活性型アゴニストを用いた T 細胞活性化の空間的で、一時的なコントロール
2018年4月25日
このプロトコルでは、T リンパ球活性型ペプチド-MHC T 細胞活性化の正確な時空間制御を有効にするを使用してアクティブにするイメージング ベースの方法について説明します。
このプロトコルの全体的な目標は、Tリンパ球に分極シグナル伝達を誘導するための光活性化性ペプチドMHCの使用を説明することです。この方法は、リンパ球がどのようにして急速な局在化シグナルを伝達し、それらのシグナルに対して分極した細胞応答をマウントするかなど、免疫細胞シグナル伝達における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、T細胞シグナル伝達の空間的時間制御を提供することです。
これは、T細胞受容体の活性化の正確な時間と位置を固定することによって行われます。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるElisa Sanchezです。まず、蒸留脱イオン水で1〜500に希釈したビオチン化ポリ-L-リジン(bio-PLL)を8ウェルチャンバーのカバーガラスに加えます。
室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、蒸留脱イオン水で洗浄し、室温で2時間乾燥させます。bio-PLLコーティングされた表面を、HEPES緩衝生理食塩水と2%BSAからなるブロッキングバッファーで室温で30分間ブロックします。
インキュベーション後、ウェルを乾燥させずに、bio-PLLコーティング表面からブロッキングバッファーを取り出します。次に、ストレプトアビジンを加え、摂氏4度でインキュベートします。1時間後、コーティングされた表面をHBSで洗浄します。
チャンバースライドウェルを4〜5回充填して反転させ、ウェルからHBSを取り除きます。井戸を乾かさないでください。CD4陽性T細胞またはCD8陽性細胞の特異的なビオチン化光活性化ペプチド、主要組織適合遺伝子複合体リガンド、および接着分子をbio-PLLコーティング表面に添加します。
光から保護し、室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、前と同じように洗浄し、播種の準備が整うまでHBSに放置します。最後に、適切なTCRを発現する200,000個のCD4陽性またはCD8陽性T細胞を正しいウェルに加え、細胞を摂氏37度で15分間接着させます。
細胞が表面に付着して広がると、光活性化とイメージングの準備が整います。画像取得には、UV対応の150倍対物レンズを装備した倒立型全反射蛍光顕微鏡を使用します。緑と赤の両方のチャンネルで、それぞれ488ナノメートルと561ナノメートルの励起レーザーを使用してプローブを監視します。
T細胞を含むチャンバースライドをマウントした後、必要に応じて顕微鏡の設定を調整して、TIRFまたは落射蛍光照明を取得します。Live(ライブ)モードでは、目的の蛍光プローブを発現している細胞のフィールドを選択します。ソフトウェア制御を使用して、個々の細胞の下に光活性化のためのミクロンスケールの領域を確立します。
その後、取得を開始します。通常、80のタイムポイントが必要で、それぞれの間には5秒の間隔があります。これにより、デュアルカラー実験の場合、488ナノメートルと563ナノメートルの連続露光の時間が残されます。
その後、10点を取得した後、デジタル絞りシャッターを1〜1.5秒間開いて、選択した領域を光活性化します。タイムラプスが完了したら、新しいセルのフィールドを選択し、プロセスを繰り返します。まず、バックグラウンド補正に使用する細胞外のバックグラウンド領域の蛍光強度を決定します。
セルの外側にミクロンサイズの正方形の領域を描き、マスクを作成します。蛍光強度を決定するには、[Analyze]、[Mask Statistics]の順にクリックします。[平均蛍光強度] を選択し、値をエクスポートします。
各時点の光活性化領域内の蛍光強度を決定します。「マスク」を選択して、光活性化された領域を強調表示します。蛍光強度を決定するには、[Analyze]、[Mask Statistics]の順にクリックします。
[Mean fluorescence intensity]を選択し、値をエクスポートします。光活性化された領域の中心の X 座標と Y 座標を取得するには、Mask を選択して光活性化された領域を強調表示します。光活性化の領域が強調表示されたら、[分析]、[統計のマスク]、[領域の中心]、[値のエクスポート]の順に選択します。
