Name: 上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 学ぶinverted vertical invasion assayを用いた3次元細胞培養による希少で感受性の高い細胞の移動・浸潤能力の定量化。この手法はがん研究における微小環境を保持した侵襲性解析と薬剤スクリーニングに有用です。

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この作品は、ジャクソン州立大学と米国防、アイデア賞 11-1-0205 部環境衛生 RCMI センターを通じて健康の国民の協会 (NIMHD G12MD007581) によって支えられました。

注: このプロトコルは、McArdleらに説明します。11します。図 1のタイムラインを提供します。
1. 培養プレートの準備
<ol><li>ガラス底の疎水性を下げるための 15 分の 1 M 塩酸 (HCl) 1 mL と 10 mm のガラス底を含む 35 mm の培養皿を洗ってください。</li>
	<li>リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) すべての HCl を取り除くために 1 mL で 2 回培養プレートを洗います。</li>
	<li>文化の 70% エタノール 1 mL を 2 回洗浄します。</li>
	<li>1 ml の細胞特定の培地の培養プレートをリンス (ここでは、使用 α-MEM 10% 熱を添加した不活性 FBS と 1% 非必須アミノ酸)。 注:次の日まで加湿器では 37 ° C で CO2インキュベーターで培養液を含む処理培養プレートを格納できます。</li>
	<li>35 mm ディッシュの扱われたガラス底に細胞 (MSCs と MCF 7 共培養) を 100% の confluency に成長します。35,000 MSC 細胞および 75,000 24 h MCF7 細胞の共培養します。</li>
</ol>2. コラーゲン ゲルの調製
<ol><li>接触時にコラーゲンの重合を防ぐために冷凍庫にコラーゲン ・ ゲルをピペッティング用マイクロ ピペットのヒントを格納します。 注:これは、最も重要なステップです。</li>
	<li>ボリュームを決定するラット尾コラーゲンのため私はコラーゲン株式の濃度に基づきます。この試金のためのコラーゲン ・ ゲルの 100 μ L を準備します。 注:私は在庫ありラット尾コラーゲンの高濃度が適しています。それに応じてコラーゲンを希釈に使用するダルベッコ変更イーグル培地 x 10 のボリュームを決定します。</li>
	<li>私 (3.8 μ g/mL 在庫)、10 x ダルベッコ変更されたワシの媒体および 1 x 細胞培養液 2% 牛胎児血清と 2.4 mg/mL のコラーゲンの最終的な集中に適切な走化性因子を添加した氷ラット尾コラーゲンを結合します。</li>
	<li>コラーゲン ・ ゲルを中和するために重炭酸ナトリウム溶液の混合物の 4.5% に追加します。 注:重炭酸ナトリウム溶液を追加のボリュームは他の試薬の正確な pH によって異なります。中性の溶液を確保するか、培地の pH 指示薬を使用して pH のストリップとの混合物をテストすることをお勧めします。</li>
	<li>ガラス底培養皿の中で細胞をコラーゲン混合物の 80 μ L を横たわっていた。</li>
	<li>加湿器では 37 ° C で CO2インキュベーターで 30 分間重合コラーゲン ゲルを許可します。</li>
	<li>減らされた血清 (2%) と細胞用培地 2 mL でコラーゲン ・ ゲルをカバーし、24、48、72 時間に加湿器で CO2インキュベーターで 37 ° C でセルを孵化させなさい。 注意:プレートは、ガラス底から切り離す、コラーゲン ・ ゲルを防ぐために慎重に取り扱う必要があります。</li>
</ol>3. コラーゲンの準備の例は、3.8 μ g/mL のラット尾コラーゲン在庫を使用してゲルします。
<ol><li>氷上では、ラット尾コラーゲンの 114.5 μ L、DMEM、x 10 の 16.6 μ L と、走化性因子を含む培地の 33.1 μ L を組み合わせます。</li>
	<li>重炭酸ナトリウム 14.0 μ L でコラーゲン混合物を中和します。</li>
	<li>手順 2.5 のように続けます。</li>
</ol>4. 細胞のイメージング
<ol><li>そっとお皿からメディアを削除します。</li>
	<li>1 ml の PBS のゲルを軽くすすいでください。</li>
	<li>15 分 4% パラホルムアルデヒドの ml の 1 セルを修正します。</li>
	<li>1 mL の PBS で 2 回細胞を洗浄します。</li>
	<li>DAPI 溶液 (100 ng/mL) 室温で 20 分間と細胞を染色します。</li>
	<li>共焦点の顕微鏡を使用して、別の場所での撮影 400 μ m z スタック 16 μ m ステップの各位置のセルをイメージします。顕微鏡の使用により、白色光、アーク励起源を用いた共焦点イメージング ユニットをスキャン ディスクがあります。0.75 の開口で利用されている 20 倍レンズを使用します。</li>
	<li>画像を再構築します。<ol>
