機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別

本ビデオでは、機能的なHIV-1 Nefタンパク質モチーフの同定およびペプチドベースの阻害剤の開発に用いられる4つの実験セットを紹介します。フルレングス proteinsで見つかったモチーフに由来する特定の短鎖ペプチドは、その生物学的機能を保持し、かつフルレングス proteinsの機能を競合的に阻害するため、アポトーシスモチーフを同定することが可能です。HIV-1 Nefにおいて、Jurkat細胞をNefスキャニングペプチドに曝露し、TUNELアポトーシスアッセイを行うことで、アポトーシスを誘導するペプチドを同定します。

NEF分泌モチーフの変異体を含む2番目のペプチドセット。分泌修飾領域（SMR）を細胞にトランスフェクトし、nphの分泌減少によって示される競争的阻害によるNPH GFPの機能喪失を確認します。nefの分泌修飾領域（SMR）と相互作用する細胞因子を特定するため、GFPを蛍光光度法で評価します。

SMR野生型NPHをベイトとして共沈降法（Co-IP）を行います。最後に、これらの相互作用が分泌に影響を与えるかを確認するため、同定された結合パートナーに対する抗体を細胞にトランスフェクトします。これらがNFモチーフの分泌を阻害するかを評価した結果、NEFにおける2つの機能的なアポトーシスモチーフと、機能的なNEF分泌モチーフおよび分泌に必要な細胞内結合パートナーの両方を阻害するインヒビターペプチドが同定されました。

これら4つの実験の全体的な目的は、標的タンパク質における機能的モチーフの同定を加速させ、そのデータを用いてこれらの機能的モチーフに対するペプチドベースの阻害剤を開発することです。一連のプロトコールは、neffによる分泌が病原性に果たす役割の理解や、エクソソーム輸送経路を操作するneffの能力の根底にあるメカニズムの解明など、HIVの病原性に関連する重要な疑問に答える上で、私たちのグループにとって有用でした。本日は、私の研究室のリサーチインストラクターであるDr. Ming Bo Huangが手順を実演します。

この実験の関心領域をスキャンする一連のペプチドを用いて、この手順を開始します。HIV-1 NPHタンパク質全体をカバーする、10アミノ酸のオーバーラップを持つ20merペプチドをAIDSリジェントプログラムから入手しました。NPHアポトーシスモチーフを特定するために、NEFスキャンペプチドを用いて個別にアポトーシスアッセイを次のように実施します。Jurkat細胞培養の35 mmプレートあたり、10 ng/mLのペプチドを含む培地1 mLを加え、37 °Cで24時間培養します。

インキュベーション後、アポトーシスを評価するために、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いたdUTP、ビオチンニックおよびラベル化、またはTUNELアッセイを行います。まず、細胞をPBSで洗浄し、PBSを吸引してPBS調製の4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で30分間インキュベートして細胞を固定します。細胞を固定した後、PBSで洗浄し、Triton X 100を加えて室温で10分間インキュベートし、透過処理を行います。細胞の固定および透過処理後、TUNEL試薬を加え、37°Cで1時間インキュベートします。

細胞をPBSで2回洗浄します。次に、コンピュータ制御の顕微鏡システムを用いて、落射蛍光顕微鏡により染色細胞の割合を決定します。付属文書に記載されている通り、chariot protein delivery reagent kitを使用して、NPH、GFPプラスミド、およびSMRペプチドのさまざまなバリエーションをjca細胞に導入した後、培地を回収し、蛍光顕微鏡で導入効率を決定します。

蛍光画像および明視野画像を撮影し、細胞の割合を決定します。次に、NPH GFP分泌の抑制を評価するために、細胞を含まない条件培地 100 µL を 96ウェル黒色マイクロタイタープレートの各ウェルに分注します。励起波長 485 nm、蛍光波長 515 nm に設定したフルオリメーターを用いて、培地中の GFP 蛍光を相対蛍光単位（RFU）で測定します。

読み取りが完了した後、データをPCに転送します。コントロール培地におけるGFP蛍光レベルを100%に設定します。次に、これを様々なSMRペプチドを共導入した細胞からの培地におけるGFP蛍光レベルと比較し、NPH GFP分泌の変化を判定します。モチーフ結合パートナーを単離するための共免疫沈降（co IP）は困難な工程です。

インキュベーション中はビーズを適切に撹拌させ、各洗浄ステップにおいてビーズから可能な限り多くの液体を除去してください。Jerk hat細胞を、10% FBS含有RPMI 1640培地を用いて、T75組織培養フラスコ内で37 °Cで培養します。4 °Cで1000 ×g、20分間の遠心分離により細胞をペレット化します。細胞ペレットを1 mLのPBSに再懸濁し、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。

1000 ×gで1分間遠心分離します。その後、ペレットを1 mLのAnti-Flag溶解バッファーに懸濁し、マイクロピペットを用いて穏やかにピペッティングし、卓上遠心機で処理します。

懸濁液を2000 ×gで5分間、次いで13,000 ×gで10分間遠心分離します。これにより、細胞残渣およびDNAをそれぞれペレット化し、以降ライセートと呼ぶ上清を回収します。タンパク質濃度を決定した後、1 mgのライセートタンパク質と、SMR野生型またはSMR変異型ペプチドのいずれかを1 µg、20 µLのAnti-Flag M2アフィニティゲルに加えます。

