Name: 一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶ化学修飾ペプチド核酸による二重鎖RNAの選択的認識プロトコル。蛍光分光光度法とUV-Vis分光光度法を用いて、PNAのRNA結合特性と熱安定性を評価する方法を解説します。

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この作品は、(RGT3/13 ・ RG42/15 g. c. に) 教育 (MOE) の層 1 のシンガポール省と萌え層 2 (MOE2013-T2-2-024 と g. c. に MOE2015-T2-1-028) によって支持されました。

ここで報告される作業に基づく特許出願 (パット/179/14/15/PCT) が提出されています。

RNA 二重バインディング PNA オリゴマー (例えば、10 mers) 中型の分子でありこうして示すことができる結合する電気泳動の移動性シフト Rna に同等またはわずかに大きいサイズの (例えば、50 mer またはより小さい)。RNA が PNA よりも著しく大きい場合、RNA に PNA の滴定が限られたゲルの移動性シフトのため機能しません。したがって、ページの非変化試金のため大規模な RNA が切り捨てられます。大規模な RNA の蛍光ラベルの PNA に滴定ゲル40の途中でロード サンプル非変化のアガロースゲル三重鎖形成の監視が可能です。
RNA の一定濃度の非変化ページによる滴定実験のため通常効率的な投稿が無料 RNA と三重のバンドのエチジウム ブロマイドで染色の 1 μ M のラベルの RNA 濃度を使用します。RNA 濃度 0.2 μ M としては RNA 構造31によって十分な場合もあります。ラベル付けされていない RNA 濃度 (0.2 μ M) は 0.2 μ M 程度より大きいこと正確に測定することができるKd値を決定します。他の染色の染料は、染色の効率を高めるために使えます。また、未発表データは、タイトなバインディング イベントを測定する非変化ページ実験で Cy3 色素標識 Rna が使えるをお勧めします。
による 2-アミノプリンは適度蛍光灯のみ、という事実のためにによる 2-アミノプリンの蛍光滴定してKd値 0.2 μ M31以上に近い結合の測定に限られています。蛍光信号53,54,の変化における結合結果する場合蛍光滴定液で比較的タイトなバインドを定量化するための比較的明るい染料 RNA または PNA で付いたことがあります。55。
PNAs の dsRNA バインディングによって RNA の構造を対象とする戦略は、Rna の限られた数のテストされています。シーケンスと塩基組成の異なる二本のバインディング プロパティが異なることが考えられます。1 つは常に TFPNAs の設計のための二重のプリン豊富なストランドを選択可能性があります。どのように連続 q · を理解することが重要C G トリプル、トリプレックスの安定性に影響を与える可能性があります。広範なシーケンスに依存した研究は明らかに TFPNAs の配列依存的結合特性を理解する必要です。
TFPNAs の結合親和性は、長くおよび/または TFPNAs の基盤およびバックボーン用56,57のさらなる変更によってさらに強化できます。ただし、連続二重地域がしばしば成り立たない、中断することがなく 10 以上の連続塩基の非ワトソン Crick 構造によって。TFPNAs を共役 dsRNA 地域に隣接する非ワトソン Crick 構造の認識のための小分子で 1 つ可能性があります。原則として、TFPNA 小分子の共役結合親和性と TFPNA や小さな分子だけに比べて特異性が強化されます。ただし、活用58,59,60,61,62,63,64 リンカーの化学および物理的特性最適化する必要があります。
TFPNAs は ssRNAs と二本、二本に選択的にバインドできますという事実を示唆非常に有用なプローブと RNA 構造力学との相互作用の調節を介して潜在的な治療のリガンドとして TFPNAs を開発することが可能です。タンパク質と代謝産物。低分子、ペプチド、ナノ粒子などの細胞貫通部分の活用やリポソーム56,などの超分子構造との錯形成を通して TFPNAs の細胞内取り込みを促進することがあります。 ,12,17,25,31,41,65,66。さらに蛍光物質や放射性同位元素などのバイオ イメージング タグ TFPNAs の高機能化は、検出、イメージング、および生きている有機体の機能性 RNA の構造のターゲットを促進するかもしれない。

