Name: 体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶブタ脳血管内皮細胞を用いた体外血液脳関門モデルの確立法。高いTEER値と低透過性を持つ緻密なバリアを構築し、薬物送達や受容体輸送の研究に応用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、テクニカル サポート、エリザベート ヘレナ ブルーン、サラ クリスティン ・ クリステンセン、ニルス ・ m ・ クリステンセンを認識したいし、ルンドベック財団許可番号 R155 2013 14113。

利害の衝突を報告しません。

精製と pBEC の増殖
浄化のプロシージャの間には、重要な手順は、髄膜の迅速かつ効果的な除去・分離精製収率、純度およびモデルの適切な設置が重要です白と灰色の物質に含まれます。提示された体外BBB モデルの pBECs を使用して、我々 は改善し、孤立した灰白質、サイズ選択的微小血管、コラゲナーゼで消化の隔離のためのフィルタ リングの機械的均質化に基づく浄化手順を簡単、DNase や微小片の初期の文化で、トリプシン。一般に、精製とプライマリ細胞培養中に主要な挑戦の 1 つは汚染細胞の除去です。原発性脳腫瘍血管内皮細胞の浄化と経験を示しました髄膜と白質の結果の徹底的な除去は血管内皮細胞の増殖と BBB の発現を増加だけでなく純度・収量、毛細血管を改善します。特性。このため、提案するプロトコルの髄膜 (溝の中を含む) の除去された髄膜細胞 (線維芽細胞のような性質のある) だけでなく、動脈と細動脈の平滑筋細胞の除去をように設計されています注意してください成長します。迅速に培養内皮細胞より。同様に、白質材料の最小化と純粋な内皮細胞培養、少なく汚染細胞分離のキャピラリー フラグ...