<li>与えられたゲル (約 25 画像) の画像を開き、イメージ → スタック → 画像のスタックをクリックして画像のスタックを作成します。ゲルの底に対応した最初のイメージ (z = 0 μ m)、2 番目のイメージは、z 方向の最初のステップに対応した (z = 16 μ m)、z 方向の 2 番目のステップに対応した 3 番目のイメージ (z = 32 μ m)。それぞれのイメージの深さに核を評価し、核はその特定のセルの侵入深さが鮮明で焦点に深さを指定します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Brocker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+cell+locomotion+within+three-dimensional+extracellular+matric%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).</li>
<li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+architecture%3A+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).</li>
<li>Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell+migration+assay+using+scratch+wound+healing%2C+a+comparison+of+image-based+readout+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods.</a> BMC Biotechnol. 4, 21(2004).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration%3A+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).</li>
<li>Sahai, E., Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differing+modes+of+tumour+cell+invasion+have+distinct+requirements+for+Rho%2FROCK+signalling+and+extracellular+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis.</a> Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).</li>
<li>Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+circular+invasion+assay+mimics+in+vivo+invasive+behavior+of+cancer+cell+lines+and+distinguishes+single-cell+motility+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro.</a> BMC Cancer. 8, 198(2008).</li>
<li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).</li>
<li>Poujade, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).</li>
<li>Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis-induced+cancer+cell+fusion%3A+a+mechanism+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis.</a> FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).</li>
<li>McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vitro+Inverted+Vertical+Invasion+Assay+to+Avoid+Manipulation+of+Rare+or+Sensitive+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types.</a> J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).</li>
<li>Noubissi, F. K., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Cell+Fusion%3A+Mechanisms+Slowly+Unravel%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel.</a> Int J Mol Sci. 17, (2016).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).</li>
<li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+migration+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).</li>
<li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat Materials. 13, 645-652 (2014).</li>
</ol>