Rna の重要なバイオ マーカーおよび調節における Rna の役割の発見と多様な生物学的プロセス1,2,3の触媒の最近の進歩のための治療上のターゲットとして浮上しています。伝統的に、アンチセンス鎖はワトソン Crick 二重形成3,4,5,6,7,8、を ssRNAs にバインドに使用されています。9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. 最近、三重鎖形成性ペプチド核酸 (TFPNAs) は、接合 (図 1)3,28,29Hoogsteen 水素経由で二本にバインドする設計されています。dsRNA 地域は Mrna および Mrna、事前または pri miRNAs3、多く他非コーディング RNAs1,26,27など伝統的なアンチセンス標的 Rna の大部分であります。TFPNAs を使用して三重らせんを形成を通して二本を対象とその構造の特異性のため有利になること、調節不全疾患では、例えば Rna の正常な機能を復元するのに使えない可能性大です。
最近公開された3,28,29,30,31,32,33、Roznersらと私たちの仕事 34,35,36,37,38,39,40,41, 改善の努力を報告強化された関係を持つ二本に向けて変更された TFPNAs の選択的結合。チオ-pseudoisocytosine (L) モノマー30グアニジン変更 5-メチル シトシン (Q) モノマー31など合理的に設計の PNA モノマー (図 2) の合成法を開発しました。さまざまな生化学と生物物理学的評価方法により L と Q 残基を組み込んだ比較的短い PNAs (6-10 残基) が二本でそれぞれ、ワトソン Crick G C と C G の塩基対の認識率が改善を示すことを確認しました。また、L と Q 残基を含む PNAs 未変更 PNAs に比べると、宿主と dsDNA dsRNA の方より選択的バインドを表示しています。Q ベースのグアニジン機能42 HeLa 細胞31を入力する PNAs ができます。
当研究室で合成マニュアルの Boc 化学 PNAs (Boc またはt- Boc の略 tert butyloxycarbony (図 2参照) 固相ペプチド合成方法4。アミンの保護基として Boc と PNA モノマーの合成は、Boc のグループは PNA 単量体結合中に有益であるかもしれないグループを保護する fluorenylmethyloxycarbonyl (fmoc 保護) アミンと比較して立体かさばらず便利なしっかりサポート。Boc のグループは酸に不安定、簡単に削除できます固体支持の 20-50% トリフルオロ酢酸 (TFA) ジクロロ メタン (DCM) で PNA 合成時に。自動ペプチド合成は PNA オリゴマーの合成に用いることができます。ただし、PNA 単量体の 3-5 倍の過剰は、自動ペプチド合成に必要です。手動合成には、大幅に少ない PNA モノマー (2 ~ 3 倍過剰)、各結合カイザー テスト43で容易に監視が必要です。また、多くの自動化されたシンセサイザー Boc 除去ステップ中に腐食性 TFA の使用のため Boc 戦略合成との互換性はありません。
逆相高速液体クロマトグラフィー (クロマトグラフィー) MALDI-TOF の分子量特性評価に続いて、PNA オリゴマーを浄化することが (図 3 と4)30,31. 三重鎖形成を監視するという無料の RNA 二重を構築し、PNA は頻繁におしゃれをバインドされているためにを表示別の移行率 (図 5)30,31ページの非変化を用いて.ラベルは必要ありません RNA 二重と PNA· の両方の効率化後染色が得られるならRNA2三重バンド。比較的少量の試料は、非変性ページ実験に必要です。ただし、読み込み (インキュベーション) バッファーおよび実行バッファー (pH 8.3) できない場合があります同じ 8.3 の比較的高い pH は大きく、トリプレックスを揺るがす可能性がありますので、速度論的に安定したおしゃれに限定されている測定の結果します。
による 2-アミノプリン アデニン (6-アミノプリン); の異性体でありによる 2-アミノプリンの蛍光強度 (約 370 に発光ピークを持つ nm) はローカル構造的な環境変化に敏感とバインド サイト (PNA 近く設立による 2-アミノプリンの残基三重鎖形成の監視に適しています図 6)31. 多く他の染料は目に見える範囲で蛍光性の放出を示すとは異なり 2-アミノプリン標識 RNA が写真漂白なし室内灯に公開できます。実行バッファー pH 8.3 がしばしば必要となるページの実験とは異なりによる 2-アミノプリンの蛍光滴定指定した pH で 1 つのソリューションに結合の測定が可能、測定と比較的弱いの検出可能性があることと速度論的に不安定な平衡のバインディングします。
UV 吸光度検出熱溶融実験許可二重 (図 7)31とトライの熱安定性の測定プレックス30,32,44,45。長さとシーケンスの組成によっておしゃれの融解は、明確な転移を示さないかもしれない。熱力学的パラメーターは、加熱と冷却曲線が重なっている場合に得られるかもしれない。等温滴定熱量測定 (ITC)32; 正確な熱力学的パラメーターを取得します。ただし、比較的大量のサンプルが ITC の一般的に必要です。

