Name: 顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学ぶ上皮細胞単層の人工創傷法による創傷治癒過程における細胞移行の定量的・定性的評価。共焦点顕微鏡を用いて分子マーカー挙動と相関させ、創傷治癒メカニズムの解明や創薬スクリーニングに応用する。

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改善し、実際の状態にこれらのテクニックを絞り込むに役立つ演習の古いメンバーに感謝したい: 博士シーリア ・ マルティネス-モーラ;博士アンナ Mrowiec、博士カタリナ ルイス自慢、博士アントニア ・ アルカラス ガルシア。これらの技術の開発を強く支援病院臨床ウニベルシタリオ ビルゲン デ ラ Arrixaca にお世話になっております。セルバンテス ・ デ ・またサラッド カルロス 3 世、フォンド ・ デ ・研究 Sanitarias。Estatal を計画私 + D + 私とセルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III Subdirección 一般 06 y 開発デ ラ危惧 (許可番号: PI13/00794);www.isciii.es. Fondos ・ フェダー「Una manera デ hacer エウロパ」。我々 も行政も支援をグァテマラ ・ デ ・ ムルシア、IMIB Arrixaca、外国金融機関に感謝します。最後に、我々 は博士イサベル ・ マルチネス-Argudo と Facultad デ芸術報 Ambientales y Bioquímica、キャンパス ′ デ ラ Fábrica デ アルマス、グァテマラ カスティーリャ ・ ラ ・ マンチャ州、トレド喜んで譲ることで彼らの親切なサポートのおかげでスペシャルを与えたい、バイオ医薬品と本稿の撮影の一部を実現するためのバイオ テクノロジー研究室。

