一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

本メソッド記事の全体的な目的は、化学修飾ペプチド核酸による二本鎖RNAの分子認識を研究するために、当研究室で利用している詳細なプロトコルを紹介することです。この手法は、RNA構造の検出や標的化など、RNA化学生物学分野における重要な課題の解決に寄って役立ちます。本手法の主な利点は、その設計原理があらゆるRNA二本鎖構造の標的化に適用可能であることです。

本手順のデモンストレーションは、私の研究室のリサーチアソシエイトであるDesiree Tohが行います。この手順を開始するには、あらかじめ調製したRNA PNAサンプルに35%グリセロール溶液を4 µL加え、穏やかに混合します。マイクロピペットとゲルロードチップを用いて、気泡が入らないように注意しながら、各サンプルを20 µLずつあらかじめ調製したポリアクリルアミドゲルに慎重に分注します。

250 Vの定電圧で5時間、ゲル電気泳動を行います。5時間後、電源装置を切り、ゲルスタンドからガラスプレートを取り出します。次に、ゲルのシーリングテープを剥がし、ガラスプレートを分解します。

ゲルをガラスプレートからそっと取り出し、350 millilitersの脱イオン水が入った容器に入れます。容器に35 microlitersのエチジウムブロマイドを注意深く加え、プラットフォームシェーカーを用いて低速で30分間振とうします。エチジウムブロマイド溶液を廃棄した後、ゲルを1.5から2 litersの蒸留水で洗浄します。

次に、532 nmのグリーンレーザーを搭載したイメージャーを用い、エミッションフィルターを610 nmに設定してゲルをスキャンします。フリーソフトを使用してゲルのバンド強度を定量してください。適切な量の2-アミノプリン標識二本鎖RNAを、清潔な1.5 mLチューブに移します。

次に、真空濃縮機を用いてRNA溶液を濃縮します。続いて、あらかじめ調製したメインストックから、各濃度に応じた目的のPNAの適量を、別々の1.5 mLチューブに分注します。真空濃縮機を用いてPNA溶液を濃縮してください。

乾燥したRNAが入ったチューブに975 µLのインキュベーションバッファーを加え、すべてのRNAが完全に溶解するように十分に混合します。RNA溶液を短時間遠心分離した後、あらかじめ加熱したヒートブロックにチューブを10分間置き、アニーリングを行います。完了後、ヒートブロックの電源を切り、サンプルを室温まで冷却させます。

乾燥させたPNAを含む各チューブに75 µLのRNAを加え、十分に混合します。サンプルを室温で少なくとも1時間静置した後、4°Cで一晩インキュベートします。次に、適切な量の2-アミノプリン標識一本鎖RNAを、別の1.5 mLチューブに分注します。

メインストックから、様々な濃度の標的PNAを適切な量ずつ、一本鎖RNAを含む各チューブに分注します。サンプルを乾燥させた後、各チューブに75 µLのインキュベーションバッファーを加え、十分に混ぜ合わせます。各チューブをあらかじめ加熱したヒートブロックに10分間置き、各サンプルをアニーリングさせます。

サンプルを室温まで冷却した後、4 °Cで一晩インキュベートします。次に、各サンプルを70 µLずつ1 cm四方のキュベットに移します。キュベットを蛍光分光光度計に設置し、330から550 nmの波長範囲で放出光を測定します。

測定が完了したら、キュベットからバッファーを取り除きます。キュベットを蒸留水で洗浄し、窒素ガスで乾燥させます。すべてのサンプルで測定を繰り返した後、蛍光強度を波長に対してプロットします。

適切な量の一本鎖RNAを、個別の1.5 milliliterチューブに移します。次に、メインストックから適切な量の標的PNAを、一本鎖RNAを含む各チューブに移します。サンプルを乾燥させた後、各チューブに130 microlitersのインキュベーションバッファーを加え、十分に混合します。

各チューブをあらかじめ加熱しておいたヒートブロックに入れ、10分間アニーリングを行います。サンプルを室温まで冷却した後、4 °Cで一晩インキュベートします。次に、各サンプル130 µLを、インキュベーションバッファーが入った8マイクロセルキュベットの各セルに分注します。

UV-Vis分光光度計を用いて、各サンプルの260ナノメートルにおける吸光度を測定します。温度を15°Cから95°Cまで上昇させ、続いて95°Cから15°Cまで下降させながら、昇温・降温速度 0.5°C/分で測定を行います。PNAオリゴマーは、2回の逆相HPLC精製を経て得られたものを使用しました。

PNAの同一性はMALDI/TOF分析によって確認できます。非変性PAGEのデータから、QおよびL修飾PNAはC-Gペアを持つ二本鎖RNA領域のみを認識できることが示唆されました。この特異的かつ強化された認識は、T-A-U-L-G-CおよびQ-C-G PNA RNAの2塩基トリプレックス形成によるものです。

2-アミノプリン蛍光滴定研究により、QおよびL修飾PNAは標的の二本鎖RNAには結合するが、一本鎖RNAには結合しないことが示されました。Q残基を含むPNAは熱融解転移を示さず、これはWatson-Crick様Q-Gペアにおける立体障害のため、一本鎖RNAへの結合が起こらないことを示唆しています。未修飾PNAであるP1と比較して、L残基を含むPNA P4およびP5は、Watson-Crick様L-Gペアにおける立体障害により、対応するRNA-PNA二本鎖の融解温度が低くなっています。

UV吸光度で検出した熱融解データは、QおよびL残基を含むPNAが一本鎖RNAに強く結合しないことを示す2-アミノプリン蛍光滴定データと一致しています。Q塩基の導入はL塩基よりも不安定化が進みます。これは、Watson-Crick型に類似したQ-Gペアの形成において、Q塩基がより顕著な立体障害を持つためです。習熟すれば、適切に実施することで、これらのさまざまな実験を1週間で完了させることができます。

この手順に続き、細胞内のRNA構造のプロービングやターゲティングなどの他の手法を実施することで、二本鎖RNA結合PNAを用いてRNA構造を検出できるか、またRNA機能を制御できるかといったさらなる疑問を明らかにすることができます。この技術の開発により、RNA生物学および疾患分野の研究者が、RNA構造を標的とした治療薬開発を探索するための道が開かれました。