<table><tbody><tr><td>モレキュラーシーブ、4A、直径1-2mmのペレット&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>4-メチルベンズヒドリルアミン塩酸塩 (MBHA&Yuml;HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>532444</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジイソプロピルエチルアミン (DIPEA)</td><td>Alfa</td><td>Aesar A11801</td><td></td></tr><tr><td>(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhyride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser Test Kit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸 (TFA)</td> <td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>未修飾 PNA モノマー</td><td>ASM Research Chemicals GmbH</td><td>5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>チオアニソール</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>1,2-エタンジチオール</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoromethanesulfonic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&reg; 100 RP-18 エンドキャップ (5 &micro;m) LiChroCART&reg;250-4</td><td>メルクミリポア</td><td>150838</td><td></td></tr><tr><td>RNA オリゴ&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>カスタマイズ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&α;-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N.N'-メチレンビスアクリルアミド</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>146072</tr><tr><td>過硫酸アンモニウム (APS)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td><td>1st Base</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&nbsp;</td><td>プロメガ&nbsp;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>臭化エチジウム (10 mg/mL)</td><td>Bio-rad&nbsp;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>高精度セル(Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td><td>Hellma Analytics&nbsp;</td><td>105.250-QSの</td><td></td></tr></tbody></table>

一本鎖 rna の二重鎖 rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Rna の重要なバイオ マーカーおよび治療上のターゲットとして浮上しています。従って、化学プローブや RNA 配列および構造の認識のため治療上の配位子の開発に大きな可能性があります。化学修飾ペプチド核酸 (PNA) オリゴマーが最近開発されているシーケンス固有の方法で RNA 二重鎖を認識することができます。PNAs は中立的なペプチドのようなバックボーンを持つ化学的に安定しています。PNAs は、その手動 Boc 化学固相ペプチド合成法によるは簡単に比較的合成することができます。PNAs、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化-時間飛行 (MALDI-TOF) の分子量特性によって続いて逆相 HPLC により精製しました。非変化のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) 法を容易に三重鎖形成のイメージングを慎重に設計無料 RNA 二重を構築し、PNA は頻繁におしゃれをバインドされているのでショー別の移行率。エチジウム ブロマイド ポスト染色と非変性のページはしばしば結合親和性と PNA オリゴマーの特異性を特徴付けるための簡単で有益な技術です。通常、複数の RNA のヘアピン構造または単一塩基変異は、PNA のバインディング プロパティ、親和性と特異性のバインドなどの特性評価に使用できます。による 2-アミノプリン アデニン (6-アミノプリン); の異性体でありによる 2-アミノプリンの蛍光強度はローカル構造的な環境変化に敏感な三重鎖形成による 2-アミノプリンの残基の PNA 結合部位付近の監視に適しています。による 2-アミノプリンの蛍光滴定は、一本鎖 Rna (ssRNAs) をバインディング ターゲットの二本鎖 Rna (二本) へ変更された PNAs 性を確認する使用できます。UV 吸光度検出熱溶融実験許可 PNA RNA 二重鎖と PNA· の熱安定性の測定RNA2おしゃれ。ここで合成について述べる、PNA オリゴマーを組み込むの精製残基を変更変更 PNAs によって RNA 二重鎖の認識の生化学的および生物物理学的法を記述します。

