Name: 機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: 学ぶHIV-1 Nefタンパク質の機能的モチーフの同定とペプチド阻害剤の開発。ペプチドスキャン、アポトーシスアッセイ、共免疫沈降を用いて、アポトーシス誘導とエクソソーム分泌に関与するモチーフを特定し、競合阻害ペプチドを検証する方法を解説します。

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この作品は、NIH / NIGMS / MBRを（グラント58268）、NIH / NCRR / RCMI（グラントG12-RR03034）、ジョージアリサーチアライアンス資金助成GRA.VAC08.W、NIH / NIAID / NRSA助成F31AI091484、エモリーCFAR助成P30によってサポートされていましたA1050409。この調査はNIH / NCRRから研究設備整備グラント＃C06 RR18386からのサポートで構成施設で実施された。 Jurkat細胞を、20組のHIV-1 Nefのペプチド、ならびにウサギ抗HIV-1 Nefの抗血清は、NIH AIDSリサーチ＆文献試薬プログラム（ロックビル、MD）から入手した。

I.は、生物学的解析でショートペプチドの使用 I.1。ペプチドを用いて生物学的に機能モチーフのマッピング<ol><li> Nefの走査ペプチドで細胞を処理する<ol><li>関心領域を走査するペプチドのセットを調達。全体のHIV-1のNefタンパク質（205 AA）をまたがる10のアミノ酸重なると私たちの実験では、20merのペプチドについては、エイズ試薬プログラムから得られた。ペプチドは、次のように個別に分析しています： </li><li>細胞培養培地にペプチド10ngの/ mlを加える。 </li><li>細胞培養をジャーカットするプレートあたり培地10mlのを追加します。 </li><li> 37℃で24時間培養する℃に</li></ol></li><li>ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPをビオチンニック末端標識（TUNEL）アポトーシスのアッセイ<ol><li> 1X PBSで細胞を洗浄し、1×PBS、pH7.4の中の4％パラホルムアルデヒドで室温で30分間固定する。 </li><li> 10 1X PBSで洗浄し、0.1％と透過性トリトンX-100室温で分。 </li><li> 1X PBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li>コンピュータ制御顕微鏡システム上落射蛍光で染色された細胞をカウントします。 </li></ol></li></ol> I.2。ペプチドを用いた競合阻害分析<ol><li>チャリオットタンパク質デリバリー試薬キットを用いたペプチドの同時トランスフェクション<ol><li>トランスフェクション反応混合物につき、と100μlの最終容量を、wtNef-GFPプラスミドDNA1μgのとSMRモチーフ内の個々のアミノ酸のアラニン置換を含む野生型SMRドメイン由来のペプチド、またはペプチドどちら100ngのを希釈1X PBS。 </li><li>滅菌水で100μlの最終容量にチャリオット試薬の1/10に希釈6μLを希釈し、希釈したDNA-ペプチドミックスと組み合わせる。 </li><li>戦車/ DNA-ペプチド複合体の形成を可能にするために30分間室温でインキュベートする。 </li><li> 5分間600×gで遠心分離によってペレット3×10 5 Jurkat細胞。 </li><li> 1X PBSで2回細胞を洗浄し、チャリオット/ DNA-ペプチド複合体で再懸濁します。 </li><li>懸濁液に無血清RPMI1640培地400μlのを追加し、2時間37℃で培養プレートで細胞を培養する。 </li><li>各プレートに10％FBSを含む新鮮なRPMI 1640培地1mlを加え、37℃で48時間、細胞をインキュベート℃に</li><li>収穫細胞や蛍光顕微鏡法によるトランスフェクション効率を決定する。 </li></ol></li><li>ペプチド阻害のNEF-GFP分泌蛍光プレートリーダーアッセイ<ol><li>収穫された細胞からの無細胞馴化培地を収集し、96ウェル黒色マイクロタイタープレートの各ウェルに100μlのを転送します。 </li><li>励起波長485 nmおよび発光波長の相対蛍光単位で515 NmのテカンGENEiosの蛍光のメディアでGFPの蛍光を測定します。 </li><li>コントロールでGFP蛍光のレベルを設定する（セルからメディアがネフ-GFPとスクランブルペプチドと共トランスフェ）100％時。 </li><li>ネフ-GFPの分泌の変化を判断するために、様々なSMRペプチドを共トランスフェクトした細胞からメディアにおけるGFP蛍光のレベルにこれを比較してください。 </li></ol></li></ol> I.3。餌としてペプチドを用いMotifの結合パートナーを分離<ol><li> SMRのペプチドと免疫共沈降<ol><li> 37℃、10％FBSを含有するRPMI 1640培地中Jurkat細胞を成長さT-75組織培養フラスコ内℃、4℃で20分間、1,000×gで遠心分離によって細胞をペレット化℃でトランスフェクション効率を決定し、蛍光顕微鏡下でプレートを配置することにより、画像をキャプチャし、その後、合計と標識された細胞をカウントし、パーセント標識された細胞を決定します。 </li><li> 1ミリリットル1X PBSで細胞ペレットを再懸濁し、そして1.5 mlのエッペンドルフチュー​​ブに移す。 1分間、1,000×gで遠心。穏やかなピペッティングにより1ミリリットルα-FLAGの溶解バッファーでペレットを再懸濁します。溶解バッファー：ミックス50mMトリス•HClでpHは7.4、150mMのナトリウムCHLoride [塩化ナトリウム]、1mMのEDTA、1％トリトンX-100、1mMのフェニルメチルスルホニルフッ化[PMSF]、および哺乳動物細胞や組織抽出物で使用するために10ミリリットル/μlのプロテ​​アーゼインヒビターカクテル[PIC;シグマ]。使用する前に、すぐに確認します。 </li><li>差動で5分間2,000 xgで遠心懸濁液を、ペレットに10分、細胞破片やDNA、それぞれ13,000 xgで。上清（以下、​​ &quot;溶解物&quot;ともいう）を収集。 </li><li>ライセートタンパク質1mgのとSMRwtまたはSMRmutペプチド抗FLAG M2アフィニティーゲル（;シグマ以下 &quot;樹脂&quot;と呼ばれる）20μlのいずれかに1μgのを追加します。ここで使用SMRwtとSMRmut両方がペプチドに埋め込まFLAGタグ配列を持っていることに注意してください。共同IP緩衝液中で1ミリリットル（α-FLAG溶解バッファーマイナスPMSFとPIC）の最終体積に混合物を持参してください。転倒回転に4℃で一晩混合物をインキュベートする。陰性対照として、いずれかのペプチドの非存在下での樹脂との溶解液をインキュベート。 </li><li>ペレT 5,000で微量遠心により樹脂 - 30秒8,000×gで。樹脂サンプルを取り扱う前に2分のために解決することを許可した後、上清を吸引。任意の樹脂を転送しないように注意しながら、先端の細いピペットチップ、またはハミルトンシリンジで上清を取り除きます。先端の細いピペットチップは、それが部分的に閉じられるまでプラスチックピペットチップの開口部を挟持する鉗子を用いて作製することができる。洗浄バッファーを500μl（50mMトリス•塩酸pH7.4の、および150mMのNaCl）で樹脂を4回洗浄します。室温で30分間ロッカー/シェーカー上洗浄バッファーとインキュベート50μlの3X FLAGペプチド15μgの（シグマ）と結合した細胞タンパク質を溶出。 </li><li>レムリ試料緩衝液（Bio-Rad社）で沸騰、続いてアセトン沈殿により溶出液を濃縮する。 4〜20％のTris-HCl基準プレキャストゲル（Bio-Rad社）のSDS-PAGEでタンパク質を分離します。クーマシーブリリアントブルーR-250（Bio-Rad社）を用いてゲルを染色。注：質量分析同定実験のために（ <stronG&gt;図4A）、各条件（SMRwt、SMRmut、あるいは全くペプチドとの共-IP）は4連で行われ、4つのすべての溶出液は複製/総タンパク入力4mgの合計前アセトン沈殿にプールしていた条件）。 </li></ol></li><li>ネフ-GFPタンパク質と共免疫沈降<ol><li> 0.02％のTween 20（PBS-T）で1X PBS 1mlに抗GFPマウスモノクローナル2μgのとのDynabeadsプロテインG磁気ビーズ（Invitrogen社）を50μlを混ぜる。 4で1時間1.5 mlのエッペンドルフチュー​​ブに転倒回転との混合物をインキュベート℃に</li><li>上清を除去し、磁気プルダウンを許可する1.5 mlのMagnaSphereテクノロジー磁気分離スタンド（プロメガ社、マディソン、WI）にチューブを配置することによって、バッファからビーズを分離する。穏やかにピペッティングを用いたPBS-T 1mlの抗GFP被覆ビーズを洗浄してください。 </li><li> 1X RIPA 1mLでネフ-GFPトランスフェJurkat細胞+ 15メートルのために穏やかにピペッティングし、インキュベーションによってバッファを溶解氷の上である。 RIPA +バッファ：10X RIPA溶解緩衝液、pH7.4 [ミリポア、ベッドフォード、MA]滅菌水で1:10に希釈、0.02％アジ化ナトリウム[シグマ]、および0.1％ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、1mMのPMSF及び10μlのと/ mlのPICは、使用する前に、すぐに追加された。 </li><li>ペレットを10分間、2,000×gで微量遠心により細胞破片。上清（以下、​​ &quot;溶解物&quot;ともいう）を収集。 </li><li>抗GFP被覆ビーズに溶菌タンパク質1mgのを追加し、1X RIPA +バッファーが付いている1 mlに最終的なボリュームをもたらす、と4℃で1時間転倒回転との混合をインキュベート注：ペプチド競合研究のために、溶解物タンパク質1mgのは1X RIPAを1ml +バッファー、前抗GFP被覆ビーズに追加されるにSMRwtまたはSMRmutペプチド2μgのと共にプレインキュベートすることもできる。 </li><li>洗浄緩衝液1ml（50mMトリス•HClでpHを7.4、150mMのNaCl、および0.1％のTween 20）で再懸濁を通してビーズを洗浄。 4℃で5分のために転倒回転と共にインキュベートビーズfを分離ロム磁気分離スタンドを使用して洗浄します。それぞれ250ミリと300のNaClを含む洗浄バッファーでビーズ第二と第三の時間を洗ってください。 </li><li> 200μlのPBSにビーズを再懸濁し、きれいなチューブに混合物を転送し、磁気スタンドに洗浄からビーズを分離する。 95℃のLaemmliサンプル緩衝液で5分間°C、混合物を室温で10分間冷却し、次いで分離用マグネットスタンド上に混合物を配置し、上清を回収することができ（ &quot;溶出&quot;）50μlのビーズを沸騰。 </li><li> 8から16パーセントのトリス-HCl基準プレキャストゲルでSDS-PAGEによって溶出液のタンパク質を分離します。 </li></ol></li><li>質量分析<ol><li>物品税クマシー染色ゲルから目的のタンパク質バンド。 </li><li> 37で45分間℃で10mMの1,4 - ジチオスレイトール（DTT）のサンプルを減らす</li><li> 25℃で45分間、55 mMのヨードアセトアミド、℃でサンプルをアルキル化</li><li>試しグレードシングで一晩サンプルを消化37℃PSIN（Promega社）°C. </li><li> C-18 ZipTip（ミリポア社）で試料ペプチドを脱塩。 α-CHCマトリックス（Agilent Technologiesは、カリフォルニア州サンタクララ）でサンプルペプチドを混合し、MTPターゲットフレームIII（ブルカーダルト社、ビレリカ、MA）にそれらを見つける。 </li><li>タンデムマトリックス支援レーザー脱離/イオン化ブルカーダルトULTRAFLEX III TOF / TOFを使用して（MALDI-TOF/TOF）質量分析·飛行時間行う。 </li><li>マスコットアルゴリズム（使用してNCBI非冗長とスイス- ProtのデータベースへのMS / MSデータ比較<a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.comを</a> ）。 </li></ol></li><li>イムノブロット解析<ol><li> 4〜20％または8から16パーセントのトリス-HCl基準プレキャストゲル（Bio-Rad社）のSDS-PAGEによってタンパク質サンプルを分離する。ニトロセルロース膜に電気泳動バンドを転送します。 </li><li> 5分間;トリスでメンブレンを洗浄する（Bio-Rad社TBS）緩衝生理食塩水。 TTBSの5％脱脂乳を持つブロック（TBS 0.1％トゥイーン20）を、室温で振盪することによって1時間。 </li><li> 4℃で一晩振とうしながら、5％脱脂乳に特異的な一次抗体を用いたイムノブロッティング用膜を処理します。室温で1時間5％脱脂乳で二次HRPコンジュゲートのIgG（H + L）抗体、続いて20分間TTBSで洗ってください。 30-60分間TTBSで洗ってください。 </li><li>ウェスタンブロッティングルミノール試薬（サンタクルズ社、サンタクルーズ、カリフォルニア州）によってタンパク質バンドを検出します。写真フィルムにフィルタを公開します。注：いくつかの実験において、ストリッピング試薬は、異なる一次および二次抗体とのその後のハイブリダイゼーションメンブレン（ピアース、ロックフォード、IL）を除去するために使用された。 </li><li> Adobe Photoshopの5.0.2にX線フィルムをスキャンします。 ImageJのソフトウェア（国立衛生研究所、ベセスダ、MD）を使用して、デンシトメトリー分析を行う。 </li></ol></li></ol> II。機能解析で抗体阻害の利用 II.1。不格好なやつのコトランスフェクションチャリオットタンパク質デリバリー試薬キットを使用するIES <ol><li>トランスフェクション反応混合物につき、1X PBSで100μlの最終容量に、wtNef-GFPプラスミドDNA1μgのと抗モータリン抗体または抗α-チューブリン抗体のどちらか1μgのを希釈。注：これは、以前は、抗α-チューブリン抗体の同時トランスフェクションは、exNef分泌に検出可能な影響を与えず、従って、それはこれらの実験において有効陰性対照として役立つことが分かった。 </li><li>滅菌水で100μlの最終容量に原液チャリオット試薬の6μlの希釈し、希釈したDNA-抗体ミックスと組み合わせる。 </li><li>戦車/ DNA-抗体複合体の形成を可能にするために30分間室温でインキュベートする。 </li><li> 5分間600×gで遠心分離によってペレット3×10 5 Jurkat細胞。 </li><li> 1X PBSで2回細胞を洗浄し、チャリオット/ DNA-抗体複合体に再懸濁します。 </li><li>懸濁液に無血清RPMI1640培地400μlのを追加し、Cをインキュベート37℃で培養プレートでエルボで2時間C。 </li><li>各プレートに10％FBSを含む新鮮なRPMI 1640培地1mlを加え、37℃で48時間、細胞をインキュベート℃に</li></ol> II.2。抗体阻害のNEF-GFP分泌蛍光プレートリーダーアッセイ<ol><li>収穫された細胞からの無細胞馴化培地を収集し、96ウェル黒色マイクロタイタープレートの各ウェルに100μlのを転送します。 </li><li>励起波長485 nmおよび発光波長の相対蛍光単位で515 NmのテカンGENEiosの蛍光のメディアでGFPの蛍光を測定します。 </li><li>コントロールにおけるGFP蛍光のレベル（セルからメディアがネフ-GFPと抗α-チューブリン抗体で同時トランスフェクト）の100％に設定してください。 </li><li>ネフ-GFPの分泌の変化を判断するために抗モータリン抗体を共トランスフェクトした細胞からメディアにおけるGFP蛍光のレベルにこれを比較してください。 </li></ol>