著者は、競合する関心が存在しないことを宣言しています。

ここでは、様々 な細胞などの微小環境に依存したり、まれにあるセルに便利です簡単な反転垂直浸潤能の測定法について述べる.この 3 D 浸潤アッセイの細胞は彼らの元の微小環境の維持し、走化性因子を含むコラーゲン ゲルで覆われています。セルは移行し、コラーゲンに侵入します。このアッセイで細胞を染色し、ゲル内で簡単に監視できます。シンプルさとこのアッセイの再現性は、3 D システムでがん細胞の遊走・浸潤を勉強するための便利なツールとなります。ただし、強い塩基は培養皿の底に細胞親和性を破るに必要と思われます。
35 mm ディッシュの倒立垂直浸潤能の測定を最適化されています。この培養皿は 10 mm のガラス底もイメージングも装備されています。この培養皿の 1 つの制限は、分析を実行するために必要なコラーゲン ・ ゲルのかなりの量です。イメージングと互換性のあるデザインを見つける小さい培養皿はより経済的になります。35 mm ディッシュ デザインの適切なゲル層はその強さのため非常にデリケートで、慎重に処理をされないとプレートの底からデタッチすることができます簡単に。別のセルの文化デザインがコ...

細胞運動は細胞の正常発達的および生理学的プロセスです。ただし、パターンと移行し、侵入する細胞の能力の変化は、炎症性疾患、がん転移1,2,3などの病態に関連付けられます。転移がんで最も悪い理解の側面といえます。転移、がん細胞は細胞外マトリックス (ECM) が低下する、ローカル組織および intravasate に侵入する必要があります。循環では、がん細胞は、遠くのサイトに発信する、extravasate、二次性腫瘍を形成します。したがって、能力 ECM を低下させる細胞の移行して侵入するが、転移能に関連します。異なるアプローチは、分析、細胞の移行と侵略の機能を定量化して開発されています。最もよく使われる方法には、創傷治癒の試金、微速度顕微鏡観察、ボイデン室アッセイが含まれます。創傷治癒の試金4と時間経過顕微鏡検査、細胞遊走に予備的な洞察力を与えるだろう簡単で便利な試金。ただし、細胞が生体内で存在する 3 D 環境を反映して 2 D の試金はどちらも。研究では、細胞が 2 D 15,6と比較して 3 D 環境に異なる反応することを示しています。さらに、創傷治癒の試金は再現し、量的な結果7,8,9をもたらす困難です。創傷治癒のアッセイの 3 D の変更、セルの除外ゾーンの試金はもっと生理学的に関連するアッセイが細胞融合イベント10,11 から生じるハイブリッド細胞など数の少ないセルに適していません.
ボイデン室アッセイは、細胞研究関連微小を提供する 3 次元試金です。ただし、セルの元の微小環境から削除して移行し、走化性因子含む培地に向かって下方に侵入・ ボイデン ・ アッセイ系の上部室に預けられるが必要です。この 3 D のアプローチは細胞の微小環境やで限定数10、11,12に脆弱性の移行および侵略の機能の分析に適していません。細胞の遊走・浸潤を分析する新しいアプローチは、マイクロ流路勾配商工会議所アッセイ13です。適した、移行および侵略の研究の信頼できる、この試金はより高価な典型的な実験室の技術的に困難な場合が。ここで、微小環境に敏感な細胞を含む多くの細胞の種類と互換性があるおよび/または数の制限は、単純な反転垂直浸潤アッセイについて述べる。この試金はフーパーらによって提案されたプロトコルから適応されました。14します。 この分析では、セルのまま彼らの元の環境での移行と侵略が走化性因子の11を含むコラーゲン ・ ゲル内上方に移動ことを監視します。この試金は再現はされて最適化し、35 mm ディッシュで検証します。それは、異なるセル文化のサイズ、異なるマトリックス付着、および異なる塩基の強さなどさまざまな分析条件に適応できます。この試金は、創薬プロセスの初期スクリーニングのための in vitroプラットフォームとして役立つことができます。

<table><tbody><tr><td>MatTek P35G-1.5-10C</td><td>MatTek Corporation、マサチューセッツ州アッシュランド</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>Mattekガラスボトムディッシュ</td></tr><tr><td>ラットテールコラーゲンI</td><td>コーニング、コーニング、ニューヨーク、アメリカ</td><td></td><td>354236 コラーゲンゲル</td></tr>塩<tr><td>酸</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州 63178 USA</td><td>H1758</td><td>HCl</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.、マサチューセッツ州ウォルサム、アメリカ</td><td>10010023</td><td>PBSの</td></tr><tr><td>10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>D2429</td><td>10X DMEM</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>共焦点蛍光顕微鏡</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, USA</td><td>Olympus IX81</td><td>Confocal&nbsp; microscope</td></tr><tr><td>Defined Fetal Bovine Serum</td><td>GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA</td><td>SH30070.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Ti:Sapphire 多光子レーザー走査顕微鏡</td><td>Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA</td><td>40x NA 0.8 objective</td><td>MPLSM</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane Inc. Zurich, CH</td><td>Imaris 7.5.2</td><td>Imaris software</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA</td><td>50980487</td><td>PFA</td></tr><tr><td>&alpha;-minimum essential medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA</td><td>M0894</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC;マナサス、バージニア州、米国</td><td>HBT-22</td><td></td></tr><tr><td>MSC</td><td>Trivedi and Hematti、2007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X レンズ UPLAPO</td><td>オリンパスアメリカ、センターバレー、ペンシルベニア州、米国</td><td>36-064</td><td>オリンパス UPLSAPO 20X 対物レンズ</td></tr></tbody></table>

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Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

