Name: 抗と新規 HEp 2 エリート/DFS70 ノックアウト基板アナ選考において混合 DFS70 パターンの同時の区別 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-17T10:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学ぶ 新規HEp-2 DFS70ノックアウト基板を用いた間接免疫蛍光法による抗核抗体スクリーニング。DFS70パターンと疾患関連パターンの同時区別により、自己免疫疾患診断の精度向上に貢献します。

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ありがとうアンドリュー Zenger IIF 実験を行い、画像を収集します。

プロトコル三位一体のバイオ テクノロジー機関人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。
1. サンプルと基板の準備
<ol><li>基板スライドを含む袋を許可 (HEp2 や HEp のいずれかが含まれているスライドごとに 12 の井戸をスライド ガラス-2 + KO HEp2 細胞混合) する前に、スライドの表面に水分が凝縮を防ぎ最適なパフォーマンスのための部屋の温度を平衡させ、サンプルの追加。これは約 10-15 分の間に取る必要があります。</li>
	<li>部屋の温度平衡、一度、袋の側面に触れることがなく指を使って基板のスライドを慎重に取り外します。</li>
	<li>スライドのラベル、サンプルおよび共役潜伏中にスライドの乾燥を防ぐために水で湿らせたペーパー タオルで並ぶ (常温) インキュベーション室に配置。 注: は、ドライ井に生じる非特異染色培養チャンバー内湿紙タオルは、湿度を提供し、よく乾燥を防ぎます。</li>
</ol>2. コントロールとサンプルの追加
<ol><li>この研究、または個々 のスライドの井戸に患者血清サンプルで説明されているように DFS70 ANA 陽性血清の組み合わせ、正/負コントロールの約 50 μ L を調剤します。</li>
	<li>スライドの各ウェルにコントロールとサンプルを調剤します。</li>
	<li>よくクロス汚染を防ぐためには、井戸をオーバフィ リングを避けます。ないオーバフィ リング井戸、井戸の表面の完全なカバレッジを確保する、気泡を避けるため。 注: 推奨されるボリュームはステップ 2.1 あたり 50 μ L です。</li>
	<li>培養チャンバーのふたを閉めて室温で 30 分間スライドを孵化させなさい。患者の血清中に任意のアナ、この潜伏期間中に各ウェルの現在のセルにバインドします。</li>
	<li>潜伏期間が終われば、培養室からスライドを削除します。タブ端にスライドを保持するおよび約 10 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 洗浄バッファー ピペットを使用して、キットに付属で優しく洗い流してくださいまたは 10-15 s. の PBS が入ったビーカーに PBS 洗浄バッファーと洗浄 (Coplin jar にすぐにスライドを転送ソーク) 10 分すべて残りのスライドで処理を繰り返します。 注: これになりますとスライドの携帯側が別のスライドを接触しないように Coplin jar ファイルに複数のスライドを配置する場合に、スライド ガラスに付着、細胞の損傷します。</li>
</ol>3. 添加蛍光灯共役
<ol><li>Coplin jar ファイルから一度に 1 つだけのスライドを削除します。優しく、スライドから余分な PBS 洗浄バッファーを削除するには、] をタップまたはペーパー タオルの上のスライドのしみ。各キットは、FITC 標識抗ひと IgG 蛍光共役で提供されます。各ウェルにそっと 1 滴 (約 50 μ L) 提供の共役を適用します。</li>
	<li>30 分間閉じた染色培養室でスライドを孵化させなさい。 注: Fc 特定 IgG 複合体の使用をお勧めします。患者の血清中に任意のアナ、共役は井戸の存在の細胞の特定の蛍光性の結果この潜伏期間中に各ウェルに存在のセルにバインドします。共役は、光に敏感です。閉じたインキュベーション室は、各ウェルに存在の細胞の共役反応を光の干渉を防ぐために役立ちます。</li>
	<li>潜伏期間が終われば、培養室からスライドを削除します。タブ端にスライドを保持して、ピペットを使用して、キットまたは PBS が入ったビーカーに約 10 mL の PBS 洗浄バッファーで軽くすすいでください。10 分は残りのすべてのスライドのプロセスを繰り返すために、スライドを PBS 洗浄バッファーと洗浄 (浸漬) Coplin jar にすぐに転送します。 注: これになりますとスライドの携帯側が別のスライドを接触しないように Coplin jar ファイルに複数のスライドを配置する場合に、スライド ガラスに付着、細胞の損傷します。</li>
	<li>場所 coverslips 乾燥したペーパー タオルの上にキットで提供されています。メディアをマウント キットで提供されます。Coverslip の下端行のメディアをマウントの 3-4 滴の間適用します。</li>
	<li>洗浄バッファーを含む Coplin jar から一度に 1 つのスライドを取り出します。優しく、過剰な洗浄バッファーを削除するには、] をタップまたはペーパー タオルの上のスライドのしみ。</li>
	<li>カバーガラスの端にスライドの下端を配置することによって、coverslip に優しくスライドを下げます。これはスライドの上端に流れる低いエッジ coverslip の現在のメディアをマウントできスライドの各ウェルの読み取りを妨げていることがあります空気の泡の形成を最小限に抑えます。 注: スライドにカバー スライドをマウントする最小限の圧力を使用ください。任意の余分な圧力は、カバー スリップの横方向の動きを引き起こす可能性が。これは歪みの結果のセルの単分子膜作製への損傷を引き起こします。</li>
	<li>2-8 ° C で暗闇の中でスライドを保存します。すぐにマウントされている、または 48 時間以内は、スライドを確認します。 注: パターンと蛍光信号の劣化で長期保管があります。</li>
</ol>4. 肯定的な、否定的な結果の識別
<ol><li>暗い部屋にある FITC フィルター セットを使用して蛍光顕微鏡でスライドを表示します。</li>
	<li>200 陽性に関する最終的な解釈をして、パターンに倍以上の倍率で蛍光顕微鏡下で特定の明るい緑の蛍光性を調べます。正と負のコントロールを確認します。 注: (図 2 a均質) 核に明るい蛍光グリーンは、肯定的なコントロールが表示されます。ネガティブ コントロールには、蛍光顕微鏡下で特定の緑の蛍光性が表示されません。</li>
	<li>各ウェルの正/負の結果を記録し、陽性例でアナのパターンが含まれます。</li>
</ol>

