ヘパリン StarPEG ナノコーティングと膵島の表面加工
2018年6月23日
このプロトコルを目指して、ナノコーティングのN-グループと膵島のアミン グループ間の擬似 bioorthogonal 化学を介してヘパリン含有 starPEG ナノコーティングを使用して膵島の表面加工細胞膜。
この方法は、免疫拒絶反応、移植後の膵島血行再建術、生存など、膵島移植における主要な課題を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、この採用しやすいアプローチにより、膵島の細胞景観を再形成することにより、生細胞の表面工学が可能になり、移植片の機能、生存率、そして最終的には膵島移植の治療効果が向上することです。この技術の意味は、細胞ベースの治療にも及ぶため、細胞ベースの治療結果は、細胞保持率の低下と生存率の低下によっても制限されます。
この手順を実演しているのが、私の研究室の大学院生であるJingyi Yangです。まず、6.9グラムのヘパリンを計量し、エッペンドルフチューブ内の2ミリリットルの氷冷脱イオン水に溶解します。0.23グラムのNHSを0.5ミリリットルの氷冷脱イオン水にエッペンドルフチューブで溶解します。
次に、0.77グラムのEDCを0.5ミリリットルの氷冷脱イオン水に50ミリリットルのコニカルチューブで溶解します。NHS溶液とEDC溶液を50ミリリットルの円錐管に混合します。混合溶液を室温で30分間放置した後、12, 000RPMで10分間遠心分離し、余分なEDCとNHSを除去します。
これに続いて、30ミリリットルの冷たいエタノールを溶液に加え、12, 000 RPMで10分間遠心分離します。次に、100ミリリットルの円錐管に10%starPEG MIエイドを50リットル加えます。次に、0.67ミリリットルの10%ヘパリンNHS溶液を同じ50ミリリットルのコニカルチューブに加えます。
混合溶液を摂氏25度のインキュベーターに20分間置くと、粘性のある透明な溶液が得られます。以前に抽出した200個のマウス膵島を解剖顕微鏡で選択し、1.5ミリリットルのチューブに移します。膵島に500マイクロリットルのPBSを追加し、摂氏4度で1分間、200 RPMで遠心分離します。
上清を取り除き、250マイクロリットルのヘパリンPEG溶液を加え、混合物を氷の上に10分間置きます。ピペットを上下に動かして、膵島がヘパリンPEG溶液とよく混ざるようにします。これに続いて、混合物を1, 200 RPMで1分間遠心分離します。
次に、上清を取り除き、500マイクロリットルのPBSを追加します。ピペットを上下に動かしてよく混ぜます。1, 200 RPMで1分間遠心分離した後、上清を取り除き、さらに使用するために膵島を保持します。
次に、コーティングされた島に10%FBSを添加したRPM I 1640の1〜2ミリリットルを追加します。そして、これらの島を帯電していない無菌細菌培養皿に移します。最後に、倒立蛍光顕微鏡でFAM-Heparin-PEG被覆した膵島の形態と蛍光シグナルを観察します。
HYDROXAL基に対応する特徴的なヘパリンピークは、ヘパリン-PEGナノコーティングFTIRスペクトルで観察されました。これらのピークの振幅の減少は、star-PEG MIエイドアミド基とヘパリン炭素基との間の結合を表しています。また、アミドカルボナル延伸振動に対応するピークも減少しており、ヘパリンカルボキシレート基とサシニミドールスキソネートとstar-PEG MIエイドアミンとの反応が十分であることが示されました。
走査型電子顕微鏡データは、ヘパリン-PEGナノコーティングの高度に相互接続された多孔質構造を示しており、in vivo送達中の細胞生存に適している可能性があることを示唆しています。緑色の蛍光で示されるナノコーティングの薄層は、コーティングされた膵島の表面全体に均一に堆積し、膵島の体積やサイズに明らかな変化を引き起こすことはありませんでした。ヘパリンPEG被覆マウス膵島は、培養において堅固な膵島生存率を示しました。
ヘパリンPEGでコーティングされた膵島と共培養した膵島内皮細胞から、より進行した血管形成が明らかであり、これは細長い微小血管様構造とネットワーク様脈管構造によって示されました。低レベルのインスリン分泌は、膵島に生理的塩溶液を投与し、低刺激レベルのグルコースを補充した場合、すべての治療群で観察されました。.膵島を超生理学的レベルのグルコースで刺激すると、インスリン分泌の増加が観察されました。
一度習得すると、コーティングは、膵島の生存率を維持するために適切に実行されれば、1分で行うことができます。
概要
このプロトコルは、ヘパリンを含むstarPEGナノコーティングを用いた膵島表面工学の方法を記述しています。この技術は、移植片の機能と生存を向上させることで、膵島移植の結果を改善することを目的としています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞ベースの治療法
- 移植生物学
- 表面工学
背景
- 膵島移植は、免疫拒絶反応や膵島の生存率の低さなどの課題に直面しています。
- 膵島の細胞環境を改善することで治療効果を高めることができます。
- ヘパリン-PEGナノコーティングはこれらの課題に対する潜在的な解決策を提供します。
- この方法は採用が容易で、迅速に実施できます。
研究目的
- 膵島の生存率と機能を向上させるコーティング技術を開発すること。
- 細胞ベースの治療法における細胞保持率の低さに関連する問題に対処すること。
- 膵島移植の結果を改善する上で、ヘパリン-PEGナノコーティングの有効性を示すこと。
使用された方法
- ヘパリンとNHS溶液の調製。
- ナノコーティング用のNHSとEDC溶液の混合。
- マウス膵島のヘパリン-PEG溶液によるコーティング。
- 蛍光顕微鏡下での膵島の形態と生存率の観察。
主要な結果
- ヘパリン-PEGでコーティングされた膵島は、培養中の生存率が向上しました。
- 共培養された膵島内皮細胞では血管形成が強化されました。
- コーティングされた膵島では、グルコース刺激にインスリン分泌が反応しました。
- コーティングは膵島の体積や大きさを大きく変えませんでした。
結論
- ヘパリン-PEGナノコーティングは、膵島移植を改善するための有望な方法です。
- この技術は細胞ベースの治療法の有効性を向上させる可能性があります。