逆相高速液体クロマトグラフィーでは、PNA オリゴマーの浄化をことができます。我々 は、高速液体クロマトグラフィー精製 (図 3) の 2 つのラウンドで純粋な PNA オリゴマーを取得できます。MALDI-TOF 分析 (図 4) によって、PNAs の id を確認できます。
非変性のページは結合親和性と PNA オリゴマーの特異性を特徴付けるため簡単で有益な手法です。私たち通常使用複数の RNA のヘアピン構造や二重単一塩基変異を持つバインディング プロパティ (図 5) を特徴付けるため。非変化ページのデータを図 5に示すように明確に示唆している、Q と L-修飾 PNA C G ペア (図 5B底板) で dsRNA 領域を認識できる (図 5B、トップ C G ペアがないものではないが、パネル)。この特定と強化された認識は、T·、A U、L·G-C、および q ·C G PNA·RNA2基本トリプル (図 1A C D) の形成。1 つまたは複数の遺伝子変異を有する様々 な PNAs も変更された PNA の改良された結合特性を発揮する使えます。インキュベーション バッファーに 2 mM Mg2 +を追加するバインドは影響しませんを示した大幅31。
Q と L 変更の PNA にバインド ターゲット dsRNA 地域 (図 6A, 6 C, 6 D) がいない宿主 (図 6B、6 e、6 f) による 2-アミノプリン蛍光滴定法により実証しました。PNA P3 は 0.8 ± 0.1 μ M のKのd値を持つ 2-アミノプリン ラベル dsRNA にバインドします。370 で蛍光強度 2-アミノプリン ラベル宿主の nm、宿主の PNA P3 結合の欠如を示す、P3 濃度が異なると比較的一定している残る。
PNAs の融解転移 (図 7)、宿主へのバインドがないことを示すない熱 Q 残留 (P2、P3) ショーを含みます。これ立体衝突 Q G ペアのようなワトソン Crick に存在ためです。未変更の PNA P1 と比較して、PNAs P4 と P5 を含む変更 L 残基がない Q 残留、ショーは立体衝突 L G ペアのようなワトソン Crick の存在により対応する RNA PNA デュープレックスの溶解温度を減少しました。UV 吸光度検出熱溶融データも Q と L 残基を含む PNA は宿主にかなりバインドできません表示による 2-アミノプリンの蛍光滴定データと一致している (図 6B、6 e、6 階)。Q ベース ワトソン Crick 様 L G ペア (図 1E と比較してワトソン Crick 様 Q G ペア (図 1F) の形成でより重要な立体衝突があり、L ベースよりもより不安定 Q ベースを組み込むことは).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
図 1: 安定した基本トリプルと不安定な塩基対の構造の化学構造。(A ~ D)主要な溝 PNA·T· の RNA2基本組(A) A U, C+·G-C (B) L·G C (C)、および q ·C G (D)。(E, F)L G (E) と (F) - G の Q の PNA RNA 塩基対のような不安定なワトソン Crick。R の文字は、RNA の糖リン酸塩のバックボーンを表します。水素結合は、黒の破線で示されます。図は参照31から再現します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
図 2: PNA 単量体の化学構造。4 PNA モノマー (T、C、L、および Q) が表示されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
図 3: PNA オリゴマーと RP hplc 精製の化学構造。(A) PNA シーケンス P3 の化学構造。(B、C)原油の PNA P3 のクロマトグラフィー データ (B) PNA P3 を再精製 (C)。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
図 4:精製 PNA P3 の MALDI-TOF スペクトル。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
図 5:RNA のヘアピンと PNA シーケンスおよび非変化のページによるバインディングの評価。(A) RNA のヘアピン (rHP1 と rHP2)、PNA P3 と、PNA·PNA P3 と rHP2 間に RNA2三重が形成されました。(B) 非変性ページ (12%) は、rHP1 と PNA P3 への rHP2 結合の結果します。インキュベーション バッファーは 200 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、20 mM HEPES、pH 7.5 です。読み込まれた RNA のヘアピン (rHP1 と rHP2) は、20 μ L で 1 μ M にあります。左から右への車線で PNA 濃度が 0、0.2、0.4、1、1.6、2、4、10、16、20、28、50 μ M. PNA P3 にバインドされません rHP1 と rHP2 (上部パネル) がバインド (底板)。(C) Kd定量 rHP2 P3 バインディングのため。三重鎖形成 (Y) の割合は、PNA の濃度に対してプロットしました。図は参照31から適応です。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
図 6: PNA P3 バインディングの蛍光滴定法の研究2-アミノプリン標識 Rna。による 2-アミノプリンの残渣は、RNA シーケンスに '2' として指定されます。インキュベーション バッファーは 200 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、20 mM HEPES、pH 7.5 です。(A)、PNA·P3 と 2-アミノプリン ラベル dsRNA (dsRNA2 2AP) 間に RNA2三重が形成されました。P3 と 2-アミノプリン ラベル宿主 (ssRNA2 2AP) 間に (B) A 仮想 PNA RNA 二重が形成されました。(C、 E)蛍光発光スペクトル 2-アミノプリン標識 RNA 二重 (1 μ M) と宿主 (1 μ M) のそれぞれと様々 な pH 7.5 で P3 濃度。ピークで約 475 nm は PNA の L ベースの弱い蛍光発光によるもの。(D, F)Kによる 2-アミノプリンの蛍光強度のプロットに基づくd定量 (370 で nm) の RNA 二重と宿主、PNA P3 濃度対それぞれ。図は参照31から適応です。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
図 7: 熱溶融性二本鎖 RNA PNA の結果。インキュベーション バッファーは 200 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、20 mM NaH2PO4、pH 7.5 です。すべてのサンプルには、単一座礁させた RNA (ssRNA1) ・ 130 μ。 (A) 単一座礁させた rna (ssRNA1) PNA、PNAs (P1、P2、P3、P4、P5) PNA P3 と平行方向に ssRNA1 間に形成された仮説的な PNA RNA 二重の 5 μ M が含まれています。Q G と L G ペアのようなワトソン Crick の立体の衝突は示されます。異なる PNAs の曲線に (B) 溶融 ssRNA1 へのバインディングします。溶ける温度が融点が遷移曲線の表示されます。図は参照31から適応です。