<ol><li>American College of Rheumatology. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf">https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf</a> (2011).</li>
<li>Meroni, P. L., Schur, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANA+screening%3A+an+old+test+with+new+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">ANA screening: an old test with new recommendations.</a> Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).</li>
<li>Agmon-Levin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+recommendations+for+the+assessment+of+autoantibodies+to+cellular+antigens+referred+to+as+anti-nuclear+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies.</a> Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).</li>
<li>Chan, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+of+the+First+International+Consensus+on+Standardized+Nomenclature+of+Antinuclear+Antibody+HEp-2+Cell+Patterns+2014-2015%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015.</a> Front Immunol. 6, 412(2015).</li>
<li>Malyavantham, K., Suresh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DFS70+pattern+and+impact+on+ANA+screening+using+a+novel+HEp-2+ELITE%2FDFS70+knockout+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Auto+Immun+Highlights%22%5BJournal%5D)">Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate.</a> Auto Immun Highlights. 8 (1), 3(2017).</li>
<li>Sperotto, F., Seguso, M., Gallo, N., Plebani, M., Zulian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-DFS70+antibodies+in+healthy+schoolchildren%3A+A+follow-up+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Anti-DFS70 antibodies in healthy schoolchildren: A follow-up analysis.</a> Autoimmun Rev. , (2017).</li>
<li>Ayaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+cytotoxic+anti-LEDGF+autoantibodies+in+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Detection of cytotoxic anti-LEDGF autoantibodies in atopic dermatitis.</a> Autoimmunity. 35 (5), 319-327 (2002).</li>
<li>Ochs, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+DFS+70+kd%2Ftranscription+coactivator+p75+in+atopic+dermatitis+and+other+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions.</a> J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).</li>
<li>Watanabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-DFS70+antibodies+in+597+healthy+hospital+workers%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers.</a> Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immune+response+directed+against+LEDGF+in+patients+with+VKH%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH.</a> Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).</li>
<li>Seelig, C. A., Bauer, O., Seelig, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+Against+DFS70%2FLEDGF+Exclusion+Markers+for+Systemic+Autoimmune+Rheumatic+Diseases+%28SARD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies Against DFS70/LEDGF Exclusion Markers for Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases (SARD).</a> Clin Lab. 62 (4), 499-517 (2016).</li>
<li>Ochs, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+autoantibodies+to+DFS70%2FLEDGFp75+in+health+and+disease%3A+integrating+basic+science+with+clinical+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding.</a> Clin Exp Med. 16 (3), 273-293 (2016).</li>
<li>Bizzaro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+chemoluminescence+and+immunoasdorption+tests+for+anti-DFS70+antibodies+avoid+false+positive+results+by+indirect+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Specific chemoluminescence and immunoasdorption tests for anti-DFS70 antibodies avoid false positive results by indirect immunofluorescence.</a> Clin Chim Acta. 451 (Pt B), 271-277 (2015).</li>
<li>Bizzaro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+the+lens+and+cornea+in+anti-DFS70-positive+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects.</a> Ann N Y Acad Sci. 1107, 174-183 (2007).</li>
<li>Daniels, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+autoantibodies+in+prostate+cancer%3A+immunity+to+LEDGF%2Fp75%2C+a+survival+protein+highly+expressed+in+prostate+tumors+and+cleaved+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Antinuclear autoantibodies in prostate cancer: immunity to LEDGF/p75, a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis.</a> Prostate. 62 (1), 14-26 (2005).</li>
<li>Dellavance, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+spectrum+of+antinuclear+antibodies+associated+with+the+nuclear+dense+fine+speckled+immunofluorescence+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern.</a> J Rheumatol. 32 (11), 2144-2149 (2005).</li>
<li>Gundin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+anti-DFS70+antibodies+in+patients+with+ANA-associated+autoimmune+rheumatic+diseases+suspicion+is+cost-effective%5BTitle%5D)+AND+%22Auto+Immun+Highlights%22%5BJournal%5D)">Measurement of anti-DFS70 antibodies in patients with ANA-associated autoimmune rheumatic diseases suspicion is cost-effective.</a> Auto Immun Highlights. 7 (1), 10(2016).</li>
<li>Kang, S. Y., Lee, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+dense+fine+speckled+pattern+in+anti-nuclear+antibody+test+using+indirect+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of dense fine speckled pattern in anti-nuclear antibody test using indirect immunofluorescence method.</a> Korean J Lab Med. 29 (2), 145-151 (2009).</li>
<li>Lee, H., Kim, Y., Han, K., Oh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+anti-DFS70+antibody+and+specific+autoantibody+test+algorithms+to+patients+with+the+dense+fine+speckled+pattern+on+HEp-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Application of anti-DFS70 antibody and specific autoantibody test algorithms to patients with the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells.</a> Scand J Rheumatol. 45 (2), 122-128 (2016).</li>
<li>Mariz, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+on+the+antinuclear+antibody-HEp-2+test+is+a+critical+parameter+for+discriminating+antinuclear+antibody-positive+healthy+individuals+and+patients+with+autoimmune+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).</li>
<li>Marlet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombophilia+Associated+with+Anti-DFS70+Autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Thrombophilia Associated with Anti-DFS70 Autoantibodies.</a> PLoS One. 10 (9), e0138671(2015).</li>
<li>Mercado, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+autoantibodies+to+DSF70%2FLEDGFp75+in+Mexican+Hispanics+using+multiple+complementary+assay+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Auto+Immun+Highlights%22%5BJournal%5D)">Detection of autoantibodies to DSF70/LEDGFp75 in Mexican Hispanics using multiple complementary assay platforms.</a> Auto Immun Highlights. 8 (1), 1(2017).</li>
<li>Muro, Y., Sugiura, K., Morita, Y., Tomita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concomitance+of+disease+marker+autoantibodies+in+anti-DFS70%2FLEDGF+autoantibody-positive+patients+with+autoimmune+rheumatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease.</a> Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).</li>
<li>Muro, Y., Sugiura, K., Nakashima, R., Mimori, T., Akiyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+prevalence+of+anti-DFS70%2FLEDGF+antibodies+in+patients+with+dermatomyositis+and+other+systemic+autoimmune+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Low prevalence of anti-DFS70/LEDGF antibodies in patients with dermatomyositis and other systemic autoimmune rheumatic diseases.</a> J Rheumatol. 40 (1), 92-93 (2013).</li>
<li>Mutlu, E., Eyigor, M., Mutlu, D., Gultekin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+anti-DFS70+antibodies+is+needed+in+routine+clinical+samples+with+DFS+staining+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Cent+Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Confirmation of anti-DFS70 antibodies is needed in routine clinical samples with DFS staining pattern.</a> Cent Eur J Immunol. 41 (1), 6-11 (2016).</li>
<li>Okamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+DFS70%2FLEDGF+are+increased+in+alopecia+areata+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to DFS70/LEDGF are increased in alopecia areata patients.</a> J Autoimmun. 23 (3), 257-266 (2004).</li>
<li>Pazini, A. M., Fleck, J., dos Santos, R. S., Beck, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+and+frequency+of+cytoplasmic+and+nuclear+dense+fine+speckled+patterns+observed+in+ANA-HEp-2%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Reumatol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance and frequency of cytoplasmic and nuclear dense fine speckled patterns observed in ANA-HEp-2.</a> Rev Bras Reumatol. 50 (6), 655-660 (2010).</li>
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</ol>

