一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

この方法の記事の全体的な目標は、化学修飾ペプチド核酸による二本鎖RNAの分子認識を研究するために私たちの研究室が利用している詳細なプロトコルを紹介することです。この方法は、RNA構造の検出や標的化など、RNAケミカルバイオロジー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、設計原理が任意のRNA二本鎖構造の標的化に適用できることです。

その手順を実演するのは、私の研究室の研究員であるDesiree Tohです。この手順を開始するには、事前に調製したRNA PNAサンプルに35%グリセロール溶液を4マイクロリットル加え、穏やかに混合します。マイクロピペットとゲルローディングチップを使用して、各サンプルの20マイクロリットルを事前に準備したポリアクリルアミドゲルに慎重に入れ、気泡が入らないようにします。

ゲルを250ボルトの定電圧で5時間運転します。5時間後、電源を切り、ゲルスタンドからガラスプレートを取り外します。その後、ゲルシールテープをはがし、ガラスプレートを分解します。

ガラスプレートからゲルをそっと取り出し、350ミリリットルの脱イオン水で満たされた容器に入れます。35マイクロリットルの臭化エチジウムを容器に慎重に加え、低速で30分間プラットフォームシェーカーに置きます。エチジウムブロマイド溶液を廃棄した後、ゲルを1.5〜2リットルの蒸留水ですすいでください。

次に、532ナノメートルの緑色レーザーと610ナノメートルに設定された発光フィルターを備えたイメージャーを使用してゲルをスキャンします。フリーソフトウェアを使用してゲルバンド強度を定量化します。2-アミノプリン標識二本鎖RNAを適量、清潔な1.5ミリリットルのチューブに移します。

次に、真空濃縮器を使用してRNA溶液を濃縮します。次に、事前に調製したメインストックから、さまざまな濃度のターゲットPNAの適切な量を1.5ミリリットルのチューブに移します。真空濃縮器を使用してPNA溶液を濃縮します。

乾燥したRNAが入ったチューブに975マイクロリットルのインキュベーションバッファーを加え、十分に混合してすべてのRNAが溶解することを確認します。RNA溶液を短時間遠心分離した後、予熱したヒートブロックにチューブを10分間入れてアニーリングします。終了したら、ヒートブロックをオフにし、サンプルを室温まで冷まします。

乾燥したPNAが入った各チューブに75マイクロリットルのRNAを加え、十分に混合します。サンプルを室温で1時間以上放置した後、摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、適切な量の2-アミノプリン標識一本鎖RNAを別々の1.5ミリリットルチューブに移します。

さまざまな濃度の標的PNAを、メインストックから一本鎖RNAを含むそれぞれのチューブに移します。サンプルを乾燥させた後、各チューブに75マイクロリットルのインキュベーションバッファーを加え、十分に混合します。各サンプルを予熱したヒートブロックに各チューブを10分間入れて、アニーリングを行います。

サンプルを室温まで冷ました後、摂氏4度で一晩インキュベートします。これに続いて、各サンプルの70マイクロリットルを1センチメートル四方のキュベットに移します。キュベットを蛍光分光光度計に置き、330〜550ナノメートルの波長範囲での発光を測定します。

測定が完了したら、キュベットからバッファーを取り出します。キュベットを蒸留水ですすぎ、窒素ガスで乾燥させます。すべてのサンプルで測定を繰り返した後、波長に対する蛍光強度をプロットします。

適切な量の一本鎖RNAを別々の1.5ミリリットルチューブに移します。次に、適切な量の標的PNAをメインストックから一本鎖RNAを含むそれぞれのチューブに移します。サンプルを乾燥させた後、各チューブに130マイクロリットルのインキュベーションバッファーを加え、十分に混合します。

各サンプルを予熱したヒートブロックに各チューブを10分間入れて、アニーリングを行います。サンプルを室温まで冷ました後、摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、各サンプルの130マイクロリットルを、インキュベーションバッファーを含む1つのセルを備えた8マイクロセルキュベットに移します。

UV-Vis分光光度計を使用して、各サンプルの吸光度を260ナノメートルで測定します。15°Cから95°Cまで上昇する温度で測定し、続いて95°Cから15°Cまで温度を0.5°C/分で下降させます。PNAオリゴマーは、2回の逆相HPLC精製後に得られました。

PNAの同一性は、MALDI/TOF分析によって確認することができます。非変性PAGEデータは、QおよびL修飾PNAがC-Gペアを持つ二本鎖RNA領域のみを認識できることを示唆しています。この特異的で強化された認識は、T-A-U-L-G-CおよびQ-C-G PNA RNAの2つのベースのトリプルフォーメーションを通じて行われます。

2-アミノプリン蛍光滴定試験では、QおよびL修飾PNAは標的二本鎖RNAに結合するが、一本鎖RNAには結合しないことが示されました。Q残基を含むPNAは熱融解転移を示さず、Watson Watson-Crick様Q-Gペアの立体衝突による一本鎖RNAへの結合の欠如を示唆しています。非修飾PNA P1と比較して、L残基を含むPNA P4およびP5は、Watson-Crick様L-Gペアの立体衝突により、対応するRNA PNA二本鎖の融解温度が低くなっています。

UV吸光度検出の熱融解データは、Q残基とL残基を含むPNAが一本鎖RNAに強く結合しないことを示す2-アミノプリン蛍光滴定データと一致しています。Qベースを組み込むと、Watson-CrickのようなQ-Gペアの形成において、Qベースがより大きな立体衝突を起こすため、Lベースよりも不安定になります。一度マスターすれば、さまざまな実験を適切に行えば、1週間で行うことができます。

この手順に続いて、細胞内のRNA構造をプローブして標的化するなどの他の方法を実行し、二本鎖RNA結合PNAを使用してRNA構造を検出し、RNA機能を制御できるかどうかなどの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、RNA生物学と疾患分野の研究者がRNA構造を標的とした治療法の開発を探求する道を開きました。