血液-脳関門の細胞の構造と機能
循環、中央神経系 (CNS) のインターフェイスで BBB は適切な機能と神経系の保護のために不可欠である中枢神経系微小環境の homoeostatic コントロールのキー規制サイトとして機能します。BBB のサイトは血管内腔内皮細胞です。脳の毛細血管の内皮細胞を形成する複雑な細胞間のタイトな接合と特定の流入と流出のトランスポーターの強く偏光式パターン血液と脳1の間非常に特定の分子輸送の確保します。タイト結合錯体の構造コンポーネント オクルディンとクローディン家族、精巣毛細血管(ZO) 蛋白質、cingulin からの蛋白質を含めるし、接合部接着分子 (ジャム) を関連付けられています。クローディン 5 は傍細胞接合部制限で特に重要です。この特徴的な BBB 内皮細胞表現型の誘導そして維持を一緒に脳血管内皮細胞フォームは基底膜ニューロンとアストロ サイト ペリサイト周囲の細胞とのダイナミックな相互作用を含む、神経血管ユニット (NVU)2,3。これらの相互作用に関与するメカニズムがまだ完全に理解されない、しかし、短期的に BBB 透過性の調節ができ、長期 BBB 機能4を誘導する細胞間化学信号の交換が含まれます。アストロ サイトは特に脳血管内皮細胞の表現型に貢献する知られているし、グリア由来神経栄養因子 (細胞内 cAMP に影響を与える)5、塩基性繊維芽細胞成長因子6、規制などのソースは、ヒドロコルチゾン7、および変換増殖因子 β (TGF-β)8。しかし、TGF-β の効果は議論9をされています。
生体内での in Vitro BBB から
BBB 生物学に関する貴重な情報を提供するin vivo研究継続します。ただし、細胞モデルは追加の洞察力を提供し、健康および病気の BBB の詳細な分子と機能的な側面を理解するための便利なツールを構成できます。BBB の成分と細胞のタイプ間の複雑な相互作用が生体外モデルを完全に達成することは困難、以来があった、脳血管内皮細胞の最初の精製とモノラル文化にこれらのアプリケーション10,11,12、浄化手順と BBB の成長条件の広範な開発培養細胞モデル、体内バリアに大きい類似に 。一般的に使用される生体外でBBB モデルは、齧歯動物、ブタ、ウシ由来の初代培養細胞および不死化細胞株に基づいています。各モデルには、さまざまな長所と欠点があります。比較とモデルの選択、BBB 構造タンパク質受容体、酵素、トランスポーターの発現など検証マーカーが現在確立されたモデル1の概要を作成する使用されます。
プロトコルの目的
BBB の 1 つの重要な特徴は気密バリア性と高い TEER まだ利用可能なモデルの数が多いが反映しても体内のレベルです。いくつかの研究所から開発・最適化への取り組みを取り入れ、このプロトコルの目的は、プライマリ プライマリ pBECs MC ACM の有無、NCC に基づく BBB モデル体外高 TEER を確立する方法を提示するにはラットや豚由来のアストロ サイトは。応用手順およびモデルの確立汚染細胞を排除し、pBECs の BBB の表現型への分化を改善する努力があります。この作品は低傍細胞透過性とタイトな接合部の主要なタンパク質、トランスポーター、および受容体の機能発現を良いと信頼性の高い、高 TEER モデルの確立になりました。ただし、アストロ サイトは脳血管内皮細胞の表現型に貢献の要因、文化の 3 つの異なる条件は脳血管内皮細胞の 3 つの異なった表現型を表します。NCC モデルは創、運輸研究と細胞内輸送に関与する特定の専門にされたメカニズムの研究だけでなく、細胞間相互作用の調査のため特に有益で BBB 機能の最大の表現が、有利であります。
プロトコルの起源と歴史
ここで説明した pBEC モデルは、ルイーズ ・ モーガン博士と同僚は、成功以前ウシ脳血管内皮細胞モデル13に基づく方法でエーザイ研究所 (ロンドン) で開発された豚のモデルに基づいています。セル準備の元のメソッドは、純度を改善するために二次培養の手順に続いて、微小血管をキャッチするメッシュのナイロンを使用して 2 段ろ過が。メソッドの以前の開発、最適な BBB の表現型とバリアの堅さは ACM を含む補足の媒体の成長によって達成されました。メソッドにさらに変更は、マンチェスター英国14,15教授 (名) rothwell さんのラボで r. スキナーによって作られました。メソッドは、アボットの研究室、KCL ロンドン、どこ Patabendige では、大幅に簡単にアストロ サイトまたは ACM の使用の回避によって、ピューロマイシンをペリサイトなど汚染細胞を排除する準備をした。 によって採用されました。初論文 MC モデルに、生体内でBBB、効果的なタイトな接合、膜輸送系受容体を介したトランスサイトーシス16,17などのいくつかの重要な機能が保持されることを確認しました。,18,19,20. S. ユソフ後再び培養アストロ サイトをテストし、これはアボット ラボ21で現在使用されている最寄りのバリアント、TEER、大幅それを発見します。モデルが正常にされている今簡素化灰色を含む問題抽出、1 つだけメッシュろ過ステップ、および単一のフィルター コーティングの手順を使用して、m. ニールセンに転送ラボ オーフス、さらに変更がされているの導入 (そのプロトコルに関して)コラーゲンとフィブロネクチンを組み合わせること。豚アストロ サイト (このプロトコル) の分離の適用手順は、・ トムセンら22で説明したオールボーで t. Moos 研究室で開発したプロトコルに基づいていた。TEER とロンドンとオーフスで生成されたモデルの他のプロパティは、モデル ラボ間で転送が容易に、注意深い観察と方法の手順の合理化によく反応するという考えに信任を貸す、似ています。確かに、s. ユソフはローカル条件およびティッシュ ソースにさらに調整を関与している熱帯の国 (マレーシア)23に、今 MC モデルを確立しています。