著者キショール Malyavantham と Lakshmanan Suresh トリニティ バイオ テクノロジー、米国の従業員であります。

核と細胞質の抗原に対する自己抗体は、全身性自己免疫疾患における非常に普及しています。IIF HEp 2 では全身性の自己免疫疾患2,3,4高感度・低コストのスクリーニング法として広くみなされる単一のアッセイは、最高の可能な感度と特異性を提供しないが.にもかかわらず、50 年以上の IIF プロトコルの普及により、IIF アッセイの精度はプロトコルの個々 のステップと手入れの行き届いたを使用して結果の正確な解釈を慎重に実行、技術者のスキルに大きく依存蛍光顕微鏡。HEp 2 によって基づくべき全身性の自己免疫疾患の診断は IIF など単一の血清学的テストの結果ありません。
高品質の試薬の溶解 (蒸留/脱イオン) 水、標準化されたキット コンポーネント (HEp 2 細胞膜、サンプル希釈液、正と負のコントロール、希釈最適化 FITC 共役、メディアをマウントとスライド) の使用結果に肯定的な影響があります。井戸のコントロールやサンプルの追加をスキップして偽否定的な解釈を促すことができます。サンプルやコントロールを追加することができます人工偽陽性反応および/または不適切なパターンの結果後、任意の時点でスライドの乾燥。スライド左側にあまりにも多くの洗浄バッファーや成果物につながるメディアをマウントの摂理の前にスライドの井戸の乾燥します。ぼやけているか顕微鏡下で観察すると焦点が合っていないを見て反応で起因できる媒体をマウントまたは観察を配置する前にスライドの表面に泡の生成の不足数量を追加します。マウント スライドを 2-8 ° C で保存し、偽否定的または人工の結果を最小限に抑える時間の推奨ウィンドウ内で解析する必要があります。
適切な LED/Hg/キセノン光源ときれいな光学部品は破損していない刺激および放出のフィルターを含むがある手入れの行き届いたエピ蛍光顕微鏡を用いた IIF の正確な結果を得るために重要です。エンド ユーザー識別の正/負の反応強度とパターンの解釈のトレーニングが重要です。HEp 2 IIF 試金プロシージャ、顕微鏡構成では、エンドユーザーのトレーニングやスキルの標準化の欠如に対して脆弱です。コンセンサス名称及び代表パターンと様々 なメーカーを使用して取得した画像の例は、ICAP で利用可能 (< www.ANApatterns.org>) 教育目的4。核、細胞質、細胞分裂の様々 なパターンの ICAP によって提供される HEp 2 セル パターン分類ツリーは未熟な目4に似て見えるかもしれませんが様々 なパターンの微妙な違いを学ぶ貴重なリソースです。挑戦的なパターンの主な例の 1 つはまた自己免疫の条件と異なる協会が不足している DFS70 と、このパターンは非常に健康的な集団5で普及し、前のセクションで説明したよう。
研究では、抗 DFS70 抗体の有病率は異なります健康コホート間 ANA スクリーニング集団と ANA 陽性の個体全身性自己免疫疾患9,16,20 の証拠と ,,3031。DFS70 抗体は、分離だけでなく、他の病気に関連する ANA パターンと発生すること報告されています。分離または抗 DFS70 パターンは健常者の 2-22% が自己免疫リウマチ性疾患32例の 1% 未満で報告されます。これらの傾向に基づき、DFS70 モノラル肯定的なパターンは、ICAP 委員会3,31,32により自己免疫リウマチ性疾患から除外する条件として提案されました。自己抗体テスト命名法の調和と ANA 報告 DFS70 陽性の報告推奨 HEp 2 IIF 結果の解釈を促進するために確立された ICAP の委員会審査結果4。
DFS70 モノラル陽性に基づく全身性自己免疫疾患を排除前、現在スクリーニングと確認方法 (特に DFS70 のそれらの特定) の状態を確認することが重要です。様々 な研究13,22,25,33 間様々 DFS70 HEp 2 iif 関数と固相験試金すなわち ELISA で陽性、CLIA、line イムノアッセイ/ドットしみメソッドと一致).この意見の相違に貢献するパラメーターがされている IIF 解釈および確証的アッセイ5,13,34は前述。抗 DFS70 抗体の確認のための提案された免疫吸着アプローチ (DFS70) のアドレスを現在の固相の試金の欠陥のいくつかが疑いのあるサンプルに IIF 手順の追加の手順を実行するラボを必要とします。結果13を報告するためのコストと所要時間が増加します。ANA のルーチンのスクリーニングに HEp 2 エリート/DFS70 島細胞を使用する場合、この追加の手順は必要ありません。これは、全体的なコストを削減、さらに納期への影響 DFS70 パターンを最初のスクリーニングの洞察としてステップない27があります。従来の HEp 2 IIF メソッドを使用して追加の欠点が共起する他の ANA パターン スクリーニング段階で DFS70 パターンを区別することです。しかし、HEp 2 エリート/DFS70 島細胞27の使用によってこの欠点を克服します。
従来 HEp 2 と新しい設計 HEp-2 (HEp 2 エリート/DFS70 KO) モノラル正 DFS70 コントロールと ANA 陽性コントロールおよびそれらの組合せを使用しての比較評価は同時に新しい基板の能力の有用性を示す画面の ANAs DFS70 パターン (図 1) を確認してください。新しい基板の IIF プロトコルは、従来の HEp 2 IIF 法と同じです。ANA パターンのすべての疾患に関連する解釈方式は DFS70 パターン (表 1) を除いて同じです。モノラル正と混合の DFS70 パターンの解釈は比較的簡単に新しいメソッドを使用して、追加の試金 (図 1 b) を保証しません。臨床実習でこの新しいメソッドの実装 DFS70 パターンの解釈に関連する課題を簡素化し、全日空 ANA 以前によって隠されているパターンの病気に関連するさらに明らかにしてスクリーニングの全体的な精度を向上DFS70 (混合パターン)。

