機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別

このビデオでは、機能的なHIV One NPHタンパク質モチーフの同定とペプチドベースの阻害剤の開発に用いた4つの実験を紹介しています。全長タンパク質に見られるモチーフに由来する特異的な短ペプチドは、その生物学的機能を保持し、かつ、アポトーシスモチーフを同定するために全長タンパク質の機能を競合的に阻害します。HIVでは、1つのNEFジャークキャット細胞をNEFスキャンペプチドに曝露し、アポトーシスを誘導するペプチドを特定するためにトンネルアポトーシスアッセイを行います。

NEF分泌モチーフのバリエーションを含むペプチドの2番目のセット。分泌修飾領域またはSMRは、NPHのGFP機能喪失とともに細胞にトランスフェクションされ、nphの分泌の減少によって示される競合阻害により、GFPの機能が失われます。GFPは、nefの分泌修飾領域またはSMRと相互作用する細胞因子を特定するために、蛍光法によって評価されます。

カウン沈殿は、SMR野生型NPHを餌として行われます。最後に、これらの相互作用が分泌に影響を与えるかどうかを調べるために、同定された結合パートナーに対する抗体を細胞にトランスフェクションします。それらがNFモチーフの分泌に拮抗するかどうかを評価するために、得られた結果から、NEFの2つの機能的アポトーシスモチーフと、機能的なNEF分泌モチーフ、および分泌に必要なその細胞結合パートナーに拮抗する阻害剤ペプチドが同定されました。

この4つの実験セットの全体的な目標は、標的タンパク質における機能的モチーフの同定を加速し、そのデータを使用してこれらの機能性モチーフのペプチドベース阻害剤を開発することです。この一連のプロトコルは、病因におけるネフによる分泌の役割の理解や、エキソマ人身売買経路を操作するネフの能力の根底にあるメカニズムの解読など、HIVの病因に関連する重要な質問に答えるのに役立つ私たちのグループにとって役立っています。今日、その手順を実演するのは、私の研究室の研究講師であるMing Bo Huang博士です。

この手順は、この実験の関心領域をスキャンするペプチドのセットから開始します。HIV 1 NPHタンパク質全体にわたる10アミノ酸のオーバーラップを持つ20 merペプチドを、AIDS 試薬プログラムから取得しました。NPHアポトーシスモチーフを同定するためには、以下のようにNEFスキャニングペプチドを個々に用いたアポトーシスアッセイを行い、ジャークハットの35mmプレートにつきペプチド1ミリリットル当たり10ナノグラムのペプチドを含む培地を1ミリリットル加え、細胞培養し、37°Cで24時間培養物をインキュベートする。

インキュベーション後、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介DUTP、ビオチンニック、および標識またはトンネルアッセイを実施して、アポトーシスを評価します。これを行うには、まずPBSで細胞を洗浄し、次にPBSを吸引し、PBSに4%パラホルムアルデヒドを添加し、室温で30分間インキュベートして細胞を固定した後、細胞を固定し、PBSで洗浄し、Triton X 100を添加し、室温で10分間インキュベートして浸透させます。細胞を固定して透過させた後、トンネル試薬を添加し、透過性後、細胞を摂氏37度で1時間インキュベートします。

細胞をPBSで2回すすぎます。次に、コンピューター制御の顕微鏡システム上で落射蛍光によって染色された細胞の割合を決定します。添付の文献に記載されているように、chariot protein delivery reagent kitを使用してNPH、GFPプラスミド、およびSMRペプチドのさまざまなバリエーションでjca細胞をトランスセクトした後、培地を回収して蛍光顕微鏡でトランスフェクション効率を決定します。

蛍光画像と明視野画像を取得し、細胞の割合を決定します。その後、トランスフェクションしてNPH GFP分泌の阻害を評価し、100マイクロリットルの無細胞馴染培地を96ウェル黒色マイクロタイタープレートの個々のウェルに移します。励起波長485ナノメートル、発光波長515ナノメートルの蛍光計を使用して、媒質中のGFP蛍光を相対蛍光単位で測定します。

読み込みが完了したら、データをPCに転送します。コントロール培地中のGFP蛍光レベルを100%に設定し、これをさまざまなSMRペプチドと共トランスフェクトした細胞の培地中のGFP蛍光レベルと比較し、NPH GFP分泌の変化を決定します。モチーフ結合パートナーを単離するためのco IPは、難しいステップです。

インキュベーション中にビーズが適切に攪拌され、各洗浄ステップでビーズからできるだけ多くの液体が除去されていることを確認してください。ジャークハット細胞を、T 75組織培養フラスコペレット細胞中の摂氏37度で10%FBSを含むRPMI 1640培地で、Gの1000倍で摂氏4度で20分間遠心分離することにより増殖させます。細胞ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁し、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。

Gの1000倍で1分間回転します。次に、ペレットを1ミリリットルのアンチフラッグ溶解液に再懸濁します。微分微分マイクロ遠心分離機を穏やかにピペッティングして緩衝します。

サスペンションは、Gの2000倍で5分間、Gの13,000倍で10分間停止します。細胞残骸とDNAをそれぞれペレット化するために、以下ライセートと呼ぶ上清を収集します。タンパク質濃度を決定した後、1ミリグラムのライセートタンパク質と1マイクログラムのSMR野生型またはSMR変異ペプチドのいずれかを20マイクロリットルのAnti-Flag M twoアフィニティーゲルに加えます。