別の方法や現在の利点は、モデルを確立
PBECs ウシおよび齧歯動物の起源の脳血管内皮細胞に比べると、次の分離24生体内でBBB の表現の損失の低い率を持っていることの利点を提供します。さらに、pBECs、bEND.5 と bEND.3 (50 Ω cm2) など細胞の単分子膜のよく報告されるレベルと比べて MC (800 Ω cm2)16で育てられたときも比較的タイトな内皮障壁を形成できます。25,26,原発性脳腫瘍と cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30, 27(100-300 Ω cm2) マウスの血管内皮細胞ss ="xref"> 33,34,35,36とラット (100-300 Ω cm2)37,38。しかし、TEER は浄化と文化のプロシージャの依存関係を示しています。ほとんどの場合、ACM の追加やアストロ サイトとの共培養内皮層1の気密性の内皮細胞で増加差別化効果に示します。それにもかかわらず、培養条件を最適化する努力、牛ベースのモデルのみを示している TEER 値豚ベース モデル (800 Ω cm2 MC、最大 2500 Ω cm2の培養アストロ サイトの平均) に匹敵する13 ,,3940,41,42,43,44,45。ウシ脳に基づくモデルとして内皮細胞は大きな変動、研究所14,45,46,47,48, 内と間を示しています。再現性は問題になる可能性があります。ここで報告 pBEC モデルで貢献の研究所は変動の少ない、両方の研究所の間で非常によく似た TEER と傍細胞透過性の値を達成しています。したがって、それはここで紹介した方法を使用して低い変動と堅牢なモデルを確立する他の研究所の可能なはず。タイトな内皮細胞層を形成するに加え pBECs を持つモデルがタイト結合蛋白質、機能 BBB トランスポーター、受容体、酵素、及び実証適性研究15の範囲の表現によって検証されて以前,16,17,19,20,22,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59。 さらに、pBECs の共培養に未発表のトランスクリプトーム データは BBB トランスポーターと受容体 (未発表結果、ニールセンら) の予想されるプロファイルを示しています。
豚の病気の進行を反映60、好ましい特徴の他の確立されたモデルよりも高い程度に人間の生物学とゲノム、解剖学、生理学、豚ベースの BBB モデルがそれ以上の利点、製薬業界。ブタ脳肉業界の共通の副産物であると血管内皮細胞、動物実験のために必要な 1 つのブタの脳から高純度精製収率を提供するの数を最小限に抑える脳の簡単にアクセスできるソースそれら構成します。浄化の一次電池の耕作はやや時間がかかるとモデルの設定の標準化のための専門知識が必要ですが、一次電池は最も信頼性の高い BBB モデルを生成します。不死化細胞株はバリアの堅さ、トランスポーター発現プロファイルと微小環境規制が生体内で実験結果61,を反映していないなど重要なプロパティとして、代用をすることはできません。62体外モデルは、生細胞の高解像度のイメージング、目標を使用してサンプリングまたは観察された細胞に近いアプローチを許可することで細胞内のプロセスの可視化を実現の利点を提供。高倍率と優れた光学的品質63。これは生きている動物の 2 光子顕微鏡の使用のためのケースではありません。さらに、体外モデルは、タグ付きタンパク質の可視化や、人身売買の調査を許可するセルを使って能力を提供します。
モデルの応用
BBB の機能は固定されていないと生理学と病理学の両方で動的に変調することができます。神経変性を含む多くの神経学的な病気で炎症・感染症、混乱、BBB の透過性亢進には、64,65,66,67 が観察されます。.減らし、病気の進行や後の損傷を防ぐために、BBB の変調の基礎となる分子メカニズムの同定と解析、主要な重要です。このコンテキストで信頼性の高い体外モデルは、製薬業界での高い需要と、さらに中枢神経系薬の BBB 透過性を予測する上で重要な役割を果たします。透過スクリーンとして任意の生体外モデル制限傍細胞経路、生理学的に現実的な細胞アーキテクチャおよび機能発現トランスポーター メカニズム68が表示されます。以前研究16,17,57, と傍細胞透過性とここで TJ と AJ タンパク質の発現を示した本モデルこれらのすべての条件を満たして、BBB の範囲に適しています両方の通常の生理学と病理学を研究。提示の浄化と栽培方法の強みには、シンプルさの組み合わせ、結果堅牢で信頼性の高い高 TEER体外BBB モデルで再現性とアストロ サイトを含める機能に影響を与えるがあります。この目的は、ブタのアストロ サイトとラットの起源が同様の方法22pBECs の BBB の表現型を拡張するために示されています。