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<li>Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+nef+gene+sequences+present+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo.</a> J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).</li>
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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

エキソソーム売買経路がexNef分泌のエンジニアリング小説の阻害に有用であろう操作するネフの能力のメカニズムを理解する。 exNef分泌の阻害は、CD4 T細胞の枯渇とCIAそのドライブHIV / AIDSの病因を減少させる必要があります。この目標に向かって、私たちは、私たちがexNef分泌の遺伝学を分析し、関与する細胞タンパク質を決定するために開始するために許可された斬新な試薬および方法論の数を開発しました。このアプローチはまた、直接exNefの分泌、SMRwtペプチドを対象とする第一の阻害剤​​の開発につながった。 我々の仕事の重要な発見は、我々の場合は全長タンパク質で見つかったモチーフに由来する特定の短いペプチド、HIV-1 Nefの、その生物学的機能を保持していないだけでなく、競争力のある、全長タンパク質の機能を阻害することができる。これらのペプチドは、その生物学的機能を維持するので、それらは、機能ドメインを識別するために使用することができる全長タンパク質である。二つのことが必要とされています：目的のタンパク質は、その全体の長さのどちらかまたはタンパク質の領域を走査するペプ...

抗レトロウイルス療法の出現により、西部の世界のエイズ流行は鈍化したが、縮小しない、そしてHIVの蔓延は、世界中の主要な健康上の負担であり続けてきた。わずかに効果的なRV144タイ裁判を除いて、HIVワクチンは、これまで感染から守るための失敗を示している。したがって、追加の、潜在的な治療標的の研究はまだ保証されています。 CD4 T細胞枯渇とともに、永続的な一般的な免疫活性化は、HIV感染症の特徴です。この慢性的な免疫活性化（CIA）は、細胞の代謝回転、活性化され、差別化リンパ球亜集団、細胞の枯渇や老化、及び活性化誘導細胞死（AICD）1,2,3を経由してT細胞とB細胞の殺害の増加につながり、それはよく病気の進行4,5,6,7,8,9,10,11,12最強の予測因子の一つとして確立されています。しかし、メカニズムはCIAとCD4の基礎となるHIV感染T細胞枯渇は完全に解明されていない。 私たちの研究室や他の人からの証拠は、HIVタンパク質ネフは（負の調節因子）HIV-1感染細胞13,14からエキソソームでその分泌を誘導する前記疾患の進行のためのモデル（ 図1）に私たちを導いた。これらネフ含有エキソソーム（exNef）が感染していないCD4 T細胞15,16を含む細胞系統数のアポトーシスを誘導する。あるいは、単球/マクロファージexNefを変化させる遺伝子の発現パターン、 例えば、サイトカイン発現、およびスケジュールされていない免疫活性化状態を誘導すると思われる。証拠のこのボディは、CIAとCD4 T細胞枯渇exNefための重要な役割を示唆している。 エキソソーム売買経路がexNef分泌のエンジニアリング小説の阻害に有用であろう操作するネフの能力のメカニズムを理解する。 exNef分泌の阻害は、CD4 T細胞の枯渇を減少させるべきであるそしてCIAそのドライブHIV / AIDS発病。 HIV / AIDS疾患の進行と、このモデルの上に構築され、その後のデータのための我々のモデルにつながった証拠を集めるために、私たちは私たちがexNef分泌の遺伝学を分析するために許可された斬新な試薬および方法論の数を開発し、決定するために開始細胞タンパク質が関与。初期の研究では、Nefのタンパク質が、バイスタンダー細胞のアポトーシスを誘導し、Nefのトランスフェクトし、HIV感染細胞から細胞外に15を解放していることがわかった。 SDF-1α由来のペプチドは、（選択的スプライシングアルファ因子-1由来間質細胞、）以前に、完全長分子17の結合およびシグナル伝達活性の多くを保持することが示されていた。