ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部のシナプス電流の焦点 Macropatch 録音
2017年9月25日
ショウジョウバエ第 3 齢幼虫神経筋接合部シナプス ボタンの可視化から塊状性シナプス電流を記録できます。この手法は、単一のシナプスブートンのアクティビティを監視できます。
この手法の全体的な目標は、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部で視覚化されたシナプスボタンのシナプス活動を監視することです。遺伝子操作に容易に修正できる優れたモデルシステム。この手法は、あなたの科学における重要な問題に対処することができます。
例えば、シナプスタンパク質の突然変異がシナプス伝達をどのように調節するかなどです。この手法の主な利点は、限られた数の放出部位の活動を監視し、高速動力学の電流を記録でき、簡単に解決できることです。実験を開始するには:微小電極プーラーを準備します。
35倍の倍率で顕微鏡を使用して、引っ張られた電極の内径が7〜10マイクロメートルの範囲にあることを確認します。毛細管は、ほこりの蓄積を防ぐために密閉容器に保管してください。次に、マイクロフォージを使用して研磨されたキャピラリーを発射します。
研磨された電極の最終的な内径が5マイクロメートルであることを確認してください。次に、曲げに移ります。電極をマニピュレーターに固定し、先端をフィラメントに触れないように上に置きます。
熱量を最大の60〜70%に設定し、マイクロフォージのペダルを1〜2秒間押してフィラメントを加熱します。L字型の針で電極の先端をやさしく引き下げ、約90度に曲げます。手でトーチの炎の上に電極を持ち、最初の曲げから7〜10ミリメートルのところで、約120度の角度で2回目の曲げを行います。
血リンパ様溶液、またはHL3溶液を調製します。溶液を冷蔵機に保管し、毎週新鮮にします。刺激ピペットは、ガラスピペットを曲げずに記録するのと同じように準備します。
次に、シリンジに接続された微小電極ホルダーに刺激ピペットを挿入します。シリコーンゴムエポキシでコーティングされた小さなペトリ皿から製造された解剖プレート。次に、鉗子を使用して、バイアルからさまよう3番目の幼虫を選びます。
幼虫をピンで留め、最初のピンを後部に配置し、別のピンを口のフックの近くに配置します。HL3 ソリューションを追加します。幼虫の背側では、上部のピンから下部のピンまでスプリングハサミを使用して切り込み
を入れます。幼虫のフィレをピンで留め、幼虫の左側と右側に2つの追加のピンを配置します。鉗子を使用して腸と気管を取り除きます。腹側神経索のすぐ外側の神経をスプリングハサミで切断します。
調製したシャーレを顕微鏡ステージに置きます。参照電極をお風呂に挿入します。記録電極にHL3溶液を充填します。
10X対物レンズの下で電極をお風呂に浸し、マイクロマニピュレータを使用して2、3、または4の腹部のsegementsの筋肉6と7の上に置きます。次に、対物レンズを60Xに切り替え、エピ蛍光またはDIC光学系を使用して対象領域に焦点を合わせます。電極の先端をシナプスブートンの上に置き、過度の圧力がNMJを損傷したり、自発的なシナプス活動の増加を誘発したりする可能性があるため、電極を筋肉に非常に優しく押し付けます。
次に、アンプ、ADボード、コンピューターのスイッチを入れます。次に、電圧を選択しますamp アンプのモード。集録ソフトウェアを起動し、ギャップフリーモードを選択して、コンピュータ画面上のMEJCの外観を観察します。
MEJCの振幅が0.2〜0.7ナノアンペアの範囲にあることを確認します。視覚制御下でマイクロマニピュレーターを使用して、刺激電極を腹部セグメント2〜4を神経支配する軸索の近くに配置します。電極ホルダーに接続されたシリンジのピストンを引っ張って、軸索が電極の内側に引っ張られるようにして負圧を加えます。
次に、刺激装置の電源を入れます。アイソレーションユニットのノブを回してゼロ電流を設定し、EJCが現れるまで、またはしきい値に達するまでゆっくりと増やします。スーパースレッショルド領域で刺激を行います。
刺激電流は、EJCの観察の閾値と比較して約2倍に増加します。アンプの電極抵抗スイッチをシールテスト位置に回して、記録マクロパッチ電極のシール抵抗を測定します。現在のウィンドウに表示されるシール抵抗(ギガオーム)の値を確認します。
フォーカルマクロパッチレコーディングにより、選択したシナプスボタンからのシナプス活動をモニタリングできます。電極がシナプスボタンの上に配置されている場合、記録されたMEJCはノイズレベルを大幅に超える振幅を持ち、サブミリ秒の範囲で急激な上昇位相を示します。記録電極をシナプスボタンから数ミクロン離すと、レコーダーMEJCの振幅はノイズレベルまでほぼ低下します。
記録されたEJCはノイズとほとんど区別できず、立ち上がりフェーズが長くなります。フォーカルレコーディングにより、複合体およびノーム変異体中のMEJCの正確な検出が可能になります。一方、この変異体からの細胞間記録は、重複して確実に検出できないイベントを放出します。
エレクトロチップの角度の調整は、電極の位置決めにとって重要です。この手順に従って、個々のリリースイベントのイメージングを確認するなどの他の方法を実行して、個々のアクティブゾーンのアクティビティの統合などの追加の質問に答えることができます。
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概要
本研究では、ショウジョウバエ3齢幼虫の神経筋接合部において、可視化されたシナプスボタンからシナプス活性をモニタリングする技術を提示します。単一のボタンにおけるシナプス電流の収集を可能にすることで、シナプス蛋白の変異がシナプス伝達にどのように影響するかを調査することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 遺伝学
背景
- ショウジョウバエの幼虫は、遺伝学的操作の優れたモデルとなります。
- 焦点記録を用いることで、シナプスボタンにおける高速キネティクスの電流を分解して検出できます。
- シナプス伝達の理解は、神経通信を解明する上で極めて重要です。