3 D 浸潤アッセイを開発しているが、その微小環境の整合性に影響を与えずに細胞を研究課題が残っています。ボイデン室必要セルが元の文化場所から避難して、新しい環境に移動するなど、従来の 3次元の試金します。だけでなく、これが、微小環境に固有な細胞プロセスを混乱させる、それは多くの場合細胞の損失の結果します。まれ、かの微小環境に非常に敏感な細胞を扱うとき、これらの問題は特に挑戦的です。ここでは、両方の問題を回避する 3 D 浸潤能の測定法の開発について述べる.この分析では、小規模でも細胞をめっきし、走化性因子を含む ECM 行列をセルの上に置いた。これはセル変位を必要としない、上向きマトリックスへの侵入セルをできます。このアッセイでは、細胞の形態と同様、細胞浸潤は、コラーゲン ・ ゲル内で評価できます。この試金を使用して、我々 は稀で、敏感な細胞の侵襲的な容量を特徴付ける乳癌細胞 MCF7 と間葉系/多能性の融合から生じるハイブリッド細胞幹/間質細胞 (MSCs)。

ガラス下部およびラット尾コラーゲン入り 35 mm 培養皿を用いて開発し、生体外で3 D 侵略を最適化する私はプロトコルを試金。我々 は癌細胞 MCF7 と MSC 胸を示したこのアッセイを使用して細胞が 0.04 ± 1.8 μ m、μ m ± 76.0 41.3 平均距離にコラーゲン ・ ゲルに 48 時間後それぞれ侵入しとき IGF1 (18.6 ng/mL) は、走化性因子 (図 2) として使用されました。さらに、希少な細胞である MSC と MCF7 細胞融合製品が同様のコラーゲンゲルに侵入する可能性を示した。IGF 18.6 ng/mL で私として使用した場合、48 h で侵略の彼らの平均距離は μ m ± 12.4 10.7 走化性因子 (図 2)。MCF7 と MSCs 侵攻能力の差は有意 (P &lt; 0.01)11。融合製品の侵攻能力と MCF7 または MCSs ...

このプロトコルでは、細胞の微小環境を維持しながら三次元の設定のセルの移行と侵略の機能を定量化に使用できる反転垂直浸潤能の測定法について説明します。この試金は稀および/または敏感な細胞に適しています。

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Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

