無傷のマウスの膵島のβ細胞のマイトジェンの持続的投与

本プロトコルの全体的な目的は、ポリ乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）マイクロスフィアを用いて、培養された無傷の膵島に目的化合物を送達し、個々の化合物が成人の膵β細胞増殖に及ぼす影響を調べることです。この手法を用いることで、無傷の膵島に対して局所的に徐放形式で送達されるさまざまな化合物の試験が可能になります。本手法の主な利点は、代替の送達用バイオマテリアル、目的化合物、およびエンドポイントアッセイに容易に適応させることができる点にあります。

この手法は、生体内でのアイレット移植に合わせて、目的化合物を同時に送達できる可能性も秘めています。PLGAマイクロスフェアの作製方法については、私の研究室の大学院生であるTaylor Kavanaughが実演します。まず、1 mgの蛍光標識した目的化合物を100 µLの脱イオン水に加え、最初の水相を形成させることから始めてください。

次に、シンチレーションバイアル内で65 mgのPLGAを750 µLのジクロロメタンに溶解させ、160 Wで10～30秒間超音波処理してPLGAを完全に溶解させます。これにより油相が形成されます。ここに、1つ目の水相のすべてを滴下して加えます。

次に、ハンドホモジナイザーを使用して、溶液を20,000 rpmで30秒間乳化させ、一次水油相を形成します。その後、この一次水油相のすべてを1%PVA溶液15 millilitersに滴下し、先ほどと同様に乳化させます。次に、エマルションの全量を200 milliliterの丸底フラスコに移し、ロータリーエバポレーターを用いて、635 millimeters of mercuryの真空下で1時間溶媒を除去し、水相を生成します。

水相を1 mLずつ14本のマイクロ遠心チューブに分注し、遠心分離によってマイクロスフェアをペレット化します。遠心終了後、ペレットを乱さないように注意しながら、マイクロピペットを用いて各チューブから900 µLの水溶液を除去します。マイクロスフェアを1 mLの脱イオン水で洗浄し、続いて上清を900 µL慎重に除去します。

次に、残りの100 µLの上清に900 µLの脱イオン水を加えます。その後、短時間ボルテックスし、超音波処理を行ってペレットを再懸濁させます。目的の実験動物から膵島を単離した後、視覚的に大きさが揃った40個の膵島を、200 µLの膵島培養液とともに96ウェル組織培養プレートの1ウェルに播種します。

翌朝、マイクロスフィアの1アリコートをプレアッセイ培地で再懸濁し、チューブ内の目的化合物の最終濃度が10 nanograms per microliterになるようにします。その後、マイクロスフィアを氷水浴中で、160 watts、パルス幅10秒の条件で10分間、4 degrees Celsiusで超音波処理します。次に、各ウェルからアイレットを剥がさないように注意して100 microlitersのアイレット培養培地を除去し、マイクロスフィアを含むアッセイ培地100 microlitersを加えて培養します。3日後、すべてのウェルからアイレットを乱さないように注意してアッセイ培地を廃棄し、200 microlitersのPBSでアイレットを2回静かに洗浄します。

膵島は96ウェルプレートに緩くしか付着していません。そのため、膵島を誤って剥離させて廃棄しないよう、各ウェルから培地およびPBSを慎重に除去することが極めて重要です。2回目の洗浄後、100 µLのtrypsin EDTA溶液に膵島を静かに浸し、室温で3分間置きます。その際、2分経過した時点で穏やかにピペッティングを行ってください。

各ウェルの全量を個別のマイクロ遠心チューブに移し、400 µLの膵島培養液を加えて解離を停止させます。遠心分離によってマイクロスフィア処理後の膵島を回収した後、マイクロピペットを使用して上清をそっと取り除き、ペレットを200 µLの新鮮な膵島培養液で再懸濁します。その後、サイトスピン遠心機を用いて、解離させた膵島を帯電スライドグラス上に遠心回収します。

自然乾燥させた後、疎水性マーキングペンで島細胞の周囲を囲み、室温で 4% パラホルムアルデヒド 75 µL を用いて 10 分間細胞を固定し、続いて 75 µL の PBS で 2 回洗浄します。2 回目の洗浄後、PBS 含有 0.2% Triton X-100 75 µL で 10 分間細胞を透過処理し、最後に PBS 単独 75 µL で洗浄します。島細胞を免疫ラベルするために、まずスライドを細胞面を上にして加湿チャンバーに置き、PBS を除去します。

次に、75 µLのノーマルドンキーセラムを用いて、室温で非特異的結合をブロックします。1時間後、セラムを75 µLの目的の一次抗体に交換し、室温でさらに1時間置きます。インキュベーション終了後、一次抗体溶液を慎重に吸引し、375 µLのPBSでサンプルを洗浄します。

次に、適切な免疫蛍光標識二次抗体 75 µL を加え、室温・遮光条件下で1時間インキュベートします。インキュベーション後、二次抗体溶液を Dappy 75 µL に置換して3分間静置し、続いて脱イオン水で5分間洗浄します。洗浄後、脱色防止剤を含む速乾性封入剤 100 µL をガラスカバースリップに滴下し、顕微鏡スライドをサンプル側が下になるように反転させ、封入剤の上に載せます。

マイクロスフィアの大部分は直径1-10 µmになりますが、一部のマイクロスフィアはより大きい場合があります。PLGAマイクロスフィア処理を施した島細胞を分散させた後、免疫標識を行うと、洗浄ステップで完全に除去されなかった無傷のマイクロスフィアにより、細胞間に標識のない領域が観察されることが一般的です。イメージング後、Ki67およびインスリン陽性細胞の割合は、ソフトウェアによる画像解析、または標識された細胞の総数を手動でカウントすることで定量化できます。

前述のように、無処置の膵島をリコンビナントヒト結合組織成長因子含有PLGAマイクロスフェアで3日間処理すると、β細胞の増殖が促進されます。これは、マイクロスフェアの作製過程でタンパク質がその機能を失っていないことを示しています。この手法を習得し、適切に実施すれば、1週間足らずで結果を得ることが可能です。本手順を試みる際は、実験におけるβ細胞増殖への影響が、対象となる化合物や作製されたマイクロスフェアの正確な放出速度論によって異なることに留意することが重要です。

本手順に続き、化合物含有マイクロスフェアと無傷の膵島を共移植するなど、他の方法を用いることで、目的の化合物がin vivoでβ細胞の増殖を誘導できるかといった別の課題に取り組むことが可能です。PLGAはFDAによって承認されたデバイスや薬物輸送システムでの使用実績があるため、特定の組織に治療用貨物を長期間にわたって届けることを目的とする研究者や臨床医にとって優れた選択肢となります。このビデオを視聴することで、化合物含有PLGAマイクロスフェアの作製方法および、それらを培養した無傷の膵島に投与する方法について十分に理解できるはずです。

パラホルムアルデヒドの取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施中は、適切な個人用保護具の着用などの予防策を常に講じる必要があることに注意してください。