- 単一の放出部位をモニタリングすることで、シナプス蛋白質の機能に関する知見が得られます。
研究目的
- シナプス活動を正確にモニタリングする方法を開発すること。
- 遺伝子変異がシナプス伝達に及ぼす影響を探索すること。
- 研究者がシナプス機能のメカニズムを直接観察できるようにすること。
使用方法
- 本手法では、ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部からフォーカルマクロパッチ記録を行います。
- 生きた3齢幼虫を準備し、固定した状態で、細胞へのアクセスに向けて解剖を行います。
- このプロセスには、電極の準備、配置、およびボルテージクランプ設定によるモニタリングが含まれます。
- 重要な手順として、電極の精密な曲げ加工と、記録中のシール抵抗の維持が挙げられます。
主な結果
- 局所記録により、特定されたシナプスボタンからのミニチュア興奮性接合後電流（MEJC）を明確に検出することが可能になります。
- MEJCの振幅の変化は、電極配置の影響を示しています。
- 変異体において電気生理学的な変化が認められ、シナプス機能不全に関する知見が得られました。
- この手法により、遺伝的モデルにおける操作前後の明確なシナプス挙動の違いが特定されました。
結論
- 本研究は、個々の放出部位におけるシナプス活動を調査するための有用なアプローチを提示しています。
- シナプス電流を理解することは、ニューロンのメカニズムとシナプス可塑性に関する知見を深めることにつながります。
- 最終的に、この手法はシナプス機能に対する遺伝的影響を研究するという、より広範な意義に寄与します。
よくある質問
業界における重要性
Drosophila幼虫の神経筋接合部における局所マクロパッチ記録により、個々の放出部位におけるシナプス伝達の精密な解析が可能となり、初期探索段階におけるメカニズムのリスク低減が促進されます。このアプローチは、シナプス電流に関する高解像度かつ定量的なデータを提供し、遺伝的に定義された摂動に対する機能的なターゲット検証およびパスウェイの解明を容易にします。本手法は、シナプス生物学モデルにおける予測精度を高め、神経生物学に特化したR&Dにおけるポートフォリオの選別および推進に関する意思決定に寄与します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- シナプス蛋白の遺伝子変異が神経伝達にどのように影響するかを直接的に評価することが可能です。
- 特定のブトンにおけるシナプス活性を単離することで、候補ターゲットの機能的検証をサポートします。
- パスウェイの解析および生物学的リスク低減に向けたメカニズムの明確化を提供します。
- シナプスターゲットの選択または優先順位の低下における予測精度を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 高い時間分解能でシナプス電流を測定するための、検証済み定量アッセイシステムを構築します。
- 化合物または遺伝子スクリーニングに向けた、ミニチュアおよび誘発シナプスイベントの再現性のある検出を可能にします。
- さまざまな実験条件下における電気生理学的リードアウトの標準化をサポートします。
- 遺伝学的な操作が可能なシステムにおいて、シナプス機能のモジュレーターを評価するための堅牢なプラットフォームを準備します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 遺伝学的操作が可能な生物を用いてグルタミン酸作動性シナプス伝達をモデル化することにより、疾患に関連するメカニズムと整合させます。
- 分子レベルの発見から、シナプスフェノタイプの前臨床検証までの連続性を提供します。
- シナプス電流に機能的影響を及ぼすことが実証された標的を、リスク調整した上で進展させることが可能です。
- 定量的な電気生理学的エンドポイントを通じて、トランスレーショナルバイオマーカーの開発を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期のメカニズム研究から前臨床モデルのバリデーションに至る発見の連続性の中に組み込まれており、遺伝子操作と機能的なシナプスリードアウトを橋渡しするものです。
- 探索生物学： 特定のシナプス蛋白質および経路の役割に関する仮説検証を促進します。
- スクリーニング： アッセイ開発およびスクリーニングへの適用に向けて、定量的で再現性のあるシナプス電流測定を提供します。
- 分析： 遺伝学的または薬理学的介入の比較分析に有用な、高忠実度の電気生理学的データを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 分子レベルの摂動を、疾患モデルに関連する機能的なシナプス結果へと結びつけます。
- エンタープライズでの再利用： 複数のプログラムにわたる継続的なターゲットバリデーションおよびメカニズム研究に利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： シナプス標的のバリデーションにおける予測信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用的価値： 再現性と拡張性のための電気生理学的ワークフローを標準化する。
- 戦略的価値： 機能的影響を早期に明確にすることで、go/no-go判断を導き、資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響： 開発に向けたシナプス標的および経路のリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 電気生理学の専門知識および精密な微小電極操作技術が必要です。
- 高倍率のDIC/蛍光顕微鏡やボルテージクランプ増幅器などの専門的な装置を必要とします。
- 電極作製および記録プロトコルについて、チーム間での厳格な標準化が必要です。
- 他のモデルシステムに適用する場合、組織へのアクセスやシナプス構造に応じたプロトコルの最適化が必要になる場合があります。
- 電極配置に対する感受性が高いことや、データの質を確保するために安定したシール抵抗が必要であることなどの制限があります。