1. 人工傷スクラッチ アッセイ定量的研究
<ol>
	<li>セル膜の準備
	<ol>
		<li>無菌状態の下で働いて、シードし、血清添加培地を用いた培養フラスコに Mv1Lu または HaCaT 上皮細胞を成長します。一度、すべての 24-48 h 媒体を更新します。電池が 80% の合流点に達する後、適切な方法、すなわちtrypsinization9を使用してセルをデタッチします。 注: Mv1Lu と実装された EMEM と DEMEM の培養液を使用して上皮細胞株を培養している HaCaT それぞれ 2 mM L-グルタミンを添加したし、5% CO2の制御された雰囲気と 37 ° C で培養しました。すべての細胞株は細胞濃度と完全 confluency に達するに必要なタイミングを決定する徹底的に試金する必要があります。通常 Mv1Lu または HaCaT 細胞の x 10 の4または 104細胞/ウェル、x 4-6 2 4 それぞれがシード 175 cm2培養用フラスコのと最大 35 x 106 Mv1Lu または 1 × 107 HaCaT 細胞 80% で合流点が得られます。</li>
		<li>どちらかの 12、または 24 ウェル培養プレートの各ウェルの細胞の 2 mL の種子します。すべて 24-48 h. 確認セル番号が 2 または 3 日後 100% の合流点に到達するために十分に高い媒体を更新します。</li>
		<li>細胞に達すると合流、血清添加培地を取り除き、新鮮な無血清培地で 2 回洗います。スクラッチ前に 24 h の無血清培地で細胞を保ちます。 注: Mv1Lu または HaCaT 細胞に特殊な基板の要件はありません。ただし、セルライン無血清条件下で自発的にデタッチに影響を受けやすいためポリ L リジン溶液を用いた培養プレート面の塗装の前処理する必要があります10と見なされます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>単分子膜傷
	<ol>
		<li>しっかりと 20 μ L またはスクラッチの幅に応じて、200 μ L 滅菌ピペット先端の狭い端をドラッグして文化単層をスクラッチ無菌環境で作業します。先端のギャップの均質性を最大化する文化面に垂直を維持します。<ol>
			<li>明らかに単層細胞を監視する暗い表面上培養皿に置きます。必要な場合は、各ウェル 4 移行の領域まで勉強するの (十字型) 2 つの垂直の傷を実行します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>軽く培と優しく追加新鮮な無血清培地を削除して剥離細胞を洗ってください。2 回繰り返す最も接続されていないセルを削除するまで、または。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>実験の手順とデータ収集
	<ol>
		<li>まあ CCD カメラを組み込んだ倒立位相差顕微鏡を使用して各からスクラッチのギャップを中心とした最大 4 前処理参照画像を取る。傷の隣接する交差点に顕微鏡フィールドの端を合わせて、関心領域を選択します。 注: 通常、画像を用いている 10 倍の倍率、1,280 x 1,024 ピクセルのイメージ サイズ。前述のローカライズを容易およびウェルあたり最大 4 測定法の検証のために役立ちますようの関心領域を選択します。</li>
		<li>一度すべての画像を取得、指定治療井戸;選択した治療法を含む新鮮な培地で井戸に培地を交換します。 注: また、化学物質や培養液の均質性を邪魔しないで化合物は、治療できます再接種される培養液に直接。</li>
