活性型アゴニストを用いた T 細胞活性化の空間的で、一時的なコントロール

このプロトコルでは、T リンパ球活性型ペプチド-MHC T 細胞活性化の正確な時空間制御を有効にするを使用してアクティブにするイメージング ベースの方法について説明します。

このプロトコルの全体的な目標は、Tリンパ球に分極シグナル伝達を誘導するための光活性化性ペプチドMHCの使用を説明することです。この方法は、リンパ球がどのようにして急速な局在化シグナルを伝達し、それらのシグナルに対して分極した細胞応答をマウントするかなど、免疫細胞シグナル伝達における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、T細胞シグナル伝達の空間的時間制御を提供することです。

これは、T細胞受容体の活性化の正確な時間と位置を固定することによって行われます。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるElisa Sanchezです。まず、蒸留脱イオン水で1〜500に希釈したビオチン化ポリ-L-リジン(bio-PLL)を8ウェルチャンバーのカバーガラスに加えます。

室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、蒸留脱イオン水で洗浄し、室温で2時間乾燥させます。bio-PLLコーティングされた表面を、HEPES緩衝生理食塩水と2%BSAからなるブロッキングバッファーで室温で30分間ブロックします。

インキュベーション後、ウェルを乾燥させずに、bio-PLLコーティング表面からブロッキングバッファーを取り出します。次に、ストレプトアビジンを加え、摂氏4度でインキュベートします。1時間後、コーティングされた表面をHBSで洗浄します。

チャンバースライドウェルを4〜5回充填して反転させ、ウェルからHBSを取り除きます。井戸を乾かさないでください。CD4陽性T細胞またはCD8陽性細胞の特異的なビオチン化光活性化ペプチド、主要組織適合遺伝子複合体リガンド、および接着分子をbio-PLLコーティング表面に添加します。

光から保護し、室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、前と同じように洗浄し、播種の準備が整うまでHBSに放置します。最後に、適切なTCRを発現する200,000個のCD4陽性またはCD8陽性T細胞を正しいウェルに加え、細胞を摂氏37度で15分間接着させます。

細胞が表面に付着して広がると、光活性化とイメージングの準備が整います。画像取得には、UV対応の150倍対物レンズを装備した倒立型全反射蛍光顕微鏡を使用します。緑と赤の両方のチャンネルで、それぞれ488ナノメートルと561ナノメートルの励起レーザーを使用してプローブを監視します。

T細胞を含むチャンバースライドをマウントした後、必要に応じて顕微鏡の設定を調整して、TIRFまたは落射蛍光照明を取得します。Live(ライブ)モードでは、目的の蛍光プローブを発現している細胞のフィールドを選択します。ソフトウェア制御を使用して、個々の細胞の下に光活性化のためのミクロンスケールの領域を確立します。

その後、取得を開始します。通常、80のタイムポイントが必要で、それぞれの間には5秒の間隔があります。これにより、デュアルカラー実験の場合、488ナノメートルと563ナノメートルの連続露光の時間が残されます。

その後、10点を取得した後、デジタル絞りシャッターを1〜1.5秒間開いて、選択した領域を光活性化します。タイムラプスが完了したら、新しいセルのフィールドを選択し、プロセスを繰り返します。まず、バックグラウンド補正に使用する細胞外のバックグラウンド領域の蛍光強度を決定します。

セルの外側にミクロンサイズの正方形の領域を描き、マスクを作成します。蛍光強度を決定するには、[Analyze]、[Mask Statistics]の順にクリックします。[平均蛍光強度] を選択し、値をエクスポートします。

各時点の光活性化領域内の蛍光強度を決定します。「マスク」を選択して、光活性化された領域を強調表示します。蛍光強度を決定するには、[Analyze]、[Mask Statistics]の順にクリックします。

[Mean fluorescence intensity]を選択し、値をエクスポートします。光活性化された領域の中心の X 座標と Y 座標を取得するには、Mask を選択して光活性化された領域を強調表示します。光活性化の領域が強調表示されたら、[分析]、[統計のマスク]、[領域の中心]、[値のエクスポート]の順に選択します。

対象の蛍光プローブのX座標とY座標を決定します。[Manual Particle Tracking] を選択し、経時的に目的の蛍光プローブをクリックします。すべての時点が追跡されたら、[分析]、[統計のマスク]、[エリアの中心]、[値のエクスポート] の順に選択します。

T細胞は、光活性化可能なMCC-IEFKを含むチャンバーカバーガラスに付着した。脂質セカンドメッセンジャーDAGのプローブであるC1-GFPを、TIRF顕微鏡とRFP-Tubulinの落射蛍光モードでイメージングしました。T細胞下の表面の局所的な光活性化は、照射されたゾーンにDAGの蓄積を誘導します。

これに続いて、数秒以内に中心体が同じ領域に向きを変えます。C1-GFPの蓄積は、光活性化領域の中心でバックグラウンド補正後の正規化された蛍光強度を経時的に計算することで定量化できます。光活性化に応答した中心体の配向の変化は、中心体と光活性化領域の中心との間の距離を時間の関数として計算することによって定量化できます。

一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば1日未満で行うことができます。通常、この時間で分析するために15〜20本のタイムラプスムービーを生成します。このアプローチは、研究者がT細胞における活性化シグナル伝達の正確な動態と分極を探求する道を開きました。

また、ナチュラルキラー細胞における阻害性シグナル伝達の研究にも適応されました。その結果、コミュニケーション性免疫細胞の相互作用がどのように組み立てられ、溶解するかについての理解が深まりました。