ANAs は、自己免疫の仲介された全身性結合組織疾患1の特徴です。いくつかの方法は、スクリーニングと ANAs の確認に用いられます。Iif 関数を用いた HEp 2 基板のままは、最も広く使用される、頻繁 ANAs1,2のスクリーニング法を推奨します。酵素結合抗体法 (ELISA)、酵素免疫測定法 (EIA)、化学発光免疫測定法 (CLIA) ビーズ ベース マルチプレックスアッセイなど固相診断アッセイ方法論の進歩にもかかわらず、HEp 2 IIF は最も一般的なスクリーニングその診断の有用性とコスト有効性1,2,3のためのメソッドです。上記の試金技術が精製されたネイティブの限定セットに依存または組換え抗原ガラス スライド井戸に HEp 2 セル単分子膜の準備が自然な形で自己抗原の広範な配列を提示に対し分散核と細胞質、患者血清やポジティブ コントロールは、さまざまな自己免疫疾患に関連付けられているパターンの多数の結果から自己抗体と反応しています。これらのパターンは、細胞内抗原の位置に基づいて核、細胞質、細胞分裂のパターンに分類されます。各パターンと関連付けられた抗原・抗原および病気の状態は、よく特徴付けられて4です。IIF 法の存在は自然な構成の自己抗原の多数を維持するために適切に固定 HEp 2 細胞の単層培養ガラス スライドの井戸で患者とコントロール血清を孵化します。患者の血清やポジティブ コントロール抗体は、潜伏中に基板 (ガラス スライドも) HEp 2 細胞によって提示された抗原にバインドが許可されます。ポスト インキュベーション、非連結の抗体が洗浄し、フルオレセイン/フルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) 共役抗ひと igg 抗体試薬と結合した IgG クラスの抗体が検出されました。非連結報告共役で流されている、ガラス coverslips は、反応を保持し、蛍光顕微鏡下で観察できるメディアをマウントを使用してスライド上にマウントされます。反応が使用されるレポーターに従って構成されている適切な励起蛍光フィルターの組み合わせを搭載した蛍光顕微鏡下で観察される (FITC 記者診断顕微鏡通常を使用してフィルター 467 の加振範囲-498 nm、513-556 nm の発光範囲)。アナの存在は、細胞内の特定の構造の明るい緑の蛍光性によって示されています。自動分析プラットフォームとは異なり、IIF 方法論はシリアル希釈血清と重要なユーザーの専門知識5,6を必要とする染色パターンの視覚的肯定的な決定の困難なプロセスに依存します。これらの制限にもかかわらず HEp 2 iif 関数は最も広く使用されている残っているし、パターン (ICAP) の委員会、ANA に国際的なコンセンサスが ANAs のパターン解釈と命名に向けて標準化の努力のためのスクリーニング法を推奨IIF スライド処理、および結果の解釈3のオートメーション ソリューションの可用性の向上。
HEp 2 IIF 法、 psip1遺伝子産物 (LEDGF/p75/DFS70 とも呼ばれる) を対象とする自己抗体によって検出されたパターンの多数の間で、近年いくつかの理由4,5 に大きな関心を集めています。 ,6,7,8,9,10。DFS70 抗体は健常者、高価であるし、研究はこれまで DFS70 抗体7,8,9 の存在を明瞭な臨床協会を示すため失敗しています。、10、11,12,13。様々 な病気の状態と健康コホート研究6,8,9,10,14 の間で広く変化 DFS70 抗体の肯定的な結果を報告された率 ,,1516,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,,2728。混合均質な斑点パターンの解釈が均一または斑点パターンと抗 DFS70 パターンを区別しても、他の ANAs と共起する抗 DFS70 抗体は専門家の読者のためにも挑戦。IIF スクリーニング方法と DFS70 特定の固相試金の現在の世代は抗 DFS70 反応混合パターン (図 1 aアルゴリズムの黄色の斜線部分) からの差別化を図ることが可能ではありません。均一、まだら、DFS70 パターンまたは混合パターン、またはその逆誤解は、患者ケアに深刻な影響があります。現在一般的に使用されるプロトコルは以下のとおりです: ANAs の疾患に関連する臨床検査室採用固相確証的なテストの数および/または DFS70/LEDGF 高密度微細斑点 (AC-2) パターン時の免疫吸着法 (図の疑いがあります。1 a)4,5。
このプロトコルの目標は小説のユーティリティ設計 HEp 2 IIF 基板を示す、(HEp 2 エリート/DFS70 ノックアウト (KO) は HEp 2 エリートにいいますが) 同時 ANAs をスクリーニングするため従来 HEp 2 のすべての利点を保持します。抗と混合 ANA 陽性例 (図 1 bアルゴリズムの黄色の斜線部分)5の両方で信頼性の高さが DFS70 パターンと区別します。HEp 2 エリート基板は、1:9 の比率の5LEDGF/p75/DFS70 抗原を欠いてそのまま従来 HEp 2 細胞とエンジニア リングのおおよその混合で構成されます。HEp 2 エリートの iif 関数プロシージャは HEp 2 従来と同じです。HEp 2 エリート基板の固有の構成だけでなく従来の HEp2 のすべての利点を保持、初期スクリーニングまたはサンプル (図 1 b のテストで DFS70 パターンから均質な斑点、および混合反応パターンを区別できます。)5。HEp 2 IIF 基板をスライドに反応する患者血清希釈 1:40 で希釈を審査または個々 の臨床基準に従ってをする必要があります。1:40 またはより高い力価で特定の反応は、正と見なされます。
この研究では均一、まだら、セントロメア、核小体、細胞質網状/海部、スクリーニングで (相対的なネガティブ コントロールと正アナ コントロール キットによって提供される) 中程度の肯定的な信号を生産 DFS70 パターンに陽性血清1:40 の希釈は、HEp 2 基板上にモノラル固有および混合パターンをシミュレートするため選ばれた (従来、HEp 2 エリート)。1:40 1:40 と混合希釈 DFS70 陽性血清個々 の疾患に関連する ANA の希釈パターン様々 な比率 (コントロール: 正立単、試しました、50: 50、DFS70 のコントロール (同質なまだら、動原体、核小体、細胞質網状海部)20: 80、および 0:100)、従来の評価と HEp 2 エリート基板次標準 IIF 手順は以下の通り。

