体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

このプロトコルの全体的な目標は、単発ブタ脳内皮細胞を精製して単離し、タイトなin vitro血液脳関門モデルを設定することです。この方法は、薬物送達、透過性、受容体輸送、BBの気密性と極性など、血液脳関門領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。このモデルの主な利点は、初代脳内皮細胞の高収率であり、これを使用して、高いTEERと低い透過性を持つin vitro血液脳関門モデルを作成できることです。この手順を開始するには、脳を滅菌フローベンチに置き、氷の上に置いたビーカーで1リットルのPBSで優しく洗います。

次に、細い先端の鉗子を使用して、各脳から髄膜を慎重に取り除きます。メスを使って脳から灰白質を1つずつ掻き取り、分離した物質を氷の上に置かれた20ミリリットルのDMEM/F-12が入ったシャーレに移します。最初の断片化のために、針なしで灰白質材料を50ミリリットルの注射器に通します。

すべての脳に対してこの手順を繰り返し、収集した灰白質材料を一緒にプールします。DMEM/F-12培地で分離された灰白質材料をハンドヘルドティッシュホモジナイザーのグラインダーチューブに移します。緩い乳棒で8回の上下ストロークを行い、続いてきつい乳棒で8回の上下ストロークを行うことで、材料を均質化します。

次に、フィルターホルダーと140ミクロンのフィルターメッシュを備えた500ミリリットルの青色キャップボトルを使用してホモジネートをろ過することにより、キャピラリーを分離します。キャピラリー含有フィルターを消化溶液を入れたシャーレに入れます。その後、ペトリ皿を摂氏37度で180 RPMのオービタルシェーカーで1時間インキュベートするか、10分ごとに穏やかに攪拌します。

1時間後、ペトリ皿からの懸濁液でフィルターから毛細血管を洗い流します。次に、3つのディッシュからの懸濁液を2本の50ミリリットルチューブに分割し、各50ミリリットルチューブに10ミリリットルのDMEM / F-12を追加して消化を停止します。細胞懸濁液を250倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。

その後、上清を吸引し、各ペレットを10ミリリットルのDMEM / F-12に再懸濁します。次に、各チューブにさらに20ミリリットルのDMEM / F-12を追加します。PBECの付着条件を最適化するために、T-75フラスコにコーティング溶液を添加すると、コラーゲン4の最終濃度が150マイクログラム/ミリリットル、フィブロネクチンが50マイクログラム/ミリリットル、蒸留水によって得られ、溶液が全面を覆うようにします。

次に、37°Cの水浴で毛細血管を解凍します。凍結媒体を除去するには、キャピラリーを250 g、摂氏4度で7分間回転させます。その後、上清を慎重に吸引し、10ミリリットルのアリコートの1〜2ミリリットルにペレットを再懸濁します。

その後、キャピラリー懸濁液をコーティングされたT-75フラスコに移し、フラスコをゆっくりと傾けて表面全体に均等に分布するようにします。T-75フラスコを摂氏37度、二酸化炭素5%に置きます。一晩インキュベートした後、1つのT-75フラスコに対して10ミリリットルのPBEC増殖培地を調製し、1ミリリットルあたり4マイクログラムのピューロマイシンを補給し、培地交換を行います。

次に、500マイクログラム/ミリリットルのコラーゲンIVと100マイクログラム/ミリリットルのフィブロネクチンでコーティングし、蒸留水でPBEC播種用の透過性膜インサートを準備します。T-75フラスコに2ミリリットルのトリプシンEDTA溶液を加えて細胞をトリプシン化し、摂氏37度、二酸化炭素5%で5〜7分間置きます。脳内皮細胞を切り離すには、T-75フラスコの側面を指先で軽くたたいます。

その後、細胞溶液を15ミリリットルのチューブに移し、250 g(摂氏4度)で7分間遠心分離することにより、脳内皮細胞をスピンダウンします。その後、上清を慎重に取り除き、ペレットを1ミリリットルの培地に再懸濁します。次に、さらに2ミリリットルのメディウムを追加して、総容量を3ミリリットルにします。

細胞計数チャンバーまたは自動細胞計数システムを使用して、手動で細胞数をカウントします。非接触共培養の場合は、前日にアストロサイト増殖培地でリフレッシュしたアストロサイトを含むウェルにインサートを移します。翌日、PBECを含む透過性メンブレンインサートのメディウムを交換します。

次に、ウェルから培地を慎重に吸引し、各ウェルに750マイクロリットルの分化培地を追加します。その後、インサートから培地を慎重に吸引し、インサートごとに500マイクロリットルの分化培地を追加します。次に、残りの750マイクロリットルの分化培地を各アストロサイトウェルに加えます。

その後、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%の分化培地で翌日までインキュベートします。分化培地で細胞を刺激した翌日、チャンバーを二蒸留水で2回、70%エタノールで5分間、さらに二蒸留水でさらに2回すすぎ、TEER測定用の組織抵抗測定チャンバーシステムを準備します。次に、チャンバーをシステムに接続し、DMEM/F-12を4ミリリットルの組織抵抗測定チャンバーに追加し、室温で約30分間放置します。

その後、インサートを組織抵抗測定チャンバーに慎重に配置してTEER測定を行います。これは、PBECs、培養物、およびアストロサイトの5日間にわたって観察された位相位相差顕微鏡画像です。初期培養の初日に精製された毛細血管断片は、毛細血管と汚染細胞の両方の存在を示し、2日目に培地を交換し、さらに成長の日を加えた後、PBECの選択を示し、毛細血管断片から成長を開始しました。

PBECのコンフルエント単層は通常、4日目から6日目に達成され、その時点でPBECは紡錘形の形態を示し、縦方向に整列していました。ボトムウェルに播種されたラットの星状細胞は、通常5日以内にコンフルエント層まで増殖し、成長の2週間後に非接触共培養モデルに使用されました。一度習得すれば、このテクニックは7時間で完了します。

その開発後、この技術は、研究者がタイトで分極した脳内皮細胞における薬物送達と受容体輸送を研究する道を開きました。このビデオを見れば、in vivoでは実施できない新しい研究に使用できるin vitro血液脳関門モデルの作成方法を十分に理解できるはずです。