無傷のマウスの膵島のβ細胞のマイトジェンの持続的投与 ex vivoで生分解性ポリ（乳酸-co-グリコール酸）微小球を使用して

このプロトコルの全体的な目標は、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)またはPLGA、マイクロスフェアを使用して、培養された無傷の膵島に関心のある化合物を送達し、成体の膵臓ベータ細胞の増殖に対する個々の化合物の影響を研究することです。この方法は、無傷の島に持続放出法で局所的に送達されるさまざまな化合物を試験するために使用できます。この方法の主な利点は、代替の送達バイオマテリアル、目的の化合物、およびエンドポイントアッセイに容易に適応できることです。

この方法は、in vivoで採用された膵島の移動と関連して目的の化合物を送達する可能性も有しています。PLGAマイクロシュペールの作り方を実演するのは、私の研究室の大学院生であるTaylor Kavanaughです。まず、蛍光標識された目的の化合物1ミリグラムを100マイクロリットルの脱イオン水に加えて、最初の水相を形成します。

次に、シンチレーションバイアル中の750マイクロリットルのジクロロメタンに65ミリグラムのPLGAを溶解し、混合物を160ワットで10〜30秒間超音波処理してPLGAを完全に溶解します。これにより、油相が形成されます。最初の水相をすべて油相に滴下します。

次に、ハンドヘルドホモジナイザーを使用して、溶液を 20, 000 rpm で 30 秒間乳化し、最初の水 - 油相を形成します。次に、最初の水 - 油相のすべてを15ミリリットルの1%PVA溶液に滴下し、示したように乳化します。次に、エマルジョンの全容積を200ミリリットルの丸底フラスコに移し、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去し、水銀真空635ミリメートルで水相を1時間生成します。

1ミリリットルの水相を14本のマイクロ遠心チューブのそれぞれに分注し、遠心分離によりマイクロスフェアをペレット化します。スピンの終わりに、マイクロピペットを使用して、ペレットを乱さないように注意しながら、各チューブから900マイクロリットルの水溶液を取り出します。マイクロスフィアを1ミリリットルの脱イオン水で洗浄し、続いて900マイクロリットルの上清を慎重に除去します。

次に、上清の残りの100マイクロリットルに900マイクロリットルの脱イオン水を追加します。次に、短時間ボルテックスして超音波処理し、ペレットを再懸濁します。目的の実験動物から膵島を単離した後、200マイクロリットルの膵島培養培地中の96ウェル組織培養プレートの1つのウェルに、視覚的にサイズが一致した40の膵島を播種します。

翌朝、チューブ内の対象化合物の最終濃度が1マイクロリットルあたり10ナノグラムになるように、マイクロスフェアの1アリコートをプレアッセイ培地に再懸濁し、氷水浴で160ワット、摂氏4度で10秒間の長いパルスでマイクロスフェアを超音波処理します。次に、100マイクロリットルの膵島培養培地を各ウェルから慎重に取り除き、アッセイ培地を含む100マイクロリットルのマイクロスフェアと培養物をインキュベートします。3日後、膵島を乱さずにすべてのウェルからアッセイ培地を慎重に廃棄し、200マイクロリットルのPBSで膵島を2回穏やかに洗浄します。

膵島は96ウェルプレートに緩く接着するだけです。したがって、膵島が誤って外れて廃棄されないように、培地とPBSを各ウェルから穏やかに除去することが重要です。2回目の洗浄後、膵島を室温で3分間100マイクロリットルのトリプシンEDTA溶液に静かに浸し、2分後には穏やかにピペッティングします。

各ウェルの全容量を個々の微量遠心チューブに移し、各チューブに400マイクロリットルの膵島培養培地を追加して解離を停止します。遠心分離によってマイクロスフェア処理された膵島を収集した後、マイクロピペットを使用して上清を穏やかに除去し、ペレットを200マイクロリットルの新鮮な膵島培養培地に再懸濁します。次に、解離した膵島を細胞遠心分離機上の帯電した顕微鏡スライド上に回転させます。

風乾後、疎水性のマーキングペンで膵島の周りに箱を描き、細胞を75マイクロリットルの4パーセントパラホルムアルデヒドに室温で10分間固定し、続いて75マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。2回目のウォッチの後、PBS中の75マイクロリットルの0.2%Triton X-100で細胞を10分間透過化し、続いて75マイクロリットルのPBSのみで最終洗浄します。膵島を免疫標識するには、まずスライドの細胞側を上にして湿ったチャンバーに置き、PBSを取り除きます。

次に、室温で75マイクロリットルの正常なロバ血清で非特異的結合をブロックします。1時間後、血清を目的の一次抗体75マイクロリットルと室温でさらに1時間交換します。インキュベーションの最後に、一次抗体溶液を慎重に吸引し、375 μLのPBS洗浄液でサンプルを洗浄します。

次に、適切な免疫蛍光タグ付き二次抗体75マイクロリットルと膵島をインキュベートし、室温で光から保護した状態で1時間インキュベーションします。インキュベーションの終了時に、二次抗体溶液を75マイクロリットルのDappyと3分間交換し、続いて脱イオン水で5分間すすぎます。洗浄の最後に、退色防止剤を含む100マイクロリットルの速乾性埋込液をガラスカバースリップに見つけ、サンプルを下にして顕微鏡スライドを1つ反転させて埋込液に転倒させます。

ミクロスフェアの最大の割合は直径が1〜10ミクロンですが、一部のマイクロスフェアはそれより大きくなる場合があります。無傷のPLGAマイクロスフェア処理された膵島の分散とその後の免疫標識後、洗浄ステップ中に完全に除去されていない無傷のマイクロスフェアによって引き起こされる、細胞間の標識がないサンプルの領域が観察されるのが一般的です。イメージング後、Ki67インスリン陽性細胞の割合は、ソフトウェア画像解析を使用するか、標識細胞の総数を手動でカウントすることにより定量化できます。

無傷の膵島を組換えヒト結合組織成長因子PLGAマイクロスフェアで3日間処理すると、ベータ細胞の増殖が増加し、タンパク質がマイクロスフェアの生成中に機能を失わないことが実証されました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、1週間未満で結果を得ることができます。この手順を試行する際、実験におけるベータ細胞増殖への影響は、目的の化合物と生成されたマイクロスフェアの正確な放出速度によって異なることを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、化合物を充填したマイクロスフェアと無傷の膵島との共移植などの他の方法を実行して、目的の化合物がin vivoでβ細胞増殖を誘導できるなどの他の問題に対処することができます。PLGAは、FDAによって承認されたデバイスや薬物送達システムで使用されてきた歴史があるため、長期間にわたって治療用貨物を損傷した組織に送達したいと考えている研究者や臨床医にとって良い選択肢です。このビデオを見れば、化合物を充填したPLGAマイクロスフェアを作製し、それらを培養した無傷の島に投与する方法を十分に理解できるはずです。

パラホルムアルデヒドの取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、適切な個人用保護具を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。