		<li>観測範囲 90% スクラッチ ギャップ閉鎖条件まで傷プレート (5% CO2を含む制御された雰囲気の 37 ° C) を孵化させなさい。完全な閉鎖を避けるため。 注: 合計ギャップ閉鎖の後処理の画像コレクションを無効リファレンス領域が検出されないし、ギャップの閉鎖のために参照を確立できません。Mv1Lu または HaCaT 細胞の場合 16-19 h は 90% の合流点に到達する必要があります。</li>
		<li>したセルを固定することによって細胞遊走を停止します。優しく実験の培養液を 1 mL の PBS で 4% ホルマリンに置き換えます。室温 15 分間インキュベートします。</li>
		<li>過剰なホルマリンは; を削除するセルを洗浄して軽く新鮮な PBS の井戸にソリューションを取り付けます。2 回以上を繰り返します。 注: この段階で封止後プレートが 4 ° C で不明確に保存されます。</li>
		<li>傷後キャプチャ元の参照領域から各ウェルの治療後の参照画像を取る。同じ機器 (倒立光学位相差顕微鏡 CCD カメラを組み込んだ) と一致する画像の設定 (倍率とデジタル解像度/密度) を使用します。 注: 個々 のセル移行速度の計算ができる可能性があります時間コース画像を個別に移行し、フロントがコヒーレント (例えば、MDA MB 231 乳房癌細胞) の形成とは無関係のギャップを埋める細胞としていること。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移行の画像解析と定量
	<ol>
		<li>画像処理ソフトウェア (例えばImageJ) を使用すると、スクラッチ ギャップ制限を定義し、治療前の写真で 4 つまでの測定のための gap 表面を決定します。「表面前処理ギャップ」としてデータを記録 (PREGAP)。治療後の写真は、同じ手順を繰り返します。「治療後ギャップの表面」としてデータを記録 (POSTGAP).<ol>
			<li>ImageJ を使用して記録された画像を開きます。「画像」メニューで画像の種類を 8 ビットに設定します。「プロセス」メニューで「フィルター」サブメニューに移動し、、"変動"のフィルターを適用。</li>
			<li>「画像」メニューで"調整"サブメニュー黒と白に設定されたしきい値を入力してください (B &#38; W)、「暗い背景」が選択されていないことを確認します。「プロセス」メニューの"バイナリ"サブメニューに移動し、「穴を埋める」を選択します。</li>
			<li>「分析」メニュー「測定を設定」を選択、「エリア」アクティブに。測定領域次のギャップを区切る移行のエッジの輪郭を描画します。</li>
			<li>「分析」メニューの「粒子の分析」を選択し、描画エリア表面の「合計領域」の値を記録します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>ギャップ表面測定の差として個々 のサンプルのセットごとに絶対移行を定量化するスプレッドシートの PREGAP、POSTGAP の総面積値を紹介: プリギャップ − POSTGAP [任意単位]。さらに、各コントロールのサンプル条件の絶対移行データを正規化: (サンプル ・制御) * 100 [%]。 注: セルを個別に移行し、フロントがコヒーレント (例えば、MDA MB 231 乳房癌細胞) の形成とは無関係のギャップを埋める、絶対移行により計算できる中央に侵入セルをカウントのいずれかのストリップコントロールまたは扱われたサンプル。</li>
		<li>(図 1参照) 数量出力をプロットします。必要であれば、統計分析を実行します。</li></ol></li></ol>2 つの条件または条件の大きい数のための分散分析のテストを比較するときは、スチューデントの t 検定を検討してください。
	