我々はNefとのペプチドは、完全なタンパク質のアポトーシス活性の一部、及びこれらのペプチドは、必ずしもNefのアポトーシスのドメインを含むであろうことを保持するかもしれないと推測した。これらのペプチドを同定し、その結果のNefするにはアポトーシスドメイン（s）は、私たちは、NIH AIDS研究およびリファレンス試薬プログラムからの20 HIV-1 Nefのスキャニングペプチドのセットを取得しました。これらの20-AAペプチド、その隣人の各重複10アミノ酸は、彼らの最後のアミノ酸、 すなわち N20スパンネフアミノ酸1-20、N30スパンネフアミノ酸11-30、など16の数で名前が付けられています。我々は、これらの細胞のアポトーシスを誘導したフルレングスのNefタンパク質に二つの異なる10-AAドメインを重複特定のペプチドに細胞外にT細胞を露出することがわかった。これらネフ由来アポトーシスペプチドのその後の分析は、物理的にこれらのペプチドが競争CXCR4とその天然のリガンドがSDF-1αの間の結合を阻害するために許可された結合動態とT細胞の表面上のケモカイン受容体CXCR4と相互作用する能力を明らかにした。最後に、CXCR4とNefのアポトーシス誘導ペプチド &#39;相互作用は、アポトーシスをもたらすこれらのT-細胞におけるストレス応答を誘導することが見出された。この証拠はQUICに私たちを許さKLYマップネフの機能ドメイン、例えばアラニンスキャニング変異誘発のような標準的なDNA変異誘発技術を使用して、はるかに長い時間かかったでしょうプロセス。また、これらの短いNefの由来ペプチドは、全長タンパク質におけるアポトーシスドメインの生物学的機能を保持することを示した。 外ネフ、T細胞、すなわちアポトーシスの役割を同定したので、私たちは、ネフは細胞から分泌されたかの理解を求めた。変異ネフコンストラクトのシリーズを使用して、我々は、HIV Nefの両方のN末端 ​​領域で高度に保存されたのNefタンパク質モチーフにマッピングされ、exNef分泌13のために重要であるそのアカゲザル同等SIV マック （サル免疫不全ウイルス）ネフ、。これらのモチーフの一つで、分泌の変更地域（SMR、66VGFPV70）は、どちらか大幅に削減または廃止exNef分泌その5つのアミノ酸のうちのいずれかのアラニン置換として、特に重要でした。アクティブなモチーフのCを介して細胞に送達する場合hariotタンパク質デリバリー試薬、FLAGペプチド配列（SMRwt）に取り付けられたSMRを含むペプチドは、両方のNefのトランスフェクトし、HIV感染細胞18からexNef分泌を阻害することが見出された。ペプチドと私たちのこれまでの経験に基づいて、我々は、分子やexNef分泌のネフSMRの役割のメカニズムを解明するために、このペプチドを使用することを決めた。 私達の&quot;baitタンパク質&quot;としてSMRwtペプチドを使用して、我々は非感染T細胞溶解物18からSMRの細胞結合パートナーを共同免疫沈降。 FLAGペプチド配列は、抗FLAGアフィニティー樹脂を用いSMRwtペプチドを捕捉するための便利なハンドルを提供した。 SMRwtペプチドの変異をアラニンに単一のバリンがexNef分泌の阻害を廃止するために十分であることが我々の以前の発見は、私たちがSMRに特異的ではないの共免疫沈降したタンパク質を排除するために使用する便利な、非常に特異的なコントロールペプチド（SMRmut）を同定した。 sのペプチドを用いpecific興味のあるドメインではなく、全長タンパク質は、私たちは、ネフ19内の他のドメインに結合する細胞因子の数十のスクリーニングをバイパスすることができました。 かつて我々はSMR-結合パートナーを同定し、論理的な次のステップは、同定された細胞の結合パートナーは、生物学的機能18のために重要であることを示すことだった。これを実現するための標準的な手順は、標的タンパク質に特異的なmiRNA又はsiRNA、および生物学的機能に続いてアッセイを用いてノックダウン効果のタンパク質レベルである。我々は、この場合には、SMR結合タンパク質をそのターゲットの産生を減少させる、標的mRNAの翻訳を阻害する、miRNAのノックダウンを行う。標的タンパク質のこの減少は、間接的な効果であり、おそらく標的タンパク質が入っ従って、我々はまた、活性を直接破壊することかどうかを判断するために、あまり一般的抗体阻害技術を用い役割を果たしている生物学的機能で遅延効果を有する標的タンパク質は、生物学的機能を低減または排除する。この手順では、標的タンパク質に対して惹起された抗体は、戦車試薬を用いて細胞にトランスフェクトされ、その関数のサイトから標的タンパク質と直接相互作用のいずれか封鎖、またはその関連結合ドメインを遮断する。この手順を介して標的タンパク質の阻害は、直接その機能を破壊し、さらに生物学的機能に標的タンパク質の重要性を確認することにより、RNAのノックダウン手順を補完することができる。 戦車試薬は、細胞にペプチドおよびタンパク質を送達するのに有効であるが、このプロセスは時間がかかると、実験の種類を制限するなどの長時間または繰り返し暴露およびインビボ動物試験で行うことができる。したがって、我々は、受動的に細胞に取り込まれる可能性ペプチドを生成するためにSMRwtペプチド（CPP-SMRwt）18細胞透過性ペプチド（CPP）シーケンスを添加培地から。このバージョンでは、阻害exNef分泌の元と同じくらい効果的であった。 これらの公表の実験から得られた証拠は、競争力の阻害を介して、全長タンパク質の機能に拮抗し、これらのモチーフを結合するタンパク質を分離するために、特定の機能的なモチーフを含む小さなペプチドの能力を示しています。一つは、これらの技術は、多くの実験プロトコルに有用であることを期待する。また、多くの細胞プロセスの工学新規なペプチド阻害するのに有効であるべきである。CPPの配列への結合によってさらに向上させることができる機能。