<table><tbody><tr><td>HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12ウェルスライド パウチに個別封入</td><td>トリニティバイオテック</td><td>キットの一部# 1108, 1108-120, 1108-240</td><td></td></tr><tr><td>ANAポジティブコントロール</td><td>トリニティバイオテック&nbsp;</td><td>キットの一部# 1108、1108-120、1108-240、1103、1103-240</td><td></td></tr><tr><td>DFS70抗体ポジティブコントロール</td><td>トリニティバイオテクノロジー</td><td>キットの一部# 1108、1108-120、1108-240</td><td></td></tr><tr><td>ネガティブコントロール</td><td>トリニティバイオテクノロジー</td><td>キットの一部# 1108、1108-120、1108-240、1103-240</td><td></td></tr><tr><td>エバンの青い対比染色を含む トリ</td><td>ニティバイオテクノロジー</td><td>キットの部品# 1108、1108-120、1108-240、1103、1103-240</td><td></td></tr><tr><td>血清用緩衝液希釈剤</td><td>Trinity Biotech</td><td>キットの一部# 1108、1108-120、1108-240、1103、1103-240</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Trinity Biotech</td><td>キットの一部# 1108、1108-120、1108-240、1103、1103-240</td><td></td></tr><tr><td></td>封<td>入剤</td><td>Trinity Biotech</td><td>キットの一部</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td>キット#1108、1108-120、1108-240、1103、1103-240</td><td></td></tr><tr><td>ImmuGlo ANA HEp-2細胞12のよくスライドシールポーチに個別にシール</td><td></td><td>キット#1103、1103-240</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>研究で使用されたがキットでは提供されていない材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>診断用蛍光顕微鏡</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td></td><td>スポットディグノスティックカメラを装備、モデル 2.2.1</td></tr><tr><td>インキュベーションチャンバー</td><td>Trinity Biotech</td><td></td><td>顧客に提供(カタログなし #)</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>n/a</td><td></td><td>一般的な実験器具</td></tr><tr><td>ペーパータオル</td><td>n/a</td><td></td><td>一般ラボ用品</td></tr><tr><td>蒸留/脱イオン水</td><td>n/a</td><td></td><td>一般ラボ用品</td></tr></tbody></table>

抗と新規 hep 2 エリート/dfs70 ノックアウト基板アナ選考において混合 dfs70 パターンの同時の区別

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

全身の自己免疫の結合組織疾患は抗核抗体 (ANA) を循環させることにより特徴付けられます。スクリーニング アナは、いくつかの技術がありますが、優れた感度のためプライマリで推奨される方法のままひと上皮細胞 2 (HEp 2) 基板を用いた間接蛍光抗体 (IIF) です。HEp 2 基板は、多数の様々 なタンパク質や核酸自己抗原核と細胞の細胞質全体に分散する自己抗体の結合から生じるパターンを検出できます。抗とまた HEp 2 基板に対するポジティブな反応から生じる混合パターンの偉大な多様性では、解釈と報告の正確性を複雑にします。細心の注意を最近受け取った 1 つ具体的な例高密度微細斑点 70 (DFS70) パターンですレンズ由来上皮成長因子 (LEDGF) と呼ばれる蛋白質にとりわけ結合する自己抗体に起因。特定の全身性自己免疫疾患と健康的な集団での高い有病率に明確な関連付けの欠如重要な DFS70 パターンの正確な解釈をしました。従来の HEp 2 基板を用いた疾患関連のパターンから DFS70 パターンの正確な区別は困難です。また、均質、斑点、および混合均質な斑点パターンなどの疾患に関連するパターンと DFS70 パターンの共起関係を頻繁には、IIF 解釈を複雑にします。本稿の目的小説のユーティリティは同時に両方で高い信頼性と DFS70 パターンを区別するための能力を提供しながら従来の HEp 2 基板のすべての利点を保持する HEp 2 IIF 基板設計を示すことです。抗と混合のアナの肯定的な例。新しい基板は以前 DFS70 パターンによって隠された疾患関連アナ パターンのマスクを解除することができるさらに。