	

2. 人工移行フロント アッセイ地形の研究
<ol>
	<li>セル膜の準備
	<ol>
		<li>無菌状態での作業は、プレートの表面が完全に覆われるまで空培養皿に滅菌ラウンド coverslips の 1 つのレイヤーを配置します。 注: 12 と 33 coverslips までに収まる 5 cm と 10 cm 径プレート、それぞれ。</li>
		<li>培養プレートに 2 〜 3 日後 100% 合流ができる濃度で細胞の十分な量を優しくシードします。Coverslips が滅菌ピペット先端で穏やかな圧力を適用することによって浮遊するを防ぐし、coverslip が隣接 coverslips 重なっていないかどうかを確認します。媒体ごとの 24-48 時間を更新します。 注: すべてのセルの行を徹底的にで検定して細胞濃度と完全 confluency に達するに必要なタイミングを決定する必要があります。通常 Mv1Lu または HaCaT 細胞の 2-3 x 10 の6または 10 の6セル/10 cm 径プレート x 2.5-4、それぞれシードされます。小さめの皿で細胞数をスケール ダウンする必要があります。</li>
		<li>細胞に達すると合流、血清添加培地を取り除きし、新鮮な無血清培地に置き換えます。人工傷を実行する前に、24 h の無血清培地で細胞を維持します。 注: Mv1Lu または HaCaT 細胞に特殊な基板の要件はありません。ただし、細胞無血清条件下で自発的にデタッチの影響を受けやすいのポリ L リジン溶液を用いた培養面の塗装の前処理する必要があります10と見なされます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>単分子膜を傷つける
	<ol>
		<li>滅菌ピンセットを使用して、優しく新鮮な無血清培地を含むクリーン 10 cm プレートに観察を移動します。ピンセットで周囲に、coverslip を保持することによって、単分子膜の損傷を防ぐ。Coverslip 破損の恐れのある過度の圧力を避けます。</li>
		<li>人工傷を作成するには、coverslips の中央に横ラインの殺菌かみそりの刃をドラッグします。中央の単分子膜のストリップを完全に削除するために戻って来たり、3-4 mm をドラッグします。細胞の残骸残って負傷のエッジに接続されていないことを確認します。 注: 12 mm 径の coverslip、ラウンド、切開で、半ば、カバーガラスの。以下の手順でカバーガラスの傾斜を避けるために (少なくとも 2 mm 幅) 十分に大きい主な正面の反対側セルの連勝を残してください。</li>
		<li>きれいな 6 ウェル プレート含む少なくとも 2 mL 新鮮な無血清培地に、上向きのセルと負傷者 coverslips を転送します。最大 4 負傷 coverslips/よくに合います。</li>
		<li>水洗いして 2 回使用新鮮な無血清培地戸建のセルを削除します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>実験方法及びサンプリング
	<ol>
		<li>優しく選択した治療法を含む新鮮な培地で井戸に培地を交換します。 注: また、化学物質や培養液の均質性を邪魔しないで化合物は、治療できます再接種される培養液に直接。任意の潜在的な細胞の剥離を避けるために慎重に進みます。</li>
		<li>目的の実験的タイミング (37 ° C、5% CO2) セル インキュベーター内のプレートを保ちます。</li>
		<li>したセルを固定することによって細胞遊走を停止します。優しく実験の培養液を 1 mL の PBS で 4% ホルマリンに置き換えます。室温 15 分間インキュベートします。 注: コース実験の時間のため培養プレートからサンプルを削除、その他、継続的な実験条件に影響を及ぼすホルマリン煙を避けるために別皿でそれらを修正します。</li>
		<li>過剰なホルマリンは; を削除するセルを洗浄して軽く新鮮な PBS の井戸にソリューションを取り付けます。2 回以上を繰り返します。 注: この段階で封止後プレートが 4 ° C で不明確に保存されます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛍光抗体法 (IF) とトポロジー解析
	<ol>
		<li>IF の染色を行いとして個々 coverslips にイメージングは別記3,4,11。<ol>
			<li>Coverslips PBS で 0.3% トリトン X-100 溶液を浸すことによって 10 分間 permeabilize します。</li>
			<li>次のブロックのソリューションを使用して 30 分間ブロック: 0.3% ウシ血清アルブミン。10% 牛胎児血清;5% のスキムミルク。PBS で 0.3% トリトン X-100 溶液。 注: ミルクなし解決を妨げること事前に準備ができ-20 ° C で保存</li>
			<li>牛乳無料ブロッキング液で希釈した一次抗体と湿ったチャンバ内の室温で 1 時間インキュベートします。Coverslips に逆さまの状態で適切な配分を確保するため 15 μ L 抗体溶液を配置します。 注: 抗体作業希釈は、変数は、使用している抗体に依存します。たとえば、ウサギ抗 c 6 抗体は 1/100 希釈を必要とします。</li>
			<li>PBS での 0.1% トリトン X-100 溶液で coverslips を浸すことによって 3 回を洗浄します。</li>
			<li>30 分間無料のミルク ブロック バッファーで希釈した二次抗体に coverslips を孵化させなさい。 注: 抗体作業希釈は、変数は、使用している抗体に依存します。たとえば、ヤギ抗うさぎ (488) は、最適な解像度の 1/400 希釈を必要とします。ヘキスト 33258 ファロイジンなど他の標識化合物は、この段階でインキュベーション バッファーに追加できます。</li>
			<li>PBS で 0.1% トリトン X-100 溶液 coverslips を浸すことによって 3 回を洗浄します。</li>
			<li>Coverslips 逆さまの状態で 10 μ L マウント メディア ドロップ (例えばVectashield) 顕微鏡スライド上に配置をマウントします。取付中硬化一晩室温で暗闇の中でスライドを残します。その後、無期限に暗闇の中で 4 ° C で保存します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>落射蛍光または移行の前面の端で発生した構造変化の共焦点顕微鏡画像のいずれかを取得します。 注: トポロジー研究は、内側の膜に移行する前から写真を並べて実行できます。半定量的な研究がローカル蛍光強度に基づくソフトウェア分析によって可能です。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