このアフィニティークリスタルゲルを以下「レジン」と呼びます。混合物をco IPバッファーで最終容量1 mLにします。また、いずれのペプチドも加えずにライセートとレジンを混合した陰性コントロールも調製します。これらの混合物を4 °Cで一晩、エンドオーバーエンドローテーションを用いてインキュベートします。

翌日、5,000から8,000 ×gで30秒間、マイクロ遠心分離機を用いてレジンをペレット化します。遠心分離後、レジンがチューブ内で安定するまで、サンプルを操作する前に1〜2分間待ちます。レジンを移さないように注意しながら、先端の細いピペットチップまたはハミルトンシリンジを用いて上澄みを除去します。

レジンを500 µLの洗浄バッファーに懸濁させ、その後マイクロ遠心分離を行う操作を4回繰り返し、洗浄します。結合した細胞タンパク質を溶出させるため、50 µLの洗浄バッファーに溶解した15 µgの過剰な3x FLAG peptideをチューブに加え、ロッカースシェーカーで室温にて30分間インキュベートします。インキュベーション後、5,000～8,000 ×gで30秒間遠心分離します。

チューブを2分間静置した後、溶出タンパク質を含む上清を回収して保存します。アセトン沈殿によりEITsを濃縮した後、サンプルをLaemmliサンプルバッファー中で加熱させます。その後、40〜20% Tris-HCl勾配プリキャストゲルを用いてSDS-PAGEによりタンパク質を分離し、Coomassie Brilliant Blue R-250でゲルを染色します。

抗体による阻害を評価するため、付属文書に記載されているChariotタンパク質導入試薬キットを用いて、NGFPと、抗α-tubulin抗体またはanti-mortality抗体のいずれかをJCA細胞に共導入します。回収した細胞から細胞不含の条件培地を回収します。これを96ウェル黒色マイクロタイタープレートの各ウェルに100 µLずつ分注します。その後、フルオリメーターを用い、励起波長485 nm、蛍光波長515 nmにて、培地中のGFP蛍光を相対蛍光単位（RFU）で測定します。

プレートの読み取り後、データをPCに転送し、抗ファトゥブリン（anti-fat tubulin）コントロールにおけるGFP蛍光レベルを100%に設定します。これを、抗モルタリティ抗体（anti mortality antibody）を共導入していない細胞の培地におけるGFP蛍光レベルと比較して、NEF GFP分泌の変化を決定します。HIV-1 Nefタンパク質のアポトーシスモチーフをマッピングするため、このビデオで説明した通りにペプチドスキャニング解析を行いました。Y軸はTUNEL陽性細胞の割合を示し、X軸はここに示される治療条件を表しています。HIV-1 Nefの2つの異なる領域がアポトーシスを誘導することが特定されました。これらは、Nefペプチドに曝露された細胞のTUNEL標識の増加によって示されています。

アポトーシスのピークは、SMR野生型ペプチドによるNEF分泌の競合的阻害を評価するために、モチーフ1およびモチーフ2として指定されています。NPH GFPクローンと様々なSMRペプチドを共導入したJurkat T細胞からの培養培地を用いて、培地中のGFP蛍光により示されるエキソソーム性NPH分泌をアッセイしました。1つ以上の野生型NPH SMR配列モチーフを含むペプチドはエキソソーム性NEFの分泌を阻害しましたが、この領域内の任意のアミノ酸をアラニンに置換すると、ペプチドの有効性は大幅に低下しました。これは、SMR野生型ペプチドがエキソソーム性nph（NEFFのアポトーシスモチーフを11アミノ酸でスクランブル化したもの）を阻害することを示唆しています。以前に報告され、Sigma Genesisから入手したSM1を陰性対照として使用しましたが、エキソソーム性NEP分泌への影響は見られませんでした。

クマシー染色したSDS-PAGEゲルのこの画像は、SMR野生型ペプチドによって、60、65、75、および250 kilodaltonのサイズの4つのタンパク質が共免疫沈殿していることを示しています。陰性コントロールであるSMR変異型ペプチドはこれらのタンパク質を捕捉せず、またこれらのタンパク質はアフィニティーレジンと非特異的に相互作用しませんでした。SMR野生型ペプチドが存在しない場合と対比して、これらの結果は、共沈殿したタンパク質がSMR野生型ペプチドのSMRモチーフと特異的に相互作用していたことを示唆しています。

プレートリーダーによるアッセイの結果、抗mortal抗体とneph発現プラスミドを共 transfection すると、exo omal NPH分泌が完全に消失することが示されました。無関係な抗体では、exo omal ne分泌に影響は見られませんでした。これらの結果は、intact NM talent相互作用がexo omal neph分泌に必要であることを示唆しています。

結論として、このビデオを視聴することで、標的タンパク質における機能的モチーフを同定するための記述的手法の使用方法と、そのデータを用いてこれらの機能的モチーフに対するペプチドベースの阻害剤を開発する方法について、十分な理解を深めることができたはずです。共免疫沈降（co IP）の手順を行う際は、インキュベーション時の洗浄操作を慎重に実行し、インキュベーション中にビーズを適切に撹拌させ、各洗浄ステップでビーズから可能な限り多くの液体を除去することが極めて重要です。また、細胞およびライセートのレジン洗浄においては、遠心分離後に必ずレジンを沈殿させてください。

背景を許容レベルまで十分に低減させるため、先端の細いピペットチップを使用し、4回の洗浄を行ってください。