このアフィニティーゲルは、以下、混合物をco IP緩衝液中で最終容量1ミリリットルにする樹脂と呼ぶ。また、いずれのペプチドも存在しない状態でライセートを樹脂と結合するネガティブコントロールを調製します。混合物を摂氏4度で一晩インキュベートし、端から端まで回転させます。

翌日、5, 000 から 8, 000 倍 G を 30 秒間マイクロ遠心分離して樹脂をペレット化します。スピン後、1〜2分待ってからサンプルを取り扱い、樹脂がチューブ内に沈殿するのを待ちます。細い端のピペットチップまたはハミルトンシリンジで上清を取り除き、レジンを移さないように注意してください。

レジンをresusで4回洗浄し、500マイクロリットルの洗浄バッファーに懸濁した後、マイクロ遠心分離を行います。結合した細胞タンパク質を溶出します。50マイクロリットルの洗浄バッファー中のチューブに15マイクログラムの過剰な3 xフラグペプチドを加え、インキュベーション遠心分離機を5, 000〜8, 000回Gで30秒間インキュベートした後、ロッカーシェーカーで室温で30分間インキュベートします。

チューブが2分間落ち着くのを待った後、逃れたタンパク質を含む上清を収集して保存します。アセトン沈殿によりEITを濃縮した後、サンプルをlalyサンプルバッファーで沸騰させます。次に、40〜20%triss、HCL基準プレキャストゲルのSDSページでタンパク質を分離し、クマシブリリアントブルーR two 50でゲルを染色します。

添付文書に記載されているように、NMFPおよびAntifaチューブリンまたは抗死亡率抗体を使用してJCA細胞をトランスフェクションする抗体阻害を評価するには、回収した細胞から無細胞馴化培地を回収します。100マイクロリットルを96ウェルブラックマイクロタイタープレートの個々のウェルに移します。次に、励起波長485ナノメートル、発光波長515ナノメートルの蛍光計を使用して、媒質中のGFP蛍光を相対蛍光単位で測定します。

プレートを読み取った後、データをPCに転送し、抗脂肪チューブリンコントロールのGFP蛍光レベルを100%に設定しますこれを、抗死亡率抗体をトランスフェクトした細胞コットからの培地中のGFP蛍光レベルと比較して、NEF GFP分泌の変化を決定し、HIVのアポトーシスモチーフをマッピングします。このビデオで説明されているように、NPHタンパク質ペプチドスキャン分析を行いました。Y軸はトンネル標識された細胞の割合を示し、x軸は治療状態を示し、ここに示すように、アポトーシスを誘導するHIVの2つの別々の領域1つのNEFが同定された。これらは、ネフペプチドに曝露された細胞のトンネル標識の増加によって示されます。

アポトーシスのピークは、モチーフ1およびモチーフ2で示され、NPH GFPクローンおよび種々のSMRペプチドをtransectしたジャークCAT T細胞コットからのSMR野生型ペプチド培養培地によるネフ分泌の競合的阻害を評価するために、1つ以上の野生型NPH SMR配列モチーフを含有する培地におけるGFP蛍光によって示されるように、エキソオマルNPH分泌のアッセイがエキソオマルNEFの分泌を阻害した一方、この領域内の任意のアミノ酸をアラニンで置換すると、ペプチドの有効性が大幅に低下しました。これは、SM R野生型ペプチドが、ネフのアポトーシスモチーフの11アミノ酸スクランブルバージョンであるエキソオマールnphを阻害することを示唆しています。以前に記載され、Sigma Genesisから得られた1つのSMは、ネガティブコントロールとして使用され、exo omal NEP分泌に影響を与えませんでした。

このクマシ染色されたSDSページゲルの画像は、60、65、75、および250キロダルトンのサイズのSMR野生型ペプチドによる4つのタンパク質の共免疫沈降を示しています。ネガティブコントロールSMR変異ペプチドは、これらのタンパク質を捕捉せず、これらのタンパク質は、アフィニティー樹脂と非特異的に相互作用しなかった。SMR野生型ペプチドが存在しない場合、これらの結果は、カウン沈殿タンパク質がSMR野生型ペプチドのSMRモチーフと特異的に相互作用していたことを示唆しています。

プレートリーダーアッセイは、抗死抗体とネフ発現プラスミドのコットトランスフェクションがエキソオマールNPH分泌を完全に廃止することを示しています。無関係な抗体は、exo omal ne分泌に影響を及ぼさなかった。これらの結果は、エキソオマールネフの分泌には無傷のNMタレント相互作用が必要であることを示唆しています。

結論として、このビデオを見た後、describe技術を使用して標的タンパク質の機能的モチーフを特定し、そのデータを使用してこれらの機能モチーフのペプチドベース阻害剤を開発する方法について十分に理解しているはずです。co IPの手順を試行する際には、インキュベーション洗浄の実行に細心の注意を払い、インキュベーション中にビーズが適切に攪拌され、各洗浄ステップでビーズからできるだけ多くの液体が除去されるようにすることが重要です。また、細胞およびライセートレジンの洗浄中も、遠心分離後にレジンが常に沈殿します。

ナローエンドのピペットチップを使用し、4回の洗浄を行って、バックグラウンドを許容レベルまで適切に減