今回は合成のためのプロトコル、ペプチド核酸 (PNA) オリゴマーを組み込むの精製変更残基。PNAs の変更によって RNA 二重鎖の認識の特性の生化学的および生物物理学的方法を説明します。

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

本メソッド記事の全体的な目的は、化学修飾ペプチド核酸による二本鎖RNAの分子認識を研究するために、当研究室で利用している詳細なプロトコルを紹介することです。この手法は、RNA構造の検出や標的化など、RNA化学生物学分野における重要な課題の解決に寄って役立ちます。本手法の主な利点は、その設計原理があらゆるRNA二本鎖構造の標的化に適用可能であることです。本手順のデモンストレーションは、私の研究室のリサーチアソシエイトであるDesiree Tohが行います。この手順を開始するには、あらかじめ調製したRNA PNAサンプルに35%グリセロール溶液を4 µL加え、穏やかに混合します。マイクロピペットとゲルロードチップを用いて、気泡が入らないように注意しながら、各サンプルを20 µLずつあらかじめ調製したポリアクリルアミドゲルに慎重に分注します。250 Vの定電圧で5時間、ゲル電気泳動を行います。5時間後、電源装置を切り、ゲルスタンドからガラスプレートを取り出します。次に、ゲルのシーリングテープを剥がし、ガラスプレートを分解します。ゲルをガラスプレートからそっと取り出し、350 millilitersの脱イオン水が入った容器に入れます。容器に35 microlitersのエチジウムブロマイドを注意深く加え、プラットフォームシェーカーを用いて低速で30分間振とうします。エチジウムブロマイド溶液を廃棄した後、ゲルを1.5から2 litersの蒸留水で洗浄します。次に、532 nmのグリーンレーザーを搭載したイメージャーを用い、エミッションフィルターを610 nmに設定してゲルをスキャンします。フリーソフトを使用してゲルのバンド強度を定量してください。適切な量の2-アミノプリン標識二本鎖RNAを、清潔な1.5 mLチューブに移します。次に、真空濃縮機を用いてRNA溶液を濃縮します。続いて、あらかじめ調製したメインストックから、各濃度に応じた目的のPNAの適量を、別々の1.5 mLチューブに分注します。真空濃縮機を用いてPNA溶液を濃縮してください。乾燥したRNAが入ったチューブに975 µLのインキュベーションバッファーを加え、すべてのRNAが完全に溶解するように十分に混合します。RNA溶液を短時間遠心分離した後、あらかじめ加熱したヒートブロックにチューブを10分間置き、アニーリングを行います。完了後、ヒートブロックの電源を切り、サンプルを室温まで冷却させます。乾燥させたPNAを含む各チューブに75 µLのRNAを加え、十分に混合します。サンプルを室温で少なくとも1時間静置した後、4°Cで一晩インキュベートします。次に、適切な量の2-アミノプリン標識一本鎖RNAを、別の1.5 mLチューブに分注します。メインストックから、様々な濃度の標的PNAを適切な量ずつ、一本鎖RNAを含む各チューブに分注します。サンプルを乾燥させた後、各チューブに75 µLのインキュベーションバッファーを加え、十分に混ぜ合わせます。