吸引は、その重合に影響を与え、乱暴な取り扱いによりゲルが剥離します。
まず、35mmの培養皿に10mmのガラス底ウェルに1ミリリットルの1モル塩酸を入れて処理し、ガラスの疎水性を低下させます。15分後、1回の洗浄で1ミリリットルのPBSでプレートを2回洗浄し、続いて1ミリリットルの70%エタノールで1回洗浄します。次に、使用する細胞に特異的な1ミリリットルの培地でプレートをすすぎます。
そして、目的の細胞をプレートに播種します。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。細胞が100%のコンフルエンシーに達したら、新たに調製したラットテールコラーゲン114.5マイクロリットル、10 X DMEM培地16.6マイクロリットル、および33.1マイクロリットルの培養培地に、目的の化学療法誘引剤を添加した培養培地を氷上のマイクロ遠心チューブに組み合わせます。
コラーゲン混合物を14マイクロリットルの重炭酸ナトリウムで中和し、細胞を80マイクロリットルのゲルで覆います。加湿した摂氏37度と5%の二酸化炭素インキュベーターでコラーゲンを重合させます。次に、ゲルの上に還元された2%血清細胞培養培地の2ミリリットルを重ね、コラーゲンを剥がさずに適切な実験時間の間、細胞を慎重にインキュベーターに戻します。
インキュベーションの終わりに、培地を静かに取り出し、1ミリリットルのPBSでゲルを注意深くすすいでください。細胞を1ミリリットルの4パーセントパラホルムアルデヒドで15分間固定し、続いて1回の洗浄につき1ミリリットルのPBSで2回洗浄します。次に、DAPI溶液で室温で20分間細胞を標識し、共焦点顕微鏡でin vitroの三次元コラーゲン浸潤を画像化します。
ここでは、48時間の移動期間にわたる化学療法誘引剤に応答した乳がん細胞株および乳がん細胞融合産物によるコラーゲンゲルへの浸潤の定量化が示されています。特に、化学療法誘引剤に応答して、まれな乳がん細胞融合産物がコラーゲンゲルに移動することも観察されました。この細胞は、ゲル重合後48時間で強固な細胞数とその形態が維持されていることからも明らかなように、コラーゲンゲル実験全体を通じて健康なままです。
この垂直コラーゲンゲルアッセイでは、Zシリーズの細胞移動と、その場で捕捉される移動細胞の形態をイメージングすることにより、浸潤時の細胞移動の動態を分析することもできます。この手順を試みるときは、顕微鏡と互換性のある培養皿を使用することを忘れないでください。この手順に続いて、コラーゲンの強度を変更したり、異なる化学療法誘引剤を使用したりするなどの他の変数を導入して、ECMエンゲージメントが細胞浸潤に及ぼす影響、または異なる化学療法誘引剤が細胞浸潤に及ぼす影響に関する追加の質問に答えることができます。
その開発後、この技術は、生物学と癌の分野の研究者が転移の薬理学的阻害剤をスクリーニングし、in vivoでのすべての炎症反応における創傷治癒を探求する道を開きました。このビデオを見れば、3D設定で、微小な関与で細胞を歪めることなく、希少細胞や感受性細胞の遊走能力と侵襲性を評価する方法を十分に理解できるはずです。人間の癌細胞、塩酸、パラホルムアルデヒド、およびDAPIと一緒に歩くことは非常に危険であり、この手順を実行するときは、ナンバー2のバイオ浄化槽キャビネットやヒュームホールドを使用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
本プロトコルでは、細胞の微小環境を維持しつつ、三次元的な設定において希少かつ感受性の高い細胞の遊走能および浸潤能を定量化する、逆方向垂直浸潤アッセイについて解説します。この手法は、特にがん研究において有用です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞遊走
- がん研究
- 浸潤アッセイ
背景
- このアッセイにより、細胞を元の微小環境における状態で解析することが可能です。
- 希少で感受性の高い細胞向けに設計されています。
- 細胞浸潤の理解は、がん治療の開発において極めて重要です。
- 適切な実施のためには、本手法の視覚的な実演が不可欠です。
研究目的
- 細胞の遊走能および浸潤能を定量化すること。
- 感受性細胞の浸潤能力を探索すること。
- がん細胞の浸潤および転移を抑制する薬理学的剤をスクリーニングすること。
使用された手法
- 逆転垂直浸潤アッセイ
- 三次元細胞培養
- 微小環境における細胞解析
- コラーゲン重合に対する温度およびpHの影響評価
主な結果
- 3D環境における細胞挙動を分析する能力を実証した。
- 細胞微小環境を維持することの重要性を強調した。
- がん細胞の浸潤能力に関する知見を提供した。
- 治療薬スクリーニングへの可能性を示した。
結論
- このアッセイは、がん研究における有用なツールである。
- 感作細胞の微小環境を保持することができる。
- がんの浸潤および転移を標的とした治療法の開発に寄与し得る。
よくある質問
産業上の重要性