HEp 2 エリート/DFS70 KO 基板し古典的なアナのパターンを保持し DFS70 パターンの明確な区別が容易になります。
HEp 2 エリート/DFS70 島基板上従来と設計された細胞は、同一 LEDGF/p75 を除いてすべて自己抗原を維持します。キットによって提供される否定的な制御は、ベースラインの蛍光信号を確立します。HEp 2 エリートに均一、まだら、セントロメア、核小体およびミトコンドリアのパターンの肯定的なコントロールは、従来の IIF HEp 2 基板 (図 2 a) 上想定されるパターンと同じパターンを生成します。これらの参照パターンは、各パターンの抗原病協会とともに詳細に記載されている以前4,29。表 1に図 2 aで見られるパターンの簡単な説明があります。
HEp 2 エリート DFS70 パターン:
それぞれのセルの約 10% はよく高密度微細斑点パターンを示す (ICAP 名称を割り当てられる: AC 2)、核のクロマチン上で観察できるし、の分裂核 (図 2 b) を見る関連するクロマチン染色します。従来の HEp 2 基板のすべてのセルはこのパターン DFS70 肯定的なサンプルと反応があります。HEp 2 セルの残りの ~ 90% はノックアウト LEDGF 抗原をコードするpsip1遺伝子がある、したがって信号または抗 DFS70 陽性血清 (図 2 b) と反応のパターンは生成されません。HEp 2 細胞の 10% がある明るい蛍光 DFS70 パターンとセル現在追加パターン (例えば、細かい斑点または核小体) の残りの部分に対応する、混合パターンの存在を示します。このようなパターンを綿密に検討は DFS70 パターンだけでなく存在しているすべての自己抗体の特異性を確認するために不可欠です。HEp 2 エリート基板、血清サンプルで作成されたパネルの能力を実証するには、各種濃度の DFS70 および ANA 陽性血清を制御し、従来の両方でテストおよび HEp 2 エリート基板標準 IIF を使用するプロトコル (図 3、図 4、図 5、図 6、図 7)。
DFS70 抗と従来と HEp 2 エリート基板上に混合反応の解釈:
パターンごとに特定疾患関連アナ (図 3、図 4、図 5、図 6、図 7)、抗アナはほとんど列左のパターンおよび抗 DFS70 柄右側列観察することができます。途中で 3 つの列は、様々 な疾患関連の比率と DFS70 パターンのポジティブ コントロールを表します。結果として得られる混合パターンは従来の HEp 2 基板 (図 3図 4図 5図 6図 7の一番上の行) で識別し挑戦しています。しかし、サンプルのほとんどの小説の Hep 2 エリート基板変更されていないし、設計したセルの強度の違いは異なる (以下の明るい細胞に明るいの比がある場合だけではなく DFS70 自己抗体の存在を確認します。1:9) が、またセカンダリ アナ パターンを明らかにします。均質な DFS70 や斑点 DFS70 混合反応の場合、自信を持って追加の試金 (図 1 a) の数を実行することを選択 labs につながる正しいパターンを予測することはにくい。セントロメア DFS70 と核小体 DFS70 の場合混合の反応、DFS70 陽性は非常に挑戦的な疑い (図 5図 6) を実行します。DFS70 パターンは、核小体および細胞質網状/海部反応血清比 50% に達するまでない支配的です。すべての例で DFS70 パターンを提示することができます HEp 2 エリート基板と強度の広い範囲の基になるセカンダリ パターン レベルおよびこうしてより正確なアナの解釈が容易になります。
密接に混合パターン、アナとコントロールされ拡大 (図 8) 従来の HEp 2 エリート基板肯定的な DFS70 の様々 な 50: 50 の組み合わせの結果を観察。中間期および有糸分裂染色解釈と報告されたパターンの精度を向上する HEp 2 基板上への DFS70 を含むすべての ANA パターンを観察することをお勧めします。ただし、混合パターンの細胞核を分割によって提示された差分パターンは可能性があります正確な解釈を容易にするための十分なできません。赤い矢印 (図 8) は、従来、設計された細胞の分裂核を示します。それは、混合 DFS70 細胞分裂反応が準拠していない疾患関連の解釈のためのルールの設定と ANA パターン観察できます。黄色と青の矢印は変更されていないし、設計した (DFS70 島) HEp 2 細胞核をそれぞれ示します。同時上映ができます、同じ顕微鏡の視野の変更されていない細胞核染色 (~ 10%) と人工細胞核 (~ 90%) パターンの明確な強度の違いが観察されるすべての組み合わせは、(図 8) で、DFS70 パターンの確認。
<img alt="HEp-2、DFS70 IIF法を使用したANAスクリーニングアルゴリズム図。ELISA、診断のためのEIA。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図 1: 従来 HEp 2 と HEp 2 エリート/DFS70 島 IIF を使用してアルゴリズムをスクリーニング アナ。(A) 回路図解くスクリーニング段階 (黄色の斜線部分) で抗と混合 DFS70 肯定的なパターンを識別するに従来の HEp 2 IIF の欠乏と ANA パターンを使用する疾患に関連するセカンダリを排除できない可能性がありますDFS70 パターンによって隠されます。さらに、現在の世代の DFS70 特定の固相験試金は ANAs の追加テストにつながる抗 DFS70 陽性を確認することがないです。(B) 回路図 ANAs、抗と混合の DFS70 反応の同時の区別のスクリーニングのため HEp 2 エリートの機能を明らかにし、確認を試金する固相 DFS70 の必要性を排除すること。大幅 HEp 2 エリートを使用してアルゴリズムとスクリーニング アナを簡単確認試金の必要数が減る。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="HEp-2基板ANAパターン解析。顕微鏡検査、パターン同定、DFS70細胞比較" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図 2: 古典的なアナと DFS70 HEp 2 エリート/DFS70 島の基板パターン。(A) HEp 2 エリート/DFS70 島基板古典的なアナ パターンが保持されます。古典的な均一反応と DFS70 の肯定的な反応は、キットによって提供される肯定的なコントロールを使用して作り出されました。他の反応は、核小体および細胞質網状/海部反応5まだら、セントロメアの以前に確立された陽性コントロール血清を使用して作り出されました。(B) 基板の HEp 2 エリート/DFS70 島 DFS70 パターンの簡単な区別を容易にする従来設計の細胞を提供しています。その結果、DFS70 抗反応界面上のパターンを汚すと従来と設計 (DFS70-KO) 細胞の細胞核を分割回路図を示しています。