<table><tbody><tr><td>20mer peptide set with 10 amino acid overlap</td><td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td><td>4641</td><td></td></tr><tr><td>TUNEL Assay</td><td>Roche</td><td>11 684 809 910</td><td></td></tr><tr><td>Chariot Protein Delivery Reagent</td><td>Active Motif</td><td>30100</td><td></td></tr><tr><td>Tecan GENEios fluorimeter</td><td>(Tecan Group, Switzerland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルブラックマイクロタイタープレート</td><td>Corning</td><td>3792</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G 磁気ビーズ </td><td>Invitrogen</td><td>100.03D</td><td></td></tr><tr><td>MagnaSphere Technology 磁気分離スタンド (2 ポジション)</td><td>Promega Corp., Madison, WI</td><td>Z5332</td><td></td></tr><tr><td>C-18 ZipTip </td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>C18 樹脂 (0.6 &mu;l または 0.2 &mu;Lベッドボリューム)。オリゴヌクレオチドまたは小さい(<水溶液中の50 kDa)タンパク質/ペプチド</td></tr><tr><td>MALDI TOF/TOF</td><td>Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

我々の場合、HIV-1 Nefので、全長タンパク質で見つかったモチーフ由来特有の短いペプチドは、その生物学的機能を保持するだけでなく、競争力のある、全長タンパク質の機能を阻害することができるだけでなく。 20のNef走査ペプチドは、各々がその隣の10アミノ酸が重複する長さが20アミノ酸のセットは、アポトーシスの誘導のための責任のNefでモチーフを同定した。これらのアポトーシスモチーフを含むペプチドは、完全長のNef蛋白質に匹敵するレベルでアポトーシスを誘導した。ネフの分泌の変更地域（SMR）から派生した第二のペプチドは、エキソソームにネフの分泌（exNef）に関与する細胞のタンパク質と相互作用する能力を保持した。このSMRwtペプチドはNefのSMRのモチーフに特異的に結合する細胞タンパク質を単離するために、共免疫沈降実験で &quot;餌&quot;タンパク質として使用した。タンパク質のトランスフェクションおよび抗体阻害は、物理的に相互作用ベットを破壊するために使用された予期するとNefのモータリン、単離されたSMR結合タンパク質の一つであり、効果は、蛍光ベースのexNef分泌アッセイを用いて測定した。 SMRモチーフをバインド細胞タンパク質の完全長のネフをoutcompeteするSMRwtペプチドの能力、それexNef分泌の最初阻害する。このように、完全長のタンパク質に見出さモチーフ由来特定の短いペプチドのユニークな特性を利用してここに記載された技術を採用することにより、一つのタンパク質における機能モチーフの同定と病原性機能のペプチド系阻害剤の開発を加速させる可能性があります。

ペプチドを用いた生物学的に機能モチーフのマッピング。二つの領域は、アポトーシスを誘導するのNefタンパク質で同定された。ペプチド主導アポトーシスはN60（AA40-60）とN70（aa50-70）でピークに達し、そしてペプチドN100（AA80-100）でのバックグラウンドレベルに減少、ペプチドN50（aa30-50）を用いて（ 図2）先頭を観察された。 aa50-60を中心とした主要なモチーフ1（M1）のピークは、フルレングスのNefタンパク質のアポトーシスレベルの&gt; 80％に誘導する。第二、小さいアポトーシスピークはペプチドN180（aa160-180）とN190を（aa170-190）スパニング観察された。 aa170-180を中心としたこのマイナーモチーフ2（M2）のピークは、フルレングスのNef蛋白質16のアポトーシスレベルの約30％を誘導する。 ペプチドを用いた競合阻害分析。図3では、無傷のSMRを含むペプチドが大幅exNef分泌を阻害し...