著者は、利害の対立がないことを宣言します。

皮膚または粘膜の破壊、線維芽細胞、上皮や免疫細胞など、様々 な細胞タイプの行動によってバリア機能が復元されます。相まって、これらの細胞を受ける複雑なアポトーシス、増殖、分化、重要なは、線維芽細胞を含むプロセスと上皮細胞の移行、混乱の組織の修復のための責任の究極のメカニズムであると表在性上皮ギャップ1,12細胞遊走を勉強したがっての閉鎖も傷の治療の調節の可能性を決定する際に上皮細胞の生理学的な現象を正確に記述することができます。癒し。
生理的条件2の近くでこの複雑なプロセスのレプリケーションおよびこうしていくつかの病理学の条件の評価や医薬品の効果の研究の動物モデルに人工傷を実行できるように治療13。しかし、このアプローチは多くの場合遅延ファッション13のデータを生成する可能性が負担の実験プロシージャと同様に、高価で複雑な物流の...

上皮のギャップの最終的な閉鎖と混乱の表面1の修復を担当しており、細胞遊走は創傷治癒に必要です。動物モデルにおける人工傷を実行できるように生理的条件2の近くでこの複雑なプロセスを複製するため。しかし、このアプローチは多くの場合コストがかかり、複雑な実験の手順、可能性のある創傷治癒過程の複雑な性質のための明確なプロセスの研究の精度を欠いている結果します。
上皮細胞の体外培養は、創傷治癒や処理セルの回遊行動に及ぼす影響のこれらの細胞が果たす役割を研究するため動物モデルの有用な代替を提供します。上皮細胞の生理学は非合流文化3,4,5,6; を使用して分子技術によってよく勉強しました。ただし、上皮整合性の破壊は結構機械的切開により通常。細胞培養、細胞のほとんどの数は、傷のギャップにさらされるかもしれないし、彼らは分子生物学の技術のための余りに小さいサンプルを表すこれを意味します。ただし、これらの病変は、ミンク肺上皮細胞 (Mv1Lu) または自然不死化ひと表皮細胞 (HaCaT) セルなど、いくつかの上皮細胞ラインの生得的な渡り鳥の特性を利用して、顕微鏡のスケールで学ぶことができます。ライン。
ここでは創傷治癒の3,4,7,8のコンテキストにおける上皮細胞の移行に関する定量的データを取得する適切な顕微鏡法について述べる。また、移行上皮膜で発生した質的分子および形態学的変化を研究に役立つその他の方法を提案する.全体的にみて、これらのメソッドは、創傷治癒過程におけるダイナミクスと上皮細胞の挙動と治療への応答に関与の形態的変化を研究するためのフレームワークを提供します。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコS Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, France</td><td>L0102-500</td><td>オプション 10% FBS サプリメント</td></tr><tr><td>Eagles's 最小エッセンシャルメディウム (EMEM)</td><td>ロンザ</td><td>BE12 -662F</td><td>オプション 10% FBS サプリメント</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ロンザ</td><td>BE17-605E</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td> サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州 米国</td><td></td> DE17603A <td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ</td>州、米国 <td>T4049</td><td>必要に応じて希釈</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>Sigma-Aldrich、セント米国ミズーリ州ルイ</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) (10x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14200-067</td><td>1x</td></tr><tr><td>24ウェル培養プレート</td>に希釈 <td>BD FALCON//SARSTED</td><td>734-0020</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル培養プレート</td><td>SARSTEDT</td><td>83-3920</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子 (EGF)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>E9644</td><td>使用済み 10ng/mL</td></tr><tr><td>ラウンドカバーガラス</td><td>MENZEL-GL&Auml;SER</td><td>MENZCB00120RA020</td><td>SHORT DEPTH OF FIELD</td></tr><tr><td>強化カミソリ刃 No. 743</td><td>Martor (VWR経由)</td><td>MARO743.50</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;l 滅菌エアロゾルピペットチップ</td><td>VWR</td><td>732-0541</td><td></td></tr><tr><td>20 & マイクロ;l 滅菌エアロゾルピペットチップ</td><td>VWR</td><td>732-0528</td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ 結合位相コントラスト顕微鏡</td><td>Motic Spain</td><td>Moticam カメラ 2300 3.0 M ピクセル USB 2.0;Motic Optic AE31</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ZEISS Microimaging, ドイツ</td><td>LSM 510 META</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培養皿</td><td>BD FALCON</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ ポリクローナル抗 c-Jun 抗体</td><td>Santa Cruz バイオテクノロジー</td><td>sc-1694</td><td>使用 1:100</td></tr><tr><td>抗ウサギ IgG (ポリクローナルヤギ) AF 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>使用 1:400</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>14530</td><td>Used 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>Used 1:100</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2323</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>スキムミルク</td><td>BD DIFCO</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td>リリース 1.50i</td><td></td></tr><tr><td>Zen LSM 510 画像処理ソフトウェア</td><td>ZEISS Microimaging, ドイツ</td><td>リリース 5.0 SP 1.1</td><td></td></tr></tbody></table>