<table><tbody><tr><td>フィブロネクチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ロンザ</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/低グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>血漿由来血清(PDS)</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-89</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10-270-106</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>8-CPT-cAMP</td><td>Biolog</td><td>C010</td><td></td></tr><tr><td>RO 20-1724</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8279</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン硫酸塩</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34896</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>VWR</td><td>20,824,296</td><td>96 % EtOH</td></tr><tr><td>DNAse 1</td> Sigma-Aldrich から 70 % 溶液を混合<td>します</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ CLS2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>Elga System</td></tr><tr><td>製 T75 フラスコ</td><td>Thermo Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Costar Transwell インサート (細胞透過性メンブレンインサート)</td><td>Costar</td><td>CLS3401</td><td>12 ウェルプレート、直径 12 mm、0.4 &mu;m ポリカーボネートメンブレン</td></tr><tr><td>15 ml 遠心チューブ</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 遠心チューブ</td><td>Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td>Thermo Scientific</td><td>377224</td><td></td></tr><tr><td>500 ml ボトル</td><td>Thermo Scientific</td><td>159910/159920</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>スワンモーテン</td><td>REF0211</td><td>タイプ24</td></tr><tr><td>組織ホモジナイザー</td><td>シグマ</td><td>D9188</td><td></td></tr><tr><td>140 &mu;m フィルター</td><td>MERCK</td><td>NY4H04700</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;mフィルター</td><td>コーニング</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>EndOhm チャンバーシステム</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ</td><td>ENDOHM-12</td><td>12mmカルチャーカップ用エンドオームチャンバー</td></tr><tr><td>EVOM2 電極システム</td><td>ワールド・プレシジョン</td><td>ズ 300523+STX100C</td><td>硬質STX-100C電極ペア付きTEER測定システム</td></tr><tr><td>ロングニードル</td><td>シグマ</td><td></td><td>シリンジに取り付ける</td></tr><tr><td>細い先端の湾曲した鉗子</td><td>KLSマーティン</td><td>12-409-12-07</td><td></td></tr><tr><td>広い先端の鉗子</td><td>VWR</td><td>82027-390</td><td></td></tr><tr><td>フィルター</td><td>ホルダーMERCKミリポア</td><td>Swinnex-47</td><td></td></tr><tr><td>50 mlのシリンジ</td><td>ブラウン</td><td>4617509F</td><td></td></tr><tr><td>10 mlのシリンジ</td><td>テルモ</td><td>SSt20ESI</td><td></td></tr><tr><td>抗オクルージン抗体</td><td>アブカム</td><td>ab31721</td><td>1:100</td></tr><tr><td>抗p120Catenin antibody</td><td>BD Transduction laboratories</td><td>610133</td><td>1:200</td></tr><tr><td>抗ZO-1抗体</td><td>Invitrogen</td><td>61-7300</td><td>1:200</td></tr><tr><td>抗クローディン5抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4502981</td><td>1:100</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgGとAlexa Flour 568</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10042</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ロバ抗マウスIgGとAlexa Flour 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr>ショ<tr><td>糖</td><td>パーキンエルマー</td><td>NEC100X250UC</td><td>0.15&micro;l / ml最終作業コンク</td></tr><tr><td>ルシファーイエロー</td><td>シグマ</td><td>L0144</td><td>10 & マイクロ;G/mL 最終作業 Conc</td></tr></tbody></table>

