パラフィン セクションの埋め込み膵島

この方法は、科学者が膵島を生産的に最大限に活用し、天然の組織構造における各サンプルの複数の結果を評価するのに役立ちます。この新しい埋め込み方法の主な利点は、膵島が明確に定義された領域に均等に分布し、多くの膵島を断面の平面に配置し、この低存在量の材料からの実験収率を最適化することです。その手順を実演するのは、私の研究室の研究員であるYahui Kong博士です。

この手順を開始するには、結合力の低いp200ピペットチップと実体顕微鏡で校正されたグリッドを使用して、250の小島相当を手作業で選択します。それらを各1.5ミリリットルの低結合マイクロチューブに移します。膵島をマイクロフュージチューブの底に落ち着かせます。

次に、新しいp200チップ付きのピペットを使用して、上清の大部分を慎重に取り除きます。膵島を取り除かないように注意してください。PBSを1ミリリットル加え、スイングバケット遠心分離機で速度が重力の200倍に達するまで遠心分離し、その後スピンを停止します。

上清を取り除きます。このPBS洗浄プロセス全体を合計2回の洗浄サイクルで繰り返します。次に、500マイクロリットルの10%ホルマリン溶液または4%の新しくできたパラホルムアルデヒドを追加します。

サンプルを室温で30分間固定します。この後、p200チップ付きのピペットを使用して固定剤を取り除きます。PBSを1ミリリットル加え、速度が重力200度に達するまで遠心分離し、その後スピンを停止します。

上清を取り除き、PBS洗浄プロセス全体をもう一度繰り返し、合計2回の洗浄サイクルを行います。テキストプロトコルに概説されているように、1.5ミリリットルの微量遠心チューブで目的のゲルを調製します。次に、これらの微量遠心チューブを摂氏70度のヒートブロックに入れてゲルを温めます。

カットしたマイクロピペットチップを使用して、サンプルあたり10マイクロリットルのアガロースブルービーズをきれいな1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。ビーズにPBSを1ミリリットル加え、重力800倍で1分間遠心分離します。PBSを取り外し、この洗浄をもう一度繰り返します。

2回目の洗浄後、ビーズを適切な量のPBSに再懸濁します。速度が重力の200倍に達するまで膵島を含むチューブを遠心分離し、その後スピンを停止します。上澄み液の大部分を取り除きます。

ハサミを使用して、各サンプルの10マイクロピペットチップ1つの端を切り取ります。各サンプルのきれいなカットオフチップを使用して、各小島チューブに10マイクロリットルのビーズを追加します。次に、速度が重力の200倍に達するまで遠心分離します。

この後、200マイクロリットルのノーカットと10マイクロリットルのチップを使用して、できるだけ多くのPBSを取り除きます。サンプル識別のために顕微鏡スライドにラベルを付け、温めたゲルと一緒にヒートブロックの近くのベンチに置きます。ハサミを使用して、サンプルごとに数本の低結合マイクロピペットチップの端を切り取ります。

先端をカットしたマイクロピペットを使用して、膵島とビーズの入ったチューブに温かいジェルを加えます。泡が入らないようにしながら、すぐに混ぜてください。この混合物をスライドに適用し、スライドの端近くにディスクを形成し、外側のゲルリング用のスペースを残します。

次に、スライドを数回軽くたたいて、小島とビーズを落ち着かせます。20マイクロリットルの温かいゲルをサンプルチューブに加え、新しいゲルを残りの膵島やビーズと混合します。この混合物を元のディスクを囲む同じスライドに適用します。

必要に応じて、ディスクが目的のサイズと厚さになるまで、アプリケーションごとに新しいプレカットチップを使用して繰り返します。各ディスクを個別に準備し、両側に複数のディスクを配置する場合はサンプルの順序を追跡してください。次に、スライドを濡れた氷の平らな面に置き、覆います。

スライドを10分間、またはゲルが固まるまで休ませます。次に、スライドを取り外し、各スライドの裏側を必ず乾かします。各サンプルの生検処理および包埋組織カセットを標識します。

かみそりの刃の鈍いエッジを使用して、ディスクを各方向からそっと押して、ディスクをガラスから解放します。滑りやすい場合は、ディスクをゆっくりとスライドから押し出し、平らな面を下にして用紙に直接置きます。スライドガラスから紙にスライドさせる際に、個別のディスクを無傷に保つのは難しい場合があります。

ディスクにしわが発生した場合は、ディスクを元の位置に戻すのを待ち、さらにゲルを追加して、スライドを再度ゲル化します。紙をディスクの周りに折りたたんで、動かないようにします。これをカセットに移し、カセットを閉じます。

PBSを充填したビーカーにカセットを浸します。この研究では、改質ゲルディスクベースの包埋法を使用して、セクションごとに高収率の膵島を効率的に生成します。げっ歯類の膵島の形態は、滑らかな丸みを帯びた表面とコンパクトな球形を示す膵島培地での分離後の回収後、著しく無傷です。

ヒトの膵島の形態が類似しているという事実は、到着日に埋め込まれているか、出荷後の一晩で回復した後であるかにかかわらず、出荷前に膵島が隔離ストレスから回復しているためである可能性があります。これに対し、古いマイクロチューブ技術によって得られたパラフィン切片は、組織断面積が小さく、切片あたりの膵島が少なく、膵島とビーズが密集していることが分かります。ここに示すように、この技術は、組織学的および免疫蛍光染色のための高品質の膵島切片を生成することができます。

インスリンとグルカゴンの染色は、膵島の構造の多様な組成と不均一性を示し、ヒト、マウス、およびラットの膵島の間の既知のアーキテクチャの違いを示しています。これらの画像は、同じ島のシリアル セクションも表しています。この手法が、同じ島から複数のセクションを取得できることを実証しています。

この技術を習得すると、マイクロ遠心分離技術よりも時間を節約できます。ディスクをチューブ内ではなく平らな面に形成すると、ディスクを物理的にカセットに移して処理しやすくなります。この方法は、膵島の生物学に関する洞察を提供することができますが、切片化が困難な他の細胞ブロックや砕けやすい組織にも適用できます。

この手順を試みるときは、少量のゲルを使用して組織を小さな領域に集中させ、平らな面にディスクを形成することを忘れないでください。また、組織の収量を向上させるためには、低結合の微量遠心チューブとピペットチップを使用することも重要です。この技術は、膵島生物学の分野の研究者が、培養された全膵島における細胞タイプの組成と不均一性、細胞間相互作用、および遺伝子調節を本来のアーキテクチャで探求する道を開きます。

1つの実験条件から多くの島を含む10以上のセクションを生成する機能により、同じ材料での複数の結果を定量化でき、実験効率が向上します。この手法を限られた存在量の組織サンプルに適用することで、他の分野にもメリットがもたらされる可能性があります。この手順の要素は、ユーザーのニーズに合わせて変更する必要がある場合があります。

固定強度と分割を最適化する必要があります。この手法を使用して、より厚いディスクまたはより大きなディスクを生成できます。埋め込みの単純な処理手順を狭め、最適化する必要があるかもしれません。

このビデオを見た後、培養膵島全体のパラフィン切片用の高品質のアガロース細胞ブロックを生成する方法を十分に理解しているはずです。