本アッセイにより、バイオ医薬品の研究開発チームは、天然の細胞-ECM相互作用を損なうことなく、生理学的に適切な3D微小環境において、希少で感受性の高い細胞モデルの浸潤能を評価することが可能になります。元の細胞ニッチを維持することで、本手法は転移関連ターゲットのメカニズムに基づくリスク低減をサポートし、初期段階のターゲットバリデーションにおける予測信頼性を向上させます。これにより、従来のアッセイでは微小環境の完全性が損なわれていたという前臨床スクリーニングにおける重大な課題が解決され、創薬からリード最適化に至るトランスレーショナルな連続性が強化されます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： 天然の微小環境条件下で、希少な細胞モデルや融合由来の細胞モデルにおける浸潤を評価することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 実用的価値： 細胞の変位によって生じるアーティファクトによるばらつきを低減し、実験間での浸潤表現型の再現性を向上させる。
- 予測的価値： 3Dコンテキストにおいて分子的な摂動と機能的な浸潤結果を関連付けることで、ターゲットのリスク低減をサポートする。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備状態：ハイコンテンツイメージングおよび自動解析ワークフローと互換性のある、標準化された定量的な浸潤指標を算出します。
- 再現性：アッセイセットアップ中の細胞層の機械的破壊を排除することで、ウェル間のばらつきを最小限に抑えます。
- 拡張性：さまざまなコラーゲン濃度や化学走化性因子に対応しており、転移抑制剤の構造活性相関（SAR）研究が可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性： In vivoにおける間質・腫瘍相互作用を反映した線維芽細胞・上皮ハイブリッド細胞を用いて、ヒトがんの浸潤をモデル化します。
- トランスレーショナルな連続性： 浸潤挙動に不可欠な微小環境の手がかりを維持することで、in vitroでの知見を前臨床検証へと橋渡しします。
- リスク調整後の意思決定： 機能的な浸潤データを提供することで、不十分な微小環境モデリングに起因する後期段階での失敗確率を低減し、標的や化合物の優先順位付けを可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本アッセイは、初期のターゲットバリデーションからリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、転移関連プログラムにおいて、Boyden Chamberやトランスウェルシステムに代わる微小環境保持型の選択肢を提供します。
- 探索生物学：生理的なコラーゲンゲル内での細胞遊走のリアルタイムz-stackイメージングを可能にすることで、浸潤経路の仮説主導的な検証をサポートします。
- スクリーニング：特にECMリモデリングや化学走性のシグナル伝達を標的とする薬剤などの化合物ライブラリースクリーニングに適した、浸潤エンドポイントデータを提供します。
- 分析：浸潤細胞数の定量化および形態計測学的解析を可能にし、構造と機能の相関に関するマルチパラメトリックなリードアウトを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：MSC-がんハイブリッドを用いてストローマ介在性の浸潤をモデル化し、バイオマーカーに関連したメカニズム研究をサポートします。
- 企業的な再利用：さまざまながん種やストロマ共培養に適応可能であり、転移や創傷治癒プログラムにおけるプラットフォームの再利用を促進します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：微小環境の破壊による偽陽性を減少させ、ターゲットバリデーションの信頼性を向上させます。
- 運用の価値：標準化されたゲルの重合およびオーバーレイプロトコルを通じて、アッセイの堅牢性を高めます。
- 戦略的価値：パイプラインの早期段階で生理学的に関連のある浸潤データを提供し、go/no-go判断の質を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：機能的な3D浸潤プロファイルに基づき、転移抑制剤のリスク層別化した推進を可能にします。
実施上の考慮事項
- 正確な浸潤量の定量化には、3D細胞培養および共焦点顕微鏡観察の専門知識が必要です。
- 一貫したゲルの重合を確実にするため、コラーゲン調製時の正確な温度およびpH制御が重要となります。
- 再現性のある化学走性を得るためには、化学走因子の投与量の標準化および低血清培地条件が必要です。
- 代替ECMタンパク質（Matrigel、フィブリンなど）への適応には、ゲル化速度および濃度の最適化が必要になる場合があります。
- 本手法は、ゲルオーバーレイを上方へ浸潤できる接着性または半接着性細胞に限定されます。非接着性懸濁細胞に使用する場合は、条件の変更が必要な可能性があります。
