質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

この手順の全体的な目標は、生細胞内のRNA結合タンパク質を同定し、UV媒介光架橋とそれに続く質量分析を使用してそれらのRNA結合領域をマッピングすることです。この方法は、どのエピジェネティックな調節因子がRNAに結合しているのか、その相互作用にはどのタンパク質領域が必要なのかなど、エピジェネティクスの分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、タンパク質RNA複合体の精製を伴わないため、材料をほとんど必要とせず、あらゆるタイプのRNAに結合したタンパク質を同定できることです。

提示されたように、この方法は私たちの科学的な関心事であるため核タンパク質に焦点を当てていますが、分画ステップにわずかな変更を加えることで、他のスチューヌラーコンパートメントのRNAおよび結合タンパク質の研究に使用できます。テキストプロトコルに従ってマウスESCを培養および増殖した後、細胞を必要な10cmプレートの数まで増殖させます。プレートがコンフルエントに達する前に、4つのSUを培地に直接加えて、最終濃度を500マイクロモルにします。

4sUコントロールディッシュは未処理のままにします。プレートを静かに振って4sUを培地全体に均一に分散させ、プレートを同じ組織培養インキュベーターに2時間戻します。4sUの取り込み効率は細胞の種類によって異なるため、効率的な架橋を確保し、毒性を最小限に抑えるために、その濃度とインキュベーション時間を最適化する必要があるかもしれません。

次に、プレートを氷のバケツに移し、培地を捨てます。次に、5ミリリットルの氷冷PBSを使用して、プレートをやさしくすすぎます。氷冷したPBSを2ミリリットル加え、蓋のないプレートをUV-B発光バルブを備えた架橋剤に入れます。

1平方センチメートルあたり1ジュールのエネルギー設定でプレートを照射します。効率的なUV架橋は非常に重要です。UV-B光の使用をお勧めしますが、UV-Aも使用できます。

いずれにせよ、使用されるUVエネルギーの量を最適化し、PAR-CLIPまたはChIRPで監視できるようにする必要があります。セルリフターを使用して細胞を採取し、円錐形のチューブで氷冷したPBSに移します。次に、細胞を2000倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。

上清を取り除き、細胞ペレットを2ミリモルEDTAおよび0.2ミリモルPMSFを含む5ミリリットルの氷冷PBSに再懸濁します。血球計算盤で、細胞を数えます。10センチメートルプレートと15センチメートルプレートからそれぞれ5〜1000万個、1000万〜2000万個の細胞が期待できます。

次に、細胞を2000倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。細胞から核を単離するには、テキストプロトコルに概説されているように、氷冷バッファーAを調製します。使用前に、0.5ミリモルDTTと0.2ミリモルPMSFを所望量のバッファーA.細胞に2ミリリットルのコールドバッファーを加えて細胞を洗浄し、細胞を2500倍g、摂氏4度で5分間回転させます。

上清を捨て、0.2%の非イオン性非変性界面活性剤を添加したバッファーAを加え、サンプルを摂氏4度で5分間回転させます。細胞を2500倍gで5分間回転させた後、上清を取り除きます。ペレットは、細胞質を欠く無傷の核で構成されています。

核を溶解するには、200マイクロリットルの溶解バッファーをチューブに加えます。1/8インチプローブを使用してサンプルを超音波処理し、50%の振幅設定でクロマチンを5〜10秒間せん断します。サンプルを12000倍gで5分間回転させ、ペレットを避けるために175マイクロリットルの上清のみを回収します。

次に、Bradfordアッセイまたは同様の手法でタンパク質濃度を測定します。次に、溶解バッファーを使用して、さまざまなサンプル中のタンパク質を1ミリグラム/ミリリットルまたは最低サンプル濃度に希釈します。核溶解物に5ミリモルDTT溶液を加え、サンプルを室温で1時間インキュベートします。

次に、新鮮なストックから14ミリモルのヨードアセトアミドを加え、ライセートを室温で暗所で30分間インキュベートします。ライセートを50ミリモルの重炭酸アンモニウムの5倍の容量で希釈し、トリプシンを加えます。サンプルを摂氏37度で一晩インキュベートします。

サンプルごとに1つのカスタムメイドのステージチップを準備するには、固相抽出C18材料のディスクを200マイクロリットルのピペットチップの底に置きます。C18ディスクの上に50マイクロリットルのオリゴR3逆相レジンを追加し、ステージチップを遠心分離アダプター内に置き、アダプターを1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブ内に配置します。100マイクロリットルの100%アセトニトリルをチップに追加して洗います。

次に、チップを1000倍gで1分間遠心分離し、溶媒を除去します。チップを50マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸またはTFAで平衡化します。その後、もう一度スピンします。

消化したタンパク質サンプルに100%ギ酸を添加して、PHを2〜3に下げます。次に、サンプルをカスタムメイドのステージチップにロードし、すべてのサンプルがチップを通過するまで、サンプルを1000倍gで1分間遠心分離します。結合したペプチドを50マイクロリットルの0.1%TFAで洗浄します。

その後、サンプルを1000倍gで1分間遠心した後、ステージチップに50μLの溶出バッファーを加えてペプチドを溶出し、1000倍gで1分間遠心分離して溶出バッファーをチップから押し出します。150 g、1〜3キロパスカルに設定された真空遠心分離機を使用して、サンプルを乾燥させます。サンプルから架橋RNAを除去するには、ペレットを50マイクロリットルの2xヌクレアーゼバッファーに再懸濁します。

の1ミリグラム/ミリリットルを1ミリグラムと仮定して、280ナノメートルでペプチド濃度を測定します。2xヌクレアーゼバッファーを使用して、すべてのサンプルを1ミリグラム/ミリリットルまたは最低濃度に調整し、サンプルあたり50マイクロリットルの水と1マイクロリットルの高純度ヌクレアーゼのマスターミックスを調製します。50マイクロリットルのペプチドサンプルを50マイクロリットルの水とヌクレアーゼマスターミックスと組み合わせます。

その後、サンプルを摂氏37度で1時間インキュベートします。最後に、テキストプロトコルに従って、ナノ液体クロマトグラフィー、質量分析、およびデータ処理を行います。この図は、マウスESCからのRBR ID結果の火山プロットを示しています。

RNA認識モチーフドメインと重なったペプチドは青色で、非常に一貫した枯渇レベルを示しています。HNRNPC由来のRNA結合ペプチドは赤で強調表示されています。ここに示されているのは、タンパク質領域の RNA 結合尤度の推定値として計算される RBR id スコアのヒートマップです。

スコアは、スプライソソームサブユニットU1-70kの表面に投影されます。結晶構造によって決定されるRNA接触近傍の明るい赤色は、タンパク質RNA相互作用の正しい同定を示しています。この図では、TET2を新規なRBPとして示し、タンパク質の一次配列に沿ってRBR idスコアをプロットすることにより、RNA結合活性をC末端領域にマッピングしています。

最後に、この新しいRBRの要件は、野生型配列を使用してPAR-CLIPを実行し、予測されたRBRを欠く突然変異体のシグナルと比較することで確認できました。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、2日間で7〜8時間で行うことができます。架橋に先立って、分化がどのように始まるのか、細胞周期がRNAタンパク質の相互作用をどのように制御するのかなどの追加の疑問に答えるために、細胞をさまざまな処理で刺激することができます。

このビデオを見れば、質量分析でタンパク質RNA相互作用の部位を特定するために、架橋タンパク質RNA複合体を含むエクストラを生成する方法について十分に理解できるはずです。