抗と新規 HEp 2 エリート/DFS70 ノックアウト基板アナ選考において混合 DFS70 パターンの同時の区別

この手順の全体的な目標は、Novel HEp-2、高密度微細斑点70ノックアウト基質を使用して抗核自己抗体をスクリーニングし、同時に単一特異的および混合高密度微細斑点70パターンを確認する改良された間接免疫蛍光アッセイを実証することです。新規HEp-2基質は、臨床的に重要な抗核抗体(ANAとも呼ばれる)のスクリーニングに、標準的な間接免疫蛍光法と解釈基準を使用します。主な利点は、スクリーニングステップで、緻密な微細な斑点のある70パターンを、疾患に関連するパターン、均質な斑点のあるパターン、または困難な混合パターンと区別できることです。

手順を実演するのは、品質管理研究所の技術者であるソフィア・バダニンです。基板スライドには、各スライドに12ウェルのガラススライドを使用し、従来のHEp-2細胞、または従来の高密度で微細な斑点のある70ノックアウトHEp-2細胞の混合物のいずれかを含みます。基板スライドを含むパウチを室温まで平衡化させて最適な性能を発揮し、サンプルを添加する前にスライド表面の水分の結露を防ぎます。

これには 10 分から 15 分かかります。室温に平衡化したら、スライドとポーチの側面が接触しないように、指を使って基板スライドを慎重に取り出します。スライドにラベルを付け、サンプルとコンジュゲートのインキュベーション中にスライドが乾燥するのを防ぐために、湿らせたペーパータオルで裏打ちされたインキュベーションチャンバーに入れます。

約50マイクロリットルのネガティブコントロールとポジティブコントロール、および希釈した患者血清を個々のスライドウェルに分注してから、スライドをインキュベーションチャンバーに入れます。ANA検査は、自己免疫疾患のスクリーニングの第一歩です。スライド上の患者サンプルのクロスコンタミネーションを回避することは、偽陽性または偽陰性の結果を最小限に抑えるために重要です。

ウェルの相互汚染を防ぐために、ウェルを過剰に充填しないでください。インキュベーションチャンバーに蓋をし、スライドを室温で30分間インキュベートします。患者の血清中にANAが存在する場合、この間に各遺言に存在する細胞に結合します。

インキュベーション期間が終了したら、スライドをインキュベーションチャンバーから取り出します。スライドをタブの端に保持し、再構成されたリン酸緩衝生理食塩水洗浄緩衝液の約10ミリリットルで10〜15秒間穏やかですすいでください。スライドをすぐにPBS洗浄バッファーを入れたCoplinジャーに移し、10分間浸します。

残りのすべてのスライドでこのプロセスを繰り返します。Coplinジャーから一度に1つのスライドだけを取り出します。スライドから余分なPBS洗浄バッファーを取り除くには、ペーパータオルでスライドを軽くたたいて吸い取ります。

各ウェルに、抗ヒトIgG蛍光コンジュゲートを標識したフルオレセインイソチオシアネートを1滴静かに塗布します。次に、スライドを密閉染色インキュベーションチャンバーで30分間インキュベートします。インキュベーション期間が終了したら、スライドをインキュベーションチャンバーから取り出します。

スライドをタブの端に保持し、以前と同様に、約10ミリリットルのPBSウォッシュバッファーで穏やかですすいでください。スライドをすぐにPBS洗浄バッファーを入れたCoplinジャーに移し、10分間浸します。キットに付属のカバースリップを乾いたペーパータオルの上に置きます。

カバースリップの下端に、封入剤を3〜4滴一列に塗布します。次に、洗浄バッファーが入ったCoplinジャーから一度に1枚のスライドを取り出します。余分なウォッシュバッファーを取り除くには、ペーパータオルのスライドを軽くたたいて拭きます。

スライドに過剰な量の洗浄バッファーを残したり、カバースリップに過度の圧力をかけたり、気泡を導入したりしないでください。これらはすべて、細胞の形態、結果として生じる蛍光パターン、および反応の強度に影響を与える可能性があります。スライドの下端をカバースリップの端に合わせ、スライドをカバースリップにそっと下ろします。

これにより、カバースリップ上に存在する封入剤がスライドの上端に流れ込み、各ウェルの読み取りを妨げる可能性のある気泡の形成を最小限に抑えることができます。暗室に設置されたフルオレセインイソチオシアネートフィルターセットを使用して、蛍光顕微鏡でスライドを表示します。顕微鏡下で特定の明るい緑色の蛍光についてサンプルを200倍以上の倍率で調べ、陽性とパターンに関する最終的な解釈を行います。

ポジティブコントロールとネガティブコントロールを観察します。ポジティブコントロールは、核内で明るい緑色の蛍光を示します。ネガティブコントロールは、蛍光顕微鏡下で特定の緑色蛍光を示さない。

各ウェルの陽性または陰性の結果を記録し、陽性ケースのANAパターンを含めます。HEp-2緻密で微細な斑点のある70ノックアウト基質は、すべての主要な核および細胞質パターンを保持します。密集した微細な斑点模様は、間期核全体に均一に分布した斑点状染色の存在と、有糸分裂期のクロマチンの存在によって特徴付けられます。

密集した微細な斑点のある70抗原を発現する従来のHEp-2細胞と、抗原を欠く改変されたHEp-2細胞の両方が存在することで、従来のHEp-2基質のすべての利点を保持しつつ、高密度の微細な斑点のある70パターンの正確な鑑別が容易になります。主要な疾患に関連するANAパターンに対して陽性の血清を、密集した微細な斑点のある70パターン陽性の血清と等しい割合で混合し、従来のHEp-2とHEp-2の高密度の微細な斑点のある70ノックアウト基質の両方で試験しました。ここで、赤い矢印は有糸分裂期の細胞を示しています。

黄色の矢印は従来のHEp-2原子核を示し、青色の矢印は操作されたHEp-2原子核を示しています。描かれた反応のすべての組み合わせについて、密集した微細な斑点のある70ノックアウト基質は、同じ視野上の未修飾細胞と改変細胞との間に明確な強度差を示しています。これは、単一特異的反応と混合された密集した微細な斑点のある70反応を区別するのに役立ちます。

核抗原および細胞質抗原に対する自己抗体は、全身性自己免疫疾患で非常に一般的です。PSIP1タンパク質としても知られるDFS70に対する自己抗体に起因する密集した微細な斑点模様は、健康な集団で非常に一般的であると報告されています。さらに、これらのDFS70自己抗体は、単独でも、他の疾患関連ANAとも一緒に存在します。

そのため、臨床検査室では、このパターンを他の疾患関連パターンと正確に区別することが重要になります。例えば、狼瘡に関連する均質な斑点パターンが混在していると、DFS70パターンと誤解される可能性があり、複数の確認アッセイが必要になります。HEp-2基質を用いた間接免疫蛍光法は、ANAのゴールドスタンダードなスクリーニング法と考えられています。

ただし、精度は、技術者のスキル、個々のステップの慎重な実行、および結果として生じるパターンの正確な解釈に大きく依存します。一方、従来のHEp-2ノックアウト基板とDFS70ノックアウト基板の比較評価では、この新しい基板が、ANAのスクリーニングにおいてDFS70パターンを高い信頼性で識別する上で有用であることを示しています。モノポジティブおよび混合DFS70パターンのさらなる解釈は、この改良されたHEp-2基質を使用して比較的簡素化されました。

新しい基質は、標準的な間接免疫蛍光プロトコルと、臨床的に関連するすべてのANAパターンに対して確立された解釈基準を使用しています。