対象の蛍光プローブのX座標とY座標を決定します。[Manual Particle Tracking] を選択し、経時的に目的の蛍光プローブをクリックします。すべての時点が追跡されたら、[分析]、[統計のマスク]、[エリアの中心]、[値のエクスポート] の順に選択します。
T細胞は、光活性化可能なMCC-IEFKを含むチャンバーカバーガラスに付着した。脂質セカンドメッセンジャーDAGのプローブであるC1-GFPを、TIRF顕微鏡とRFP-Tubulinの落射蛍光モードでイメージングしました。T細胞下の表面の局所的な光活性化は、照射されたゾーンにDAGの蓄積を誘導します。
これに続いて、数秒以内に中心体が同じ領域に向きを変えます。C1-GFPの蓄積は、光活性化領域の中心でバックグラウンド補正後の正規化された蛍光強度を経時的に計算することで定量化できます。光活性化に応答した中心体の配向の変化は、中心体と光活性化領域の中心との間の距離を時間の関数として計算することによって定量化できます。
一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば1日未満で行うことができます。通常、この時間で分析するために15〜20本のタイムラプスムービーを生成します。このアプローチは、研究者がT細胞における活性化シグナル伝達の正確な動態と分極を探求する道を開きました。
また、ナチュラルキラー細胞における阻害性シグナル伝達の研究にも適応されました。その結果、コミュニケーション性免疫細胞の相互作用がどのように組み立てられ、溶解するかについての理解が深まりました。
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概要
このプロトコルでは、光活性化ペプチド-MHCを用いてTリンパ球を活性化するイメージングベースの手法について解説します。これにより、T細胞活性化の精密な時空間的制御が可能になります。本技術を用いることで、リンパ球がどのように迅速な局所信号を伝達し、極性化した細胞応答を誘導するかを研究することができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 細胞シグナル伝達
- 神経科学
背景
- T細胞の活性化を理解することは、免疫応答研究において極めて重要です。
- 光活性化ペプチドMHCは、T細胞シグナル伝達を研究するための新しいアプローチを提供します。
- この手法により、免疫細胞における時空間的なダイナミクスの調査が可能になります。
- Tリンパ球における極性化したシグナル伝達は、効果的な免疫応答に不可欠です。
研究目的
- Tリンパ球において極性シグナリングを誘導する方法を記述すること。
- 免疫細胞における迅速な局所的信号伝達のメカニズムを探索すること。
- 研究者が本研究を再現するための詳細なプロトコルを提供すること。
使用方法
- チャンバー付きカバーガラスにおけるビオチン化ポリ-L-リシン（bio-PLL）の使用。
- T細胞活性化のための光活性化ペプチド-MHCの適用。
- T細胞応答をモニタリングするためのイメージング技術。
- 大学院生による手順の実演。
主要な結果
- 正確な空間制御によるTリンパ球の活性化に成功した。
- 局在的な刺激に応答した極性シグナリングを実証した。
- T細胞受容体活性化のダイナミクスに関する知見を提供した。
- 免疫細胞のシグナリング経路のさらなる探索を可能にした。
結論
- このプロトコールは、T細胞の活性化を研究するための有用なツールとなります。
- 時空間的な制御により、免疫応答への理解が深まります。
- この手法は、免疫学的研究の進展につながる可能性があります。
よくある質問
産業上の重要性
本プロトコルは、T細胞受容体（TCR）活性化の精密な時空間的制御を可能にするものであり、迅速かつ極性化したシグナリング事象を解析するという、免疫学および免疫療法研究における重要なニーズに応えるものです。TCR刺激を下流の細胞骨格再編成に結びつけることで、T細胞誘導 therapies（T cell–engaging therapies）における標的バリデーションのためのメカニズム的なリスク低減ツールを提供します。このアプローチは、バイオ医薬品および低分子免疫調節剤の開発に関連するシグナル伝達ダイナミクスの定量的かつ高解像度なモニタリングを可能にし、初期探索段階における予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：局所的なTCR活性化を可能にすることで治療仮説を検証し、免疫シナプス形成に至るシグナリング経路を明らかにします。