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

このプロトコルの目的提示浄化と pBECs のと体外血液脳関門 (BBB) モデル モノカルチャー (MC)、アストロ サイト調整培 (ACM) と MC で pBECs に基づく栽培に最適化されたプロシージャと非接触ブタのアストロ サイトとの共培養 (NCC) またはラットの起源。pBECs は隔離され、国内豚 5-6 ヶ月歳の脳皮質から毛細血管のフラグメントから培養されました。これらのフラグメントは、髄膜、分離および灰白質、ろ過、酵素消化、遠心分離の均質化を慎重に除去して精製しました。汚染細胞をさらになくすためには、キャピラリーの断片がピューロマイシン含有培養した培地。60 ~ 95% 合流 pBECs キャピラリーのフラグメントから成長したに継代し、透過性の膜フィルターが挿入され、モデルに設立されました。次の差別化要因と扱われた細胞バリア堅さと BBB pBECs の特徴的な表現型を増加する: 膜側の透過物 8-CPT-キャンプ (ここで省略のキャンプ)、ヒドロコルチゾン、ホスホジエステラーゼ阻害薬、RO-20-1724(RO)。手順は、9-11 日の期間にわたって実施された、アストロ サイトが 2-8 週間前もってを培養した NCC モデルを確立するとき。プロトコルに記載されている手順の遵守が厳しく制限されている傍細胞透過性の内皮層の確立を許可している、NCC (TEER) 1249 ± 80 Ω cmの平均内皮下電気抵抗を示すモデル2と傍細胞透過性 (Pアプリ) ルシファー 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 cm 秒-1の黄色の (± SEM を意味する n = 55)。この pBEC 表現型のさらなる評価のタイトな接合部蛋白質クローディン 5、良い表現を示した ZO 1、オクルディンと単接合蛋白 p120 カテニン。健康および病気の BBB の研究の範囲の提示されたモデルを使用ことができますそして、厳しい傍細胞透過性このモデル輸送と細胞内輸送の研究に適しています。

BBB のIn Vitroモデルの確立
提示された、最適化された方法で pBECs の栽培やアストロ サイト (図 1) と MC 有無 ACM または NCC 透過膜挿入システムの確立実施した 9-11 日間 (図 2)。内皮細胞の選択、精製されたキャピラリー フラグメントの初期の文化は、ピューロマイシン最大 5 日間、ほとんど汚染細胞を排除しからの紡錘状の血管内皮細胞の成長を促進を併用した、キャピラリー フラグメント (図 3 aの C)。4 6 日目で pBECs は、接触抑制、縦一直線に並べられた細胞成長、非重複、60 ~ 95% の confluency に増殖しました。PBECs が IV コラーゲンとフィブロネクチン...

プロトコルの目的は、プライマリ ブタ脳血管内皮細胞 (pBECs) に基づく体外血液脳関門 (BBB) モデルの確立のための最適化手順を提示することです。モデルを示しています高再現性、高気密性、輸送および創薬における細胞内輸送の研究に適しています。