- 今後の応用は、表面工学を必要とする他の細胞タイプにも拡張される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starPEG nanocoating addresses critical barriers in cell-based therapies, including immuno-rejection and poor graft survival. This platform enables functional modification of living cell surfaces, supporting improved transplantation outcomes and translational continuity. The approach offers a scalable, mild, and adaptable solution for enhancing cell viability and therapeutic efficacy in preclinical and discovery-stage R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune-modulatory strategies for cell-based therapy targets.
- Supports biological de-risking by preserving islet viability and function post-coating.
- Facilitates predictive confidence in cell survival and engraftment for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, surface-engineered islets for downstream functional assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of islet viability and insulin secretion.
- Enables reliable evaluation of immune protection and vascularization in screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for islet transplantation and immune response studies.
- Supports continuity from in vitro engineering to in vivo transplantation validation.
- Provides mechanistic de-risking for cell retention and survival in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanocoating method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting early-stage hypothesis testing and enabling robust preclinical validation of cell-based therapies.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing for immune evasion and graft survival mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantifiable outputs for islet viability and function.
- Analytics: Provides measurable readouts such as insulin secretion and vascularization metrics.
- Translational Research: Bridges in vitro engineering with in vivo transplantation studies for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various cell types and functional mediators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell survival and immune protection.
- Operational Value: Standardizes cell surface engineering with minimal impact on cell viability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions for cell therapy candidates and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, surface chemistry, and nanocoating techniques.
- Needs access to fluorescence microscopy and analytical instrumentation for validation.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in islet preparation and coating.
- Adaptable to different cell types and functional mediators as supported by platform design.
- Practical limitations include maintaining cell viability and ensuring uniform coating coverage.