顕微鏡法によるin vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

細胞遊走は、創傷治癒に必須の側面です。人工を作成する傷を研究の動物モデルにコストがかかり、複雑な実験手順の結果にしばしば潜在的精度に欠けている間。上皮細胞の体外培養は、創傷治癒と細胞の治療法の影響で細胞の回遊行動の研究のため適切なプラットフォームを提供します。上皮細胞の生理学は非合流条件でよく勉強しました。ただし、このアプローチは、自然治癒で条件に類似しないかもしれない。機械的手段によって上皮の整合性を中断することは現実的なモデルを生成しますが、分子技術のアプリケーションを妨げることがあります。したがって、顕微鏡技術は上皮細胞の遊走を勉強に最適体外。ここで我々 は, 上皮細胞の渡り鳥の性能に関する量的・質的データを入手できる人工移行フロント アッセイ、人工傷スクラッチ試験 2 つの特定の方法を詳しく説明します。

定量的研究のため人工傷スクラッチ試金: 移行上皮成長因子 (EGF) 推進を評価します。
EGF は、上皮細胞の増殖と移行、およびこうして移行推進を定量化するための肯定的な制御のよく知られている誘導です。Mv1Lu と HaCaT 細胞膜が傷傷試金で使用された、治療前の写真が得られました。10 ng/ml の EGF, 接種後のセルは固定と治療後の写真の前に 19 時間培養。増殖は、血清飢餓条件を維持することによって最小に保たれました。ImageJ を用いた画像の前処理および後処理のセット分析し、中央ギャップ領域を調べた。重複しているためにも、各 4 つのサイズを登録するのに実験を実行します。表面の差として算出した絶対移行の定量化: (プリギャップ − POSTGAP)。刺激 HaCaT 細胞 (図 1 b) と比較して刺激 Mv1Lu 細胞 (図 1 a<...

本稿では培養上皮細胞は、どのように切開のような病変便利なモデルの傷癒しの in vitro、共焦点イメージングを可能にするについて説明しますまたはレーザ走査顕微鏡と高品質を提供することができます。細胞の挙動と移行に関与するメカニズムの両方の研究のための質的・量的データ。

顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

これらの上皮細胞培養人工創傷法の全体的な目標は、定量的および定性的観点から細胞移動を研究することであり、創傷治癒に対する特定の対象治療の影響を評価できるようにすることです。この方法は、上皮破壊中の特定の移動プロセスの役割を正確に特徴付けることができるため、創傷治癒分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。このアプローチの主な利点は、細胞遊走測定と関連する分子マーカーの挙動の変化との相関関係を可能にすることです。これらの技術の意味は、早期の薬物検査や創傷閉鎖のための便利なセットアップを提供するため、臨床的創傷の治療にまで及びます。一般に、この方法は、世代とともに創傷で一貫した再現性を得ることが困難であるために開始されます。人工創傷スクラッチアッセイでは、まず、培養プレートの各ウェルに、目的の上皮細胞2ミリリットルを完全培地に播種します。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で2〜3日間培養し、100%の密度になるまで培養します。細胞の準備ができたら、新鮮な無血清培地で細胞を2回洗浄し、続いて新鮮な無血清培地で24時間培養します。翌日、プレートを滅菌作業エリアに置き、滅菌マイクロピペットチップの狭い方の端を各ウェルの底を2回ドラッグして、十字型の創傷を生成します。一貫した創傷ギャップは、先端を上皮表面に沿ってスムーズに動かしながら、一定でしっかりとした圧力を加えることによって達成されます。圧力がかかりすぎると先端が変形し、傷の半径が不規則になります。上清を静かに取り除いて分離した細胞を廃棄し、新鮮な無血清培地をウェルに慎重に加えます。電荷結合素子のカメラに接続された逆位相コントラスト顕微鏡で、顕微鏡フィールドの端を隣接するスクラッチの交差部分に合わせ、各ウェルのスクラッチギャップの最大4つの前処理参照画像を取得します。すべての画像を取得したら、指定された処理ウェル内の培地を新鮮な培地と交換し、選択した目的の処理を補充し、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。少なくとも1つの条件が約90%のスクラッチギャップ閉鎖に達したら、上清をPBS中の4%ホルマリン1ミリリットルと穏やかに交換し、室温で15分間インキュベーションします。次に、細胞をPBSで少なくとも3回穏やかに洗浄して余分なホルマリンを除去し、引っ掻いた後にキャプチャした元の参照領域と同じイメージングパラメータを使用して、示したとおりにウェルを画像化します。適切な画像処理ソフトウェアを使用して画像を分析するには、記録された前処理対象の画像を開き、[画像] メニューで画像タイプを 8 ビットに設定します。[プロセス] メニューで [フィルター] サブメニューを選択し、分散フィルタリングを適用します。[画像]メニューで、[調整]サブメニューを開き、[しきい値]を白黒に設定します。[プロセス]メニューで、[バイナリ]サブメニューを選択し、[穴を埋める]を適用します。「分析」メニューで、「測定値の設定」を選択し、「エリア」をアクティブにします。次に、移動するエッジの等高線に沿って測定可能な領域を描画し、ギャップを区切ります。[解析]メニューで[パーティクルを解析]を選択し、描画された面積サーフェスの合計面積値を記録します。個々のサンプルの各セットの絶対移動をギャップ表面測定値の差として定量化するには、処理前と処理後の合計ギャップ表面積の値をスプレッドシートにエクスポートし、定量化出力をプロットします。人工マイグレーションフロントアッセイでは、無菌条件下で、最大33枚の滅菌済み丸型カバースリップの1層を空の10cm培養プレートに加えます。プレート表面が完全に覆われたら、2〜3日の培養後に100%のコンフルエントが得られる濃度で、目的の上皮細胞に穏やかに播種します。必要に応じて、無菌マイクロピペットチップでカバーシップを静かに押し下げて、浮きを防ぎます。細胞がコンフルエントに達したら、上清を無血清培地と交換し、さらに24時間培養します。次に、滅菌ピンセットを使用して、1つのカバースリップを新鮮な無血清培地を含む新しい10センチメートルプレートに慎重に移し、カバースリップをその周囲に沿って保持するように注意します。人工創を作成するには、滅菌したカミソリの刃を各カバースリップを前後にドラッグして、各細胞培養の中心に3〜4ミリメートルの横線を作り、中央の単層ストリップを完全に除去します。傷口を作るときは、不規則なエッジ形状やフロッピング上皮部分の生成から保護するために、カミソリの刃のエッジをカバーガラスの表面に重く配置するように注意してください。最大4つの創傷カバースリップを、細胞側を上にして、少なくとも2ミリリットルの無血清培地を含む6ウェルプレートの個々のウェルに移し、各ウェルを新鮮な無血清培地で2回穏やかに洗浄して、剥離した細胞を除去します。剥離した細胞がすべて廃棄されたら、洗浄培地を目的の処理剤を補充した新しい培地に静かに交換し、プレートを細胞培養インキュベーターに置きます。適切な実験期間の終了時に、示したように細胞をPBS中の4%ホルマリンで固定し、目的の適切な蛍光標識抗体で細胞を染色します。次に、目的の実験パラメータに従って、蛍光顕微鏡法により、移動する前端で発生する構造変化を画像化します。この実験では、上皮細胞の増殖と移動の誘導因子としてよく知られている上皮成長因子による治療の前後に、創傷ギャップを測定しました。次に、絶対移動は、処理前と処理後のギャップ表面積の差として計算されました。上皮成長因子による治療は、コントロールおよび成長因子刺激細胞のF-アクチン染色のこれらのレーザー走査型顕微鏡画像で観察されるように、細胞細胞骨格動態を増強します。さらに、c-Junの過剰発現は、移動フロントに隣接する細胞で明らかなタンパク質の発現の増加とともに観察されます。この手順を試行する際には、遊走の定量化を中断する可能性のある上皮細胞フラップの存在について、創傷縁の完全性を確認することを忘れないでください。このビデオを見た後、あなたはの回遊行動を定量的および定性的に評価する方法をよく理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