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

このプロトコルの全体的な目標は、単発ブタ脳内皮細胞を精製して単離し、タイトなin vitro血液脳関門モデルを設定することです。この方法は、薬物送達、透過性、受容体輸送、BBの気密性と極性など、血液脳関門領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。このモデルの主な利点は、初代脳内皮細胞の高収率であり、これを使用して、高いTEERと低い透過性を持つin vitro血液脳関門モデルを作成できることです。この手順を開始するには、脳を滅菌フローベンチに置き、氷の上に置いたビーカーで1リットルのPBSで優しく洗います。次に、細い先端の鉗子を使用して、各脳から髄膜を慎重に取り除きます。メスを使って脳から灰白質を1つずつ掻き取り、分離した物質を氷の上に置かれた20ミリリットルのDMEM/F-12が入ったシャーレに移します。最初の断片化のために、針なしで灰白質材料を50ミリリットルの注射器に通します。すべての脳に対してこの手順を繰り返し、収集した灰白質材料を一緒にプールします。DMEM/F-12培地で分離された灰白質材料をハンドヘルドティッシュホモジナイザーのグラインダーチューブに移します。緩い乳棒で8回の上下ストロークを行い、続いてきつい乳棒で8回の上下ストロークを行うことで、材料を均質化します。次に、フィルターホルダーと140ミクロンのフィルターメッシュを備えた500ミリリットルの青色キャップボトルを使用してホモジネートをろ過することにより、キャピラリーを分離します。キャピラリー含有フィルターを消化溶液を入れたシャーレに入れます。その後、ペトリ皿を摂氏37度で180 RPMのオービタルシェーカーで1時間インキュベートするか、10分ごとに穏やかに攪拌します。1時間後、ペトリ皿からの懸濁液でフィルターから毛細血管を洗い流します。次に、3つのディッシュからの懸濁液を2本の50ミリリットルチューブに分割し、各50ミリリットルチューブに10ミリリットルのDMEM / F-12を追加して消化を停止します。細胞懸濁液を250倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。その後、上清を吸引し、各ペレットを10ミリリットルのDMEM / F-12に再懸濁します。次に、各チューブにさらに20ミリリットルのDMEM / F-12を追加します。PBECの付着条件を最適化するために、T-75フラスコにコーティング溶液を添加すると、コラーゲン4の最終濃度が150マイクログラム/ミリリットル、フィブロネクチンが50マイクログラム/ミリリットル、蒸留水によって得られ、溶液が全面を覆うようにします。次に、37°Cの水浴で毛細血管を解凍します。凍結媒体を除去するには、キャピラリーを250 g、摂氏4度で7分間回転させます。その後、上清を慎重に吸引し、10ミリリットルのアリコートの1〜2ミリリットルにペレットを再懸濁します。その後、キャピラリー懸濁液をコーティングされたT-75フラスコに移し、フラスコをゆっくりと傾けて表面全体に均等に分布するようにします。T-75フラスコを摂氏37度、二酸化炭素5%に置きます。一晩インキュベートした後、1つのT-75フラスコに対して10ミリリットルのPBEC増殖培地を調製し、1ミリリットルあたり4マイクログラムのピューロマイシンを補給し、培地交換を行います。次に、500マイクログラム/ミリリットルのコラーゲンIVと100マイクログラム/ミリリットルのフィブロネクチンでコーティングし、蒸留水でPBEC播種用の透過性膜インサートを準備します。T-75フラスコに2ミリリットルのトリプシンEDTA溶液を加えて細胞をトリプシン化し、摂氏37度、二酸化炭素5%で5〜7分間置きます。脳内皮細胞を切り離すには、T-75フラスコの側面を指先で軽くたたいます。その後、細胞溶液を15ミリリットルのチューブに移し、250 g(摂氏4度)で7分間遠心分離することにより、脳内皮細胞をスピンダウンします。その後、上清を慎重に取り除き、ペレットを1ミリリットルの培地に再懸濁します。次に、さらに2ミリリットルのメディウムを追加して、総容量を3ミリリットルにします。細胞計数チャンバーまたは自動細胞計数システムを使用して、手動で細胞数をカウントします。非接触共培養の場合は、前日にアストロサイト増殖培地でリフレッシュしたアストロサイトを含むウェルにインサートを移します。翌日、PBECを含む透過性メンブレンインサートのメディウムを交換します。次に、ウェルから培地を慎重に吸引し、各ウェルに750マイクロリットルの分化培地を追加します。その後、インサートから培地を慎重に吸引し、インサートごとに500マイクロリットルの分化培地を追加します。次に、残りの750マイクロリットルの分化培地を各アストロサイトウェルに加えます。その後、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%の分化培地で翌日までインキュベートします。分化培地で細胞を刺激した翌日、チャンバーを二蒸留水で2回、70%エタノールで5分間、さらに二蒸留水でさらに2回すすぎ、TEER測定用の組織抵抗測定チャンバーシステムを準備します。次に、チャンバーをシステムに接続し、DMEM/F-12を4ミリリットルの組織抵抗測定チャンバーに追加し、室温で約30分間放置します。その後、インサートを組織抵抗測定チャンバーに慎重に配置してTEER測定を行います。これは、PBECs、培養物、およびアストロサイトの5日間にわたって観察された位相位相差顕微鏡画像です。初期培養の初日に精製された毛細血管断片は、毛細血管と汚染細胞の両方の存在を示し、2日目に培地を交換し、さらに成長の日を加えた後、PBECの選択を示し、毛細血管断片から成長を開始しました。PBECのコンフルエント単層は通常、4日目から6日目に達成され、その時点でPBECは紡錘形の形態を示し、縦方向に整列していました。ボトムウェルに播種されたラットの星状細胞は、通常5日以内にコンフルエント層まで増殖し、成長の2週間後に非接触共培養モデルに使用されました。一度習得すれば、このテクニックは7時間で完了します。その開発後、この技術は、研究者がタイトで分極した脳内皮細胞における薬物送達と受容体輸送を研究する道を開きました。このビデオを見れば、in vivoでは実施できない新しい研究に使用できるin vitro血液脳関門モデルの作成方法を十分に理解できるはずです。

improved-method-for-establishment-an-vitro-blood-brain-barrier-model

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

この方法では、マウスの脳から微小血管内皮細胞を分離し不死化する方法について説明します。我々は、脳組織、消化手順、播種し、細胞の不死化の均質化から始まるステップ·バイ·ステップのプロトコルを記述します。通常、それは均質、不死化血管内皮細胞株を得るために約5週間かかります。...