設計の HEp 2 細胞は通常従来の HEp 2 基板上 DFS70 自己抗体反応によって隠されているセカンダリのパターンの同時検出を可能にする LEDGF/p75/DFS70 抗原を欠いています。矢印 (黄色) は、有糸分裂細胞核の例を示します。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="蛍光顕微鏡、細胞染色比較、HEP-2細胞、DFS70自己抗体検出。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図 3: DFS70 との組み合わせで均一な血清。DFS70 抗血清は様々 な比率 (正立単、試しました、50: 50、20: 80、および 0:100) の肯定的な均一パターン制御と併用され、従来と設計 (DFS70-KO) HEp 2 基板上でテストします。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Hep-2細胞蛍光顕微鏡検査;タンパク質の局在化;実験結果;細胞核;斑点模様。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図 4: DFS70 の組み合わせで血清を斑点と。DFS70 抗血清は様々 な比率 (正立単、試しました、50: 50、20: 80、および 0:100) の肯定的な斑点パターン制御と併用され、従来と設計 (DFS70-KO) HEp 2 基板上でテストします。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="免疫蛍光顕微鏡、HEP-2細胞、セントロメア対DFS70抗体染色、蛍光強度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図 5: DFS70 と動原体血清の組み合わせ。DFS 70 抗血清は様々 な比率 (正立単、試しました、50: 50、20: 80、および 0:100) の肯定的なセントロメア パターン制御と併用され、従来と設計 (DFS70-KO) HEp 2 基板上でテストします。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="核小体DF570染色によるHEP-2細胞の蛍光顕微鏡検査。実験と分析の結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 図 6: DFS70 との組み合わせで核小体血清。DFS 70 抗血清は様々 な比率 (正立単、試しました、50: 50、20: 80、および 0:100) の肯定的な核小体パターン制御と併用され、従来と設計 (DFS70-KO) HEp 2 基板上でテストします。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Hep-2細胞免疫蛍光、細胞質網状パターン、DFS70抗体、顕微鏡検査結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> 図 7: DFS70 との組み合わせで細胞質網状/海部血清。DFS70 抗血清は様々 な比率 (正立単、試しました、50: 50、20: 80、および 0:100) の肯定的なミトコンドリア パターン制御と併用され、従来と設計 (DFS70-KO) HEp 2 基板上でテストします。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="HEp-2細胞とDFS70-KO細胞の蛍光顕微鏡比較、核染色パターンの分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig8.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> 図 8: 混在パターン (50: 50 の比率) 従来の生産と HEp 2 エリート基板。2 枚の基板間の相違点を明らかにしました。赤い矢印は、両方の基板上に設計された従来の細胞の分裂核を示します。これらの組み合わせの従来の HEp 2 基板上の細胞核を割って提示差分パターンは混合パターンの正確な解釈のために十分ではありません。それは、細胞分裂の混合の DFS70 反応することができます摂動疾患関連の解釈のためのルールの設定 ANA パターン観察できます。黄色と青の矢印は変更されていないし、設計した (DFS70 島) HEp 2 細胞核をそれぞれ示します。すべての組み合わせの結果が設計された基板上テスト: 明確な強度差に属する間期核パターン (~ 10%) のセルをそのまま、設計の細胞 (~ 90%) を認めた有効に同時検出と DFS70 パターンの確認。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ANA パターン</td>
			<td colspan="2">説明</td>
		</tr>
<tr>
<td>均一</td>
			<td colspan="2">全体の核は、びまん性の染色パターンと均等に蛍光を発する。</td>
		</tr>
<tr>
<td>斑点</td>
			<td colspan="2">離散の斑点をもつ核全体で蛍光を発する。 微細な斑点と粗い斑点パターンが記載されています。</td>
		</tr>
<tr>
<td>核小体</td>
			<td colspan="2">核小体は核内で複数の固体または斑点のボディとして染色します。サブタイプは、以前に記載されています。</td>
		</tr>
<tr>
<td>セントロメア</td>
			<td colspan="2">有限数の大きな斑点。凝縮染色体細胞有糸分裂を経る反応性抗原を分離します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>細胞質網状/海部</td>
			<td colspan="2">細胞質とミトコンドリアの染色陽性顆粒が表示されます。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">DFS70</td>
			<td colspan="2">ありきたり HEp 2 細胞: 細胞分裂核で見られる染色間期核のクロマチン関連高密度微細斑点パターンが観察されます。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">•Engineered DFS70 島細胞: 抗 DFS70 抗体を作り出す否定的な汚損</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">HEp 2 エリート/約 1:9 比で従来と設計 (DFS70 島) セルには DFS70 島します。従来の細胞を作り出す典型的な DFS70 パターンと設計の細胞を作り出す負のパターン DFS70 抗/分離陽性反応と反応。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: ANA パターンの説明。