エキソソームにおけるHIV-1 Nefの分泌のメカニズムを分析するための技術が記載されている。ネフとタンパク質トランスフェクション由来特有の短いペプチドは、構造、機能、ネフの分泌の変更地域の結合パートナーを決定するために悪用された。これらの手順は、多くの機械論的研究で一般的な関連性を持っている。

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

本ビデオでは、機能的なHIV-1 Nefタンパク質モチーフの同定およびペプチドベースの阻害剤の開発に用いられる4つの実験セットを紹介します。フルレングス proteinsで見つかったモチーフに由来する特定の短鎖ペプチドは、その生物学的機能を保持し、かつフルレングス proteinsの機能を競合的に阻害するため、アポトーシスモチーフを同定することが可能です。HIV-1 Nefにおいて、Jurkat細胞をNefスキャニングペプチドに曝露し、TUNELアポトーシスアッセイを行うことで、アポトーシスを誘導するペプチドを同定します。NEF分泌モチーフの変異体を含む2番目のペプチドセット。分泌修飾領域（SMR）を細胞にトランスフェクトし、nphの分泌減少によって示される競争的阻害によるNPH GFPの機能喪失を確認します。nefの分泌修飾領域（SMR）と相互作用する細胞因子を特定するため、GFPを蛍光光度法で評価します。SMR野生型NPHをベイトとして共沈降法（Co-IP）を行います。最後に、これらの相互作用が分泌に影響を与えるかを確認するため、同定された結合パートナーに対する抗体を細胞にトランスフェクトします。これらがNFモチーフの分泌を阻害するかを評価した結果、NEFにおける2つの機能的なアポトーシスモチーフと、機能的なNEF分泌モチーフおよび分泌に必要な細胞内結合パートナーの両方を阻害するインヒビターペプチドが同定されました。これら4つの実験の全体的な目的は、標的タンパク質における機能的モチーフの同定を加速させ、そのデータを用いてこれらの機能的モチーフに対するペプチドベースの阻害剤を開発することです。一連のプロトコールは、neffによる分泌が病原性に果たす役割の理解や、エクソソーム輸送経路を操作するneffの能力の根底にあるメカニズムの解明など、HIVの病原性に関連する重要な疑問に答える上で、私たちのグループにとって有用でした。本日は、私の研究室のリサーチインストラクターであるDr. Ming Bo Huangが手順を実演します。この実験の関心領域をスキャンする一連のペプチドを用いて、この手順を開始します。HIV-1 NPHタンパク質全体をカバーする、10アミノ酸のオーバーラップを持つ20merペプチドをAIDSリジェントプログラムから入手しました。NPHアポトーシスモチーフを特定するために、NEFスキャンペプチドを用いて個別にアポトーシスアッセイを次のように実施します。Jurkat細胞培養の35 mmプレートあたり、10 ng/mLのペプチドを含む培地1 mLを加え、37 °Cで24時間培養します。インキュベーション後、アポトーシスを評価するために、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いたdUTP、ビオチンニックおよびラベル化、またはTUNELアッセイを行います。まず、細胞をPBSで洗浄し、PBSを吸引してPBS調製の4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で30分間インキュベートして細胞を固定します。細胞を固定した後、PBSで洗浄し、Triton X 100を加えて室温で10分間インキュベートし、透過処理を行います。細胞の固定および透過処理後、TUNEL試薬を加え、37°Cで1時間インキュベートします。細胞をPBSで2回洗浄します。次に、コンピュータ制御の顕微鏡システムを用いて、落射蛍光顕微鏡により染色細胞の割合を決定します。付属文書に記載されている通り、chariot protein delivery reagent kitを使用して、NPH、GFPプラスミド、およびSMRペプチドのさまざまなバリエーションをjca細胞に導入した後、培地を回収し、蛍光顕微鏡で導入効率を決定します。蛍光画像および明視野画像を撮影し、細胞の割合を決定します。次に、NPH GFP分泌の抑制を評価するために、細胞を含まない条件培地 100 µL を 96ウェル黒色マイクロタイタープレートの各ウェルに分注します。励起波長 485 nm、蛍光波長 515 nm に設定したフルオリメーターを用いて、培地中の GFP 蛍光を相対蛍光単位（RFU）で測定します。読み取りが完了した後、データをPCに転送します。コントロール培地におけるGFP蛍光レベルを100%に設定します。次に、これを様々なSMRペプチドを共導入した細胞からの培地におけるGFP蛍光レベルと比較し、NPH GFP分泌の変化を判定します。モチーフ結合パートナーを単離するための共免疫沈降（co IP）は困難な工程です。インキュベーション中はビーズを適切に撹拌させ、各洗浄ステップにおいてビーズから可能な限り多くの液体を除去してください。Jerk hat細胞を、10% FBS含有RPMI 1640培地を用いて、T75組織培養フラスコ内で37 °Cで培養します。4 °Cで1000 ×g、20分間の遠心分離により細胞をペレット化します。細胞ペレットを1 mLのPBSに再懸濁し、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。1000 ×gで1分間遠心分離します。その後、ペレットを1 mLのAnti-Flag溶解バッファーに懸濁し、マイクロピペットを用いて穏やかにピペッティングし、卓上遠心機で処理します。懸濁液を2000 ×gで5分間、次いで13,000 ×gで10分間遠心分離します。これにより、細胞残渣およびDNAをそれぞれペレット化し、以降ライセートと呼ぶ上清を回収します。