各チューブをあらかじめ加熱したヒートブロックに10分間置き、各サンプルをアニーリングさせます。サンプルを室温まで冷却した後、4 °Cで一晩インキュベートします。次に、各サンプルを70 µLずつ1 cm四方のキュベットに移します。キュベットを蛍光分光光度計に設置し、330から550 nmの波長範囲で放出光を測定します。測定が完了したら、キュベットからバッファーを取り除きます。キュベットを蒸留水で洗浄し、窒素ガスで乾燥させます。すべてのサンプルで測定を繰り返した後、蛍光強度を波長に対してプロットします。適切な量の一本鎖RNAを、個別の1.5 milliliterチューブに移します。次に、メインストックから適切な量の標的PNAを、一本鎖RNAを含む各チューブに移します。サンプルを乾燥させた後、各チューブに130 microlitersのインキュベーションバッファーを加え、十分に混合します。各チューブをあらかじめ加熱しておいたヒートブロックに入れ、10分間アニーリングを行います。サンプルを室温まで冷却した後、4 °Cで一晩インキュベートします。次に、各サンプル130 µLを、インキュベーションバッファーが入った8マイクロセルキュベットの各セルに分注します。UV-Vis分光光度計を用いて、各サンプルの260ナノメートルにおける吸光度を測定します。温度を15°Cから95°Cまで上昇させ、続いて95°Cから15°Cまで下降させながら、昇温・降温速度 0.5°C/分で測定を行います。PNAオリゴマーは、2回の逆相HPLC精製を経て得られたものを使用しました。PNAの同一性はMALDI/TOF分析によって確認できます。非変性PAGEのデータから、QおよびL修飾PNAはC-Gペアを持つ二本鎖RNA領域のみを認識できることが示唆されました。この特異的かつ強化された認識は、T-A-U-L-G-CおよびQ-C-G PNA RNAの2塩基トリプレックス形成によるものです。2-アミノプリン蛍光滴定研究により、QおよびL修飾PNAは標的の二本鎖RNAには結合するが、一本鎖RNAには結合しないことが示されました。Q残基を含むPNAは熱融解転移を示さず、これはWatson-Crick様Q-Gペアにおける立体障害のため、一本鎖RNAへの結合が起こらないことを示唆しています。未修飾PNAであるP1と比較して、L残基を含むPNA P4およびP5は、Watson-Crick様L-Gペアにおける立体障害により、対応するRNA-PNA二本鎖の融解温度が低くなっています。UV吸光度で検出した熱融解データは、QおよびL残基を含むPNAが一本鎖RNAに強く結合しないことを示す2-アミノプリン蛍光滴定データと一致しています。Q塩基の導入はL塩基よりも不安定化が進みます。これは、Watson-Crick型に類似したQ-Gペアの形成において、Q塩基がより顕著な立体障害を持つためです。習熟すれば、適切に実施することで、これらのさまざまな実験を1週間で完了させることができます。この手順に続き、細胞内のRNA構造のプロービングやターゲティングなどの他の手法を実施することで、二本鎖RNA結合PNAを用いてRNA構造を検出できるか、またRNA機能を制御できるかといったさらなる疑問を明らかにすることができます。この技術の開発により、RNA生物学および疾患分野の研究者が、RNA構造を標的とした治療薬開発を探索するための道が開かれました。