DFS70 抗体は、従来 HEp 2 基板を使用して、正確な解釈を挑戦的な共通の抗核抗体の病気に関連するパターンを模倣します。プロトコルでは、スクリーニングと抗と混合 ANA 陽性で高信頼の DFS70 パターンを区別するアナに従来 HEp 2 に新規設計された HEp 2 基の利点について説明します。

抗と新規 HEp 2 エリート/DFS70 ノックアウト基板アナ選考において混合 DFS70 パターンの同時の区別

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies ...

この手順の全体的な目標は、Novel HEp-2、高密度微細斑点70ノックアウト基質を使用して抗核自己抗体をスクリーニングし、同時に単一特異的および混合高密度微細斑点70パターンを確認する改良された間接免疫蛍光アッセイを実証することです。新規HEp-2基質は、臨床的に重要な抗核抗体(ANAとも呼ばれる)のスクリーニングに、標準的な間接免疫蛍光法と解釈基準を使用します。主な利点は、スクリーニングステップで、緻密な微細な斑点のある70パターンを、疾患に関連するパターン、均質な斑点のあるパターン、または困難な混合パターンと区別できることです。手順を実演するのは、品質管理研究所の技術者であるソフィア・バダニンです。基板スライドには、各スライドに12ウェルのガラススライドを使用し、従来のHEp-2細胞、または従来の高密度で微細な斑点のある70ノックアウトHEp-2細胞の混合物のいずれかを含みます。基板スライドを含むパウチを室温まで平衡化させて最適な性能を発揮し、サンプルを添加する前にスライド表面の水分の結露を防ぎます。これには 10 分から 15 分かかります。室温に平衡化したら、スライドとポーチの側面が接触しないように、指を使って基板スライドを慎重に取り出します。スライドにラベルを付け、サンプルとコンジュゲートのインキュベーション中にスライドが乾燥するのを防ぐために、湿らせたペーパータオルで裏打ちされたインキュベーションチャンバーに入れます。約50マイクロリットルのネガティブコントロールとポジティブコントロール、および希釈した患者血清を個々のスライドウェルに分注してから、スライドをインキュベーションチャンバーに入れます。ANA検査は、自己免疫疾患のスクリーニングの第一歩です。スライド上の患者サンプルのクロスコンタミネーションを回避することは、偽陽性または偽陰性の結果を最小限に抑えるために重要です。ウェルの相互汚染を防ぐために、ウェルを過剰に充填しないでください。インキュベーションチャンバーに蓋をし、スライドを室温で30分間インキュベートします。患者の血清中にANAが存在する場合、この間に各遺言に存在する細胞に結合します。インキュベーション期間が終了したら、スライドをインキュベーションチャンバーから取り出します。スライドをタブの端に保持し、再構成されたリン酸緩衝生理食塩水洗浄緩衝液の約10ミリリットルで10〜15秒間穏やかですすいでください。スライドをすぐにPBS洗浄バッファーを入れたCoplinジャーに移し、10分間浸します。残りのすべてのスライドでこのプロセスを繰り返します。Coplinジャーから一度に1つのスライドだけを取り出します。スライドから余分なPBS洗浄バッファーを取り除くには、ペーパータオルでスライドを軽くたたいて吸い取ります。各ウェルに、抗ヒトIgG蛍光コンジュゲートを標識したフルオレセインイソチオシアネートを1滴静かに塗布します。次に、スライドを密閉染色インキュベーションチャンバーで30分間インキュベートします。インキュベーション期間が終了したら、スライドをインキュベーションチャンバーから取り出します。スライドをタブの端に保持し、以前と同様に、約10ミリリットルのPBSウォッシュバッファーで穏やかですすいでください。スライドをすぐにPBS洗浄バッファーを入れたCoplinジャーに移し、10分間浸します。キットに付属のカバースリップを乾いたペーパータオルの上に置きます。カバースリップの下端に、封入剤を3〜4滴一列に塗布します。次に、洗浄バッファーが入ったCoplinジャーから一度に1枚のスライドを取り出します。余分なウォッシュバッファーを取り除くには、ペーパータオルのスライドを軽くたたいて拭きます。スライドに過剰な量の洗浄バッファーを残したり、カバースリップに過度の圧力をかけたり、気泡を導入したりしないでください。これらはすべて、細胞の形態、結果として生じる蛍光パターン、および反応の強度に影響を与える可能性があります。スライドの下端をカバースリップの端に合わせ、スライドをカバースリップにそっと下ろします。これにより、カバースリップ上に存在する封入剤がスライドの上端に流れ込み、各ウェルの読み取りを妨げる可能性のある気泡の形成を最小限に抑えることができます。暗室に設置されたフルオレセインイソチオシアネートフィルターセットを使用して、蛍光顕微鏡でスライドを表示します。顕微鏡下で特定の明るい緑色の蛍光についてサンプルを200倍以上の倍率で調べ、陽性とパターンに関する最終的な解釈を行います。ポジティブコントロールとネガティブコントロールを観察します。ポジティブコントロールは、核内で明るい緑色の蛍光を示します。ネガティブコントロールは、蛍光顕微鏡下で特定の緑色蛍光を示さない。各ウェルの陽性または陰性の結果を記録し、陽性ケースのANAパターンを含めます。HEp-2緻密で微細な斑点のある70ノックアウト基質は、すべての主要な核および細胞質パターンを保持します。密集した微細な斑点模様は、間期核全体に均一に分布した斑点状染色の存在と、有糸分裂期のクロマチンの存在によって特徴付けられます。密集した微細な斑点のある70抗原を発現する従来のHEp-2細胞と、抗原を欠く改変されたHEp-2細胞の両方が存在することで、従来のHEp-2基質のすべての利点を保持しつつ、高密度の微細な斑点のある70パターンの正確な鑑別が容易になります。主要な疾患に関連するANAパターンに対して陽性の血清を、密集した微細な斑点のある70パターン陽性の血清と等しい割合で混合し、従来のHEp-2とHEp-2の高密度の微細な斑点のある70ノックアウト基質の両方で試験しました。ここで、赤い矢印は有糸分裂期の細胞を示しています。黄色の矢印は従来のHEp-2原子核を示し、青色の矢印は操作されたHEp-2原子核を示しています。描かれた反応のすべての組み合わせについて、密集した微細な斑点のある70ノックアウト基質は、同じ視野上の未修飾細胞と改変細胞との間に明確な強度差を示しています。これは、単一特異的反応と混合された密集した微細な斑点のある70反応を区別するのに役立ちます。核抗原および細胞質抗原に対する自己抗体は、全身性自己免疫疾患で非常に一般的です。PSIP1タンパク質としても知られるDFS70に対する自己抗体に起因する密集した微細な斑点模様は、健康な集団で非常に一般的であると報告されています。さらに、これらのDFS70自己抗体は、単独でも、他の疾患関連ANAとも一緒に存在します。そのため、臨床検査室では、このパターンを他の疾患関連パターンと正確に区別することが重要になります。例えば、狼瘡に関連する均質な斑点パターンが混在していると、DFS70パターンと誤解される可能性があり、複数の確認アッセイが必要になります。HEp-2基質を用いた間接免疫蛍光法は、ANAのゴールドスタンダードなスクリーニング法と考えられています。ただし、精度は、技術者のスキル、個々のステップの慎重な実行、および結果として生じるパターンの正確な解釈に大きく依存します。一方、従来のHEp-2ノックアウト基板とDFS70ノックアウト基板の比較評価では、この新しい基板が、ANAのスクリーニングにおいてDFS70パターンを高い信頼性で識別する上で有用であることを示しています。モノポジティブおよび混合DFS70パターンのさらなる解釈は、この改良されたHEp-2基質を使用して比較的簡素化されました。新しい基質は、標準的な間接免疫蛍光プロトコルと、臨床的に関連するすべてのANAパターンに対して確立された解釈基準を使用しています。

simultaneous-distinction-monospecific-mixed-dfs70-patterns-during-ana

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶ 新規HEp-2 DFS70ノックアウト基板を用いた間接免疫蛍光法による抗核抗体スクリーニング。DFS70パターンと疾患関連パターンの同時区別により、自己免疫疾患診断の精度向上に貢献します。

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