このインベージョンアッセイの全体的な目標は、細胞を微小環境から引き離すことなく、3D設定で希少細胞と高感度細胞の遊走能力と侵襲能力を定量化することです。この方法は、がん細胞融合製品などのセンシティブイベントやオレイイベントの浸潤能力に関するがん研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、細胞が3D設定を使用して元の微小環境で分析されることです。この技術の意味は、がん細胞の浸潤と転移を阻害できる薬理学的薬剤のスクリーニングに使用できるため、がんの治療にまで及びます。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。コラーゲン混合物の温度とpHの吸引は、その重合に影響を与え、乱暴な取り扱いによりゲルが剥離します。まず、35mmの培養皿に10mmのガラス底ウェルに1ミリリットルの1モル塩酸を入れて処理し、ガラスの疎水性を低下させます。15分後、1回の洗浄で1ミリリットルのPBSでプレートを2回洗浄し、続いて1ミリリットルの70%エタノールで1回洗浄します。次に、使用する細胞に特異的な1ミリリットルの培地でプレートをすすぎます。そして、目的の細胞をプレートに播種します。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。細胞が100%のコンフルエンシーに達したら、新たに調製したラットテールコラーゲン114.5マイクロリットル、10 X DMEM培地16.6マイクロリットル、および33.1マイクロリットルの培養培地に、目的の化学療法誘引剤を添加した培養培地を氷上のマイクロ遠心チューブに組み合わせます。コラーゲン混合物を14マイクロリットルの重炭酸ナトリウムで中和し、細胞を80マイクロリットルのゲルで覆います。加湿した摂氏37度と5%の二酸化炭素インキュベーターでコラーゲンを重合させます。次に、ゲルの上に還元された2%血清細胞培養培地の2ミリリットルを重ね、コラーゲンを剥がさずに適切な実験時間の間、細胞を慎重にインキュベーターに戻します。インキュベーションの終わりに、培地を静かに取り出し、1ミリリットルのPBSでゲルを注意深くすすいでください。細胞を1ミリリットルの4パーセントパラホルムアルデヒドで15分間固定し、続いて1回の洗浄につき1ミリリットルのPBSで2回洗浄します。次に、DAPI溶液で室温で20分間細胞を標識し、共焦点顕微鏡でin vitroの三次元コラーゲン浸潤を画像化します。ここでは、48時間の移動期間にわたる化学療法誘引剤に応答した乳がん細胞株および乳がん細胞融合産物によるコラーゲンゲルへの浸潤の定量化が示されています。特に、化学療法誘引剤に応答して、まれな乳がん細胞融合産物がコラーゲンゲルに移動することも観察されました。この細胞は、ゲル重合後48時間で強固な細胞数とその形態が維持されていることからも明らかなように、コラーゲンゲル実験全体を通じて健康なままです。この垂直コラーゲンゲルアッセイでは、Zシリーズの細胞移動と、その場で捕捉される移動細胞の形態をイメージングすることにより、浸潤時の細胞移動の動態を分析することもできます。この手順を試みるときは、顕微鏡と互換性のある培養皿を使用することを忘れないでください。この手順に続いて、コラーゲンの強度を変更したり、異なる化学療法誘引剤を使用したりするなどの他の変数を導入して、ECMエンゲージメントが細胞浸潤に及ぼす影響、または異なる化学療法誘引剤が細胞浸潤に及ぼす影響に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、生物学と癌の分野の研究者が転移の薬理学的阻害剤をスクリーニングし、in vivoでのすべての炎症反応における創傷治癒を探求する道を開きました。このビデオを見れば、3D設定で、微小な関与で細胞を歪めることなく、希少細胞や感受性細胞の遊走能力と侵襲性を評価する方法を十分に理解できるはずです。人間の癌細胞、塩酸、パラホルムアルデヒド、およびDAPIと一緒に歩くことは非常に危険であり、この手順を実行するときは、ナンバー2のバイオ浄化槽キャビネットやヒュームホールドを使用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは、蛍光ベースの方法論を用いて細胞培養用インサートを介して細胞の浸潤を測定する方法を示しています。...

アン試験管内でフルオロブロックの腫瘍の浸潤アッセイ

三次元細胞外マトリックスへの腫瘍細胞の浸潤のモデルより反映...

モデリングとイメージング、3次元の集団細胞浸潤

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インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

この資料は、乳癌細胞の浸潤を定量化するための3次元（3D）のアッセイの使用のための詳細な方法論を提供する。具体的には、細胞が侵入したときに発生する膜の完全性の喪失を検査するためにこのようなアッセイ、定量化、およびデータ分析だけでなく、メソッドを設定するために必要な手順を説明します。...

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上皮から間葉への移行(EMT)は、癌が浸潤性になることを可能にします。EMTを調査するために、血清と酵素を欠いた神経幹細胞(NSC)ベースのinvitroモデルが記載されています。この標準化されたシステムにより、細胞遊走、遺伝子およびタンパク質発現の定量的および定性的な評価が可能になります。創薬に適したモデルです。...

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

膀胱癌の浸潤を支配するプロセスは、バイオ マーカーと治療開発のための機会を表します。腫瘍の回転楕円体、タイムラプス イメージングと共焦点顕微鏡の...

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現在のプロトコルでは、がん細胞の遊走とリアルタイムで単一のプラットフォームに侵略を調査、細胞の移動と形態の勉強を簡単に再現できると時間効率の良いオプションを提供する統合的な手法について説明します。...

自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー

このアッセイは、3Dコラーゲンゲルで培養した胚様体に分化したマウス胚性幹細胞を利用して、 in...

インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ

浸潤は、がんの発生と進行における主要な生物学的現象です。このプロセスは、腫瘍微小環境の非腫瘍性細胞および成分の影響を受けます。この研究の目的は、三次元(3D)培養を使用して in vitro...

3D培養物へのIn vitro細胞浸潤を解析するための代替戦略

学ぶinverted vertical invasion assayを用いた3次元細胞培養による希少で感受性の高い細胞の移動・浸潤能力の定量化。この手法はがん研究における微小環境を保持した侵襲性解析と薬剤スクリーニングに有用です。

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