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RNA-タンパク質相互作用は、多くの細胞プロセスの中心にあります。ここでは、特定のRNAを単離し、それに関連する新規タンパク質を同定するin...

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

RNA 結合蛋白質を識別し、紫外線による光架橋と質量分析法を用いた生細胞におけるその RNA...

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

この RNA プルダウン法は、長い非コード RNA (lncRNA) の RNA ターゲットを識別することができます。自家製、設計されたアンチセンス DNA のオリゴヌクレオチドのプローブ適切に固定ティッシュまたは細胞のこの lncRNA に固有の交配に基づいて、それは効率的に、lncRNA のすべての RNA...

RNA プルダウン長い非コード RNA の RNA 標的を識別する手順

二本鎖 RNA ウイルス RNA の複製中に生産は、生来の免疫応答を誘導するパターン認識受容体によって認識できます。否定的な感覚の RNA のウイルスの低レベルの dsRNA と PRRs の相互作用は不明します。アレナ ウイルス科 dsRNA と個々 の細胞における PRR...

二本鎖 RNA と否定的な感覚の RNA のウイルス感染におけるパターン認識受容体の共焦点レーザー顕微鏡

配列特異性は遺伝子調節に不可欠です。特定の配列を認識する調節タンパク質は、遺伝子調節にとって重要です。このようなタンパク質に対する機能的結合部位の定義は、困難な生物学的問題である。RNA結合タンパク質の結合部位を同定するための反復的アプローチをここに説明し、すべてのRNA結合タンパク質に適用可能である。...

調節RNA結合タンパク質の結合部位を同定するための配列空間の探索

変化したヌクレアーゼ活性は、バイオマーカーとしての可能性の根底にある異なるヒト条件に関連している。本論文で提示されるモジュラーで実施しやすいスクリーニング方法論により、疾患のバイオマーカーとしてヌクレアーゼ活性を利用するための特異的核酸プローブを選択することができる。...

核酸プローブを用いたヌクレアーゼ活性の運動スクリーニング

MALDI−TOFを用いて、酸化されたRNAとエキソリボヌクレアーゼXrn−1との間の反応性から得られた断片を特徴付けた。本プロトコルは、RNAおよび/またはDNAを含む他のプロセスに適用できる方法論を記載する。...

MALDI−TOF質量分析法を用いた酵素分解によるRNA断片の同定

本プロトコルは、標的を検出するための高速3段階のアプタマーベースの指数増幅アッセイの使用を実証する。サンプル調製、シグナル増幅、および発色をカバーして、カフェインよりもテオフィリンの存在を認識するこのシステムを実装します。...

3段階G四重鎖等温指数増幅反応によるアプタマーベースのターゲット検出(英語)

DNAzymeベースのナノマシンは、核酸の高選択性と高感度な検出に使用できます。この記事では、フリーソフトウェアを使用した10-23コアのDNAzymeベースのナノマシンの設計に関する詳細なプロトコルと、例としてEpstein-Barrウイルスフラグメントの検出におけるそれらのアプリケーションについて説明します。...

DNAzyme 10-23 - 核酸認識用ナノマシン

学ぶ化学修飾ペプチド核酸による二重鎖RNAの選択的認識プロトコル。蛍光分光光度法とUV-Vis分光光度法を用いて、PNAのRNA結合特性と熱安定性を評価する方法を解説します。

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

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