として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成<em&gt; in vitroで</em&gt;血液脳関門モデル

このビデオは、新鮮なブタの脳からの毛細血管の分離を示しています。このプロセスには、髄膜の除去、脳組織からの灰白質の分離、灰白質の均質化とろ過による毛細血管の分離、そして最後に酵素消化を使用して毛細血管をさらに精製することが含まれます。...

ブタの脳からの毛細血管の浄化

血液脳関門（BBB）のヒトモデルの確立は、BBBの障害に関連する脳条件の研究に利益をもたらすことができる。ここでは、多孔質膜の両側に、ヒト星状細胞および脳内皮細胞の共培養を可能に接触BBBモデルを調製するための改善された技術が記載されている。...

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

本研究の目的は、ラット同系内皮細胞とアストロサイトの共培養が関与する生体外 BBBモデルの再現性を検証することでした。内皮細胞単層は、高いTEERと低LY透過性を提示した。特定のTJタンパク質の発現は、炎症および輸送体および受容体の機能性に機能的応答を評価した。...

設定アップ<em&gt;体外</emラット血液脳関門の&gt;モデル（BBB）：BBB不透過性および受容体媒介輸送に注力

脳微小血管内皮細胞(BMEC)は、血液と中枢神経系(CNS)を分離する高度に制御された障壁を形成する特定の接合タンパク質によって相互接続されています。このプロトコルで述べられているように、初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離により、BBBの詳細なin...

初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

ここでは、インピーダンス細胞分光法を利用した血液脳関門のin...

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;インピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：T細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て

人間の脳組織から分離脳の毛細血管は、生理学的および病態生理学的条件下でバリア機能を研究する臨床モデルとして使用できます。ここでは、新鮮な人間の脳から脳の毛細血管を分離するための最適化されたプロトコルを提案する.

新鮮な人間の脳から脳の毛細血管の分離

人間の血液脳関門は、親水性の分子や病原体の脳への侵入を選択的に防ぎます。髄膜炎や術後せん妄を含むいくつかの病理は、血液脳関門の透過性の増加に関連している。ここでは、微生物トラバーサルによるバリア透過性を試験する内皮細胞培養モデルについて説明する。...

微小血管内皮細胞を介した微生物トラバーサルによる血液脳関門の透過性の解析

血液脳関門(BBB)は、多細胞神経血管の単位は、密接に脳の恒常性を調節します。ヒトiPSCと臓器オンチップ技術を組み合わせることで、疾患モデリングやCNS薬物浸透性予測に適したパーソナライズされたBBBチップを生成しました。BBBチップの生成と動作に関する詳細なプロトコルについて説明します。...

ヒトiPSCベースの血液脳バリアチップの生成

このプロトコルは、ヒト血液脳関門(BBB) インビトロ...

ヒト血液脳関門をモデル化した三重培養細胞系

血液脳関門(BBB)は、安定した健康な脳環境を維持する上で重要な役割を果たしています。BBB機能障害は、多くの神経疾患と関連しています。私たちは、脳血管の病理学、BBBの完全性、およびBBBが遺伝学や疾患によってどのように変化するかを調べるために、BBBの3D幹細胞由来モデルを開発しました。...

神経疾患のモデル化と治療標的化のための血液脳関門の in vitro 再構築

学ぶブタ脳血管内皮細胞を用いた体外血液脳関門モデルの確立法。高いTEER値と低透過性を持つ緻密なバリアを構築し、薬物送達や受容体輸送の研究に応用できます。

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

さらに動画を探す