一般的に使用される、 インビトロで細胞遊走および浸潤を調べるための高度にアクセス可能な方法が記載されている。第一の方法は、細胞運動性を測定する細胞創傷閉鎖アッセイである。第二の方法は、走化性、細胞の浸潤能を評価するトランスウェル遊走および浸潤アッセイである。...

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

細胞移動は、癌のような創傷治癒および免疫応答、および病態生理学的過程として、生理の茄多に関与している生物学的な現象である。 3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、3D生理的環境における内の異なる細胞型の遊走特性を分析するための多目的なツールである。...

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

特定の疾患の病態生理学を理解し、治療介入のための新しい戦略を特定するために、早期の内皮細胞(EEC)の移動の調査が重要です。次のプロトコルは、EECの調査に適応した細胞遊走を評価する技術について説明しています。...

有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

このプロトコルの目的は、三次元フィブリン マトリックス内の細胞の移動に及ぼすプロおよび反 migratory...

三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

ここでは、TIP60 枯渇 MCF10A 乳房の上皮細胞を用いた創傷治癒のアッセイで細胞遊走のリアルタイム モニタ リングを提案します。生細胞イメージング...

乳腺上皮細胞移行 TIP60 の一時的な枯渇後のライブ イメージング

細胞浸潤と移行の解析のための 2 つの方法の事例分析: ボイデン室アッセイと体外ビデオ顕微鏡を用いた創傷治癒アッセイ。これらの 2...

細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金

ここでは、ペプチドの気管支上皮細胞の移動に及ぼす影響を評価するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、セル移行および創傷閉鎖の速度に定量的なデータの迅速かつ再現性の高い国又できます。...

新規In Vitro細胞移動を評価する癒しのアッセイを傷

ここで自動光学カメラ顕微鏡を用いた細胞移行、生体外でテストする手順をについて説明します。スクラッチのアッセイは、傷の閉鎖が一定期間続いている広く使用されています。光学顕微鏡は細胞遊走の信頼性の高い、格安の検出を可能にします。...

スクラッチのアッセイの in Vitro細胞遊走の自動光学カメラのテストのために最適化されました。

現在のプロトコルでは、がん細胞の遊走とリアルタイムで単一のプラットフォームに侵略を調査、細胞の移動と形態の勉強を簡単に再現できると時間効率の良いオプションを提供する統合的な手法について説明します。...

自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー

ここでは、一次線維芽細胞を用いてインビトロスクラッチアッセイを行い、マウスにおける生体内皮膚創傷治癒アッセイに関するプロトコルを提示する。両方のアッセイは、インビトロおよびインビボ創傷治癒を評価するための簡単な方法です。...

インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

本論文では、生きた Clytia hemisphaerica medusa の上皮に創傷を作製し、 in...

刺胞動物モデル生物Clytia hemisphaericaを用いたin vivoでの上皮創傷治癒の特徴付け

学ぶ上皮細胞単層の人工創傷法による創傷治癒過程における細胞移行の定量的・定性的評価。共焦点顕微鏡を用いて分子マーカー挙動と相関させ、創傷治癒メカニズムの解明や創薬スクリーニングに応用する。

顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

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