タンパク質濃度を決定した後、1 mgのライセートタンパク質と、SMR野生型またはSMR変異型ペプチドのいずれかを1 µg、20 µLのAnti-Flag M2アフィニティゲルに加えます。このアフィニティークリスタルゲルを以下「レジン」と呼びます。混合物をco IPバッファーで最終容量1 mLにします。また、いずれのペプチドも加えずにライセートとレジンを混合した陰性コントロールも調製します。これらの混合物を4 °Cで一晩、エンドオーバーエンドローテーションを用いてインキュベートします。翌日、5,000から8,000 ×gで30秒間、マイクロ遠心分離機を用いてレジンをペレット化します。遠心分離後、レジンがチューブ内で安定するまで、サンプルを操作する前に1〜2分間待ちます。レジンを移さないように注意しながら、先端の細いピペットチップまたはハミルトンシリンジを用いて上澄みを除去します。レジンを500 µLの洗浄バッファーに懸濁させ、その後マイクロ遠心分離を行う操作を4回繰り返し、洗浄します。結合した細胞タンパク質を溶出させるため、50 µLの洗浄バッファーに溶解した15 µgの過剰な3x FLAG peptideをチューブに加え、ロッカースシェーカーで室温にて30分間インキュベートします。インキュベーション後、5,000～8,000 ×gで30秒間遠心分離します。チューブを2分間静置した後、溶出タンパク質を含む上清を回収して保存します。アセトン沈殿によりEITsを濃縮した後、サンプルをLaemmliサンプルバッファー中で加熱させます。その後、40〜20% Tris-HCl勾配プリキャストゲルを用いてSDS-PAGEによりタンパク質を分離し、Coomassie Brilliant Blue R-250でゲルを染色します。抗体による阻害を評価するため、付属文書に記載されているChariotタンパク質導入試薬キットを用いて、NGFPと、抗α-tubulin抗体またはanti-mortality抗体のいずれかをJCA細胞に共導入します。回収した細胞から細胞不含の条件培地を回収します。これを96ウェル黒色マイクロタイタープレートの各ウェルに100 µLずつ分注します。その後、フルオリメーターを用い、励起波長485 nm、蛍光波長515 nmにて、培地中のGFP蛍光を相対蛍光単位（RFU）で測定します。プレートの読み取り後、データをPCに転送し、抗ファトゥブリン（anti-fat tubulin）コントロールにおけるGFP蛍光レベルを100%に設定します。これを、抗モルタリティ抗体（anti mortality antibody）を共導入していない細胞の培地におけるGFP蛍光レベルと比較して、NEF GFP分泌の変化を決定します。HIV-1 Nefタンパク質のアポトーシスモチーフをマッピングするため、このビデオで説明した通りにペプチドスキャニング解析を行いました。Y軸はTUNEL陽性細胞の割合を示し、X軸はここに示される治療条件を表しています。HIV-1 Nefの2つの異なる領域がアポトーシスを誘導することが特定されました。これらは、Nefペプチドに曝露された細胞のTUNEL標識の増加によって示されています。アポトーシスのピークは、SMR野生型ペプチドによるNEF分泌の競合的阻害を評価するために、モチーフ1およびモチーフ2として指定されています。NPH GFPクローンと様々なSMRペプチドを共導入したJurkat T細胞からの培養培地を用いて、培地中のGFP蛍光により示されるエキソソーム性NPH分泌をアッセイしました。1つ以上の野生型NPH SMR配列モチーフを含むペプチドはエキソソーム性NEFの分泌を阻害しましたが、この領域内の任意のアミノ酸をアラニンに置換すると、ペプチドの有効性は大幅に低下しました。これは、SMR野生型ペプチドがエキソソーム性nph（NEFFのアポトーシスモチーフを11アミノ酸でスクランブル化したもの）を阻害することを示唆しています。以前に報告され、Sigma Genesisから入手したSM1を陰性対照として使用しましたが、エキソソーム性NEP分泌への影響は見られませんでした。クマシー染色したSDS-PAGEゲルのこの画像は、SMR野生型ペプチドによって、60、65、75、および250 kilodaltonのサイズの4つのタンパク質が共免疫沈殿していることを示しています。陰性コントロールであるSMR変異型ペプチドはこれらのタンパク質を捕捉せず、またこれらのタンパク質はアフィニティーレジンと非特異的に相互作用しませんでした。SMR野生型ペプチドが存在しない場合と対比して、これらの結果は、共沈殿したタンパク質がSMR野生型ペプチドのSMRモチーフと特異的に相互作用していたことを示唆しています。プレートリーダーによるアッセイの結果、抗mortal抗体とneph発現プラスミドを共 transfection すると、exo omal NPH分泌が完全に消失することが示されました。無関係な抗体では、exo omal ne分泌に影響は見られませんでした。これらの結果は、intact NM talent相互作用がexo omal neph分泌に必要であることを示唆しています。結論として、このビデオを視聴することで、標的タンパク質における機能的モチーフを同定するための記述的手法の使用方法と、そのデータを用いてこれらの機能的モチーフに対するペプチドベースの阻害剤を開発する方法について、十分な理解を深めることができたはずです。共免疫沈降（co IP）の手順を行う際は、インキュベーション時の洗浄操作を慎重に実行し、インキュベーション中にビーズを適切に撹拌させ、各洗浄ステップでビーズから可能な限り多くの液体を除去することが極めて重要です。また、細胞およびライセートのレジン洗浄においては、遠心分離後に必ずレジンを沈殿させてください。背景を許容レベルまで十分に低減させるため、先端の細いピペットチップを使用し、4回の洗浄を行ってください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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