- 実用的価値：DAG蓄積や中心体再配向などの極性応答の読み取りを通じて、機能的なターゲット検証を支援します。
- 予測的価値：免疫調節剤の有効性に不可欠な信号伝達の速度論的および空間的パラメータを明らかにすることで、ターゲット選択の信頼性を高めます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備： 活性化タイミングを制御した、下流の化合物または抗体スクリーニング用の検証済みT細胞–pMHC相互作用系を構築します。
- 定量的な出力： 機能的な読み取り値として、脂質プローブ（例：C1-GFP）の蛍光強度の変化およびオルガネラのリポジショニングの標準化された測定を可能にします。
- 拡張性と再利用性： 遺伝学的および薬理学的な摂動に対応しており、標的クラスや摂動戦略を問わずプラットフォームを再利用できます。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患との関連性：自己免疫疾患、感染症、および腫瘍学的な適応症に関連するT細胞介在性免疫の鍵となるプロセスである、免疫シナプスの形成をモデル化します。
- トランスレーショナルな継続性：初期のシグナリングイベントから機能的な結果までを橋渡しし、前臨床モデルにおけるリスク調整後の開発推進の意思決定を支援します。
- メカニズムによるリスク低減：TCRの結合と細胞骨格の極性化との間の因果関係を明確にし、作用機序研究における曖昧さを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は初期のディスカバリー段階に位置づけられ、ターゲットバリデーションにおける仮説検証をサポートし、リード化合物同定前における免疫調節剤スクリーニングのためのアッセイ開発を可能にします。
- 探索生物学：TCR活性化を独立変数として分離することで、下流のシグナリングノードおよび経路依存性を調べる仮説検証を支援します。
- スクリーニング：再現性のある光制御活性化と、自動化に適したイメージングと互換性のある定量可能な蛍光リードアウトにより、アッセイの準備状態を提供します。
- 分析：条件比較とシグナルダイナミクスのモデリングを可能にする、定量的な従属変数の測定値（例：正規化された蛍光強度、中心体変位）を生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：分子的な開始イベントを細胞の極性化へと結びつけ、前臨床検証におけるバイオマーカー関連の機能アッセイと整合させます。
- エンタープライズ再利用：さまざまなTCR–pMHCペアおよび免疫細胞型に適用可能な、時空間制御のための再利用可能なイメージングプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 初期TCRシグナル伝達イベントにおけるメカニズムの曖昧さを排除することで、ターゲット検証における予測信頼性を提供します。
- 運用的価値： 精密な光制御による活性化と定量可能なTIRFベースのリードアウトにより、標準化と再現性を確保します。
- 戦略的価値： 免疫調節因子のシグナル忠実度と極性化能力を早期に評価可能にすることで、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響： ターゲット結合を治療 efficacy の予測因子である機能的シナプス形成に結びつけることで、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- T細胞の培養、蛍光プローブのトランスフェクション、および全内部反射蛍光顕微鏡（TIRFM）に関する専門知識が必要です。
- UV対応の光学系、光活性化pMHC試薬、および2色イメージング基盤に依存します。
- ユーザー間および施設間での、光活性化のタイミング、領域選択、および背景補正の標準化が必要です。
- 異なるTCR特異性、蛍光プローブ、および免疫細胞サブタイプ（例：NK細胞）への適応検討が含まれます。
- 実用的制限として、UV曝露による光毒性のリスクや、1秒未満のシグナル伝達ダイナミクスを捉えるための高速画像取得の必要性が挙げられます。
