顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

これらの上皮細胞培養人工創傷法の全体的な目標は、定量的および定性的観点から細胞移動を研究することであり、創傷治癒に対する特定の対象治療の影響を評価できるようにすることです。この方法は、上皮破壊中の特定の移動プロセスの役割を正確に特徴付けることができるため、創傷治癒分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。このアプローチの主な利点は、細胞遊走測定と関連する分子マーカーの挙動の変化との相関関係を可能にすることです。

これらの技術の意味は、早期の薬物検査や創傷閉鎖のための便利なセットアップを提供するため、臨床的創傷の治療にまで及びます。一般に、この方法は、世代とともに創傷で一貫した再現性を得ることが困難であるために開始されます。人工創傷スクラッチアッセイでは、まず、培養プレートの各ウェルに、目的の上皮細胞2ミリリットルを完全培地に播種します。

細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で2〜3日間培養し、100%の密度になるまで培養します。細胞の準備ができたら、新鮮な無血清培地で細胞を2回洗浄し、続いて新鮮な無血清培地で24時間培養します。翌日、プレートを滅菌作業エリアに置き、滅菌マイクロピペットチップの狭い方の端を各ウェルの底を2回ドラッグして、十字型の創傷を生成します。

一貫した創傷ギャップは、先端を上皮表面に沿ってスムーズに動かしながら、一定でしっかりとした圧力を加えることによって達成されます。圧力がかかりすぎると先端が変形し、傷の半径が不規則になります。上清を静かに取り除いて分離した細胞を廃棄し、新鮮な無血清培地をウェルに慎重に加えます。

電荷結合素子のカメラに接続された逆位相コントラスト顕微鏡で、顕微鏡フィールドの端を隣接するスクラッチの交差部分に合わせ、各ウェルのスクラッチギャップの最大4つの前処理参照画像を取得します。すべての画像を取得したら、指定された処理ウェル内の培地を新鮮な培地と交換し、選択した目的の処理を補充し、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。少なくとも1つの条件が約90%のスクラッチギャップ閉鎖に達したら、上清をPBS中の4%ホルマリン1ミリリットルと穏やかに交換し、室温で15分間インキュベーションします。

次に、細胞をPBSで少なくとも3回穏やかに洗浄して余分なホルマリンを除去し、引っ掻いた後にキャプチャした元の参照領域と同じイメージングパラメータを使用して、示したとおりにウェルを画像化します。適切な画像処理ソフトウェアを使用して画像を分析するには、記録された前処理対象の画像を開き、[画像] メニューで画像タイプを 8 ビットに設定します。[プロセス] メニューで [フィルター] サブメニューを選択し、分散フィルタリングを適用します。

[画像]メニューで、[調整]サブメニューを開き、[しきい値]を白黒に設定します。[プロセス]メニューで、[バイナリ]サブメニューを選択し、[穴を埋める]を適用します。「分析」メニューで、「測定値の設定」を選択し、「エリア」をアクティブにします。

次に、移動するエッジの等高線に沿って測定可能な領域を描画し、ギャップを区切ります。[解析]メニューで[パーティクルを解析]を選択し、描画された面積サーフェスの合計面積値を記録します。個々のサンプルの各セットの絶対移動をギャップ表面測定値の差として定量化するには、処理前と処理後の合計ギャップ表面積の値をスプレッドシートにエクスポートし、定量化出力をプロットします。

人工マイグレーションフロントアッセイでは、無菌条件下で、最大33枚の滅菌済み丸型カバースリップの1層を空の10cm培養プレートに加えます。プレート表面が完全に覆われたら、2〜3日の培養後に100%のコンフルエントが得られる濃度で、目的の上皮細胞に穏やかに播種します。必要に応じて、無菌マイクロピペットチップでカバーシップを静かに押し下げて、浮きを防ぎます。

細胞がコンフルエントに達したら、上清を無血清培地と交換し、さらに24時間培養します。次に、滅菌ピンセットを使用して、1つのカバースリップを新鮮な無血清培地を含む新しい10センチメートルプレートに慎重に移し、カバースリップをその周囲に沿って保持するように注意します。人工創を作成するには、滅菌したカミソリの刃を各カバースリップを前後にドラッグして、各細胞培養の中心に3〜4ミリメートルの横線を作り、中央の単層ストリップを完全に除去します。

傷口を作るときは、不規則なエッジ形状やフロッピング上皮部分の生成から保護するために、カミソリの刃のエッジをカバーガラスの表面に重く配置するように注意してください。最大4つの創傷カバースリップを、細胞側を上にして、少なくとも2ミリリットルの無血清培地を含む6ウェルプレートの個々のウェルに移し、各ウェルを新鮮な無血清培地で2回穏やかに洗浄して、剥離した細胞を除去します。剥離した細胞がすべて廃棄されたら、洗浄培地を目的の処理剤を補充した新しい培地に静かに交換し、プレートを細胞培養インキュベーターに置きます。

適切な実験期間の終了時に、示したように細胞をPBS中の4%ホルマリンで固定し、目的の適切な蛍光標識抗体で細胞を染色します。次に、目的の実験パラメータに従って、蛍光顕微鏡法により、移動する前端で発生する構造変化を画像化します。この実験では、上皮細胞の増殖と移動の誘導因子としてよく知られている上皮成長因子による治療の前後に、創傷ギャップを測定しました。

次に、絶対移動は、処理前と処理後のギャップ表面積の差として計算されました。上皮成長因子による治療は、コントロールおよび成長因子刺激細胞のF-アクチン染色のこれらのレーザー走査型顕微鏡画像で観察されるように、細胞細胞骨格動態を増強します。さらに、c-Junの過剰発現は、移動フロントに隣接する細胞で明らかなタンパク質の発現の増加とともに観察されます。

この手順を試行する際には、遊走の定量化を中断する可能性のある上皮細胞フラップの存在について、創傷縁の完全性を確認することを忘れないでください。このビデオを見た後、あなたはの回遊行動を定量的および定性的に評価する方法をよく理解しているはずです。