3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

この手順の全体的な目標は、協同性などの相関相互作用に焦点を当てて、複雑なタンパク質システムのダイナミクスを定量的に研究することです。この方法は、タンパク質複合体とその動的相互作用が中心的な重要性を持つ定量的生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、動的多色単一分子FRETを生物学的に関連性のあるシステムに適用できることです。

フローチャンバーを組み立てる前に、厚さ40ミクロンの透明接着剤フィルムに流路を切り取り、フィルムの非接着面にクイック固定接着剤をスプレーし、接着剤を乾燥させます。フローチャンバーの組み立てを開始するには、厚さ3ミリメートルのPEG、ビオチンPEG、注入口と出口の穴を備えた溶融石英スライドを取得します。天井フィルムのスプレー接着剤コーティング面をスライドの機能化された面に塗布し、チャネルを入口と出口のフックに揃えます。

ホットプレートの上でスライドを80°Cに1分間加熱します。追加の顕微鏡スライドを使用してフィルムをスライドに30秒間押し付け、圧力を均等に分散させます。その後、アセンブリを1分間冷まします。

接着剤を覆っている保護シートをはがします。露出した接着剤の上にカバースリップを置き、フローチャンバーを形成します。チャンバーを摂氏80度に1分間加熱します。

カバースリップを接着剤に30秒間押し付けてチャンバーを密閉し、組み立てたチャンバーを冷まします。プリズム面にグリセロールを一滴塗布してから、フローチャンバーをプリズムの上に置きます。フローチャンバーをホルダーに取り付けて、マルチカラープリズムタイプのTIRF顕微鏡に取り付けます。

終了したら、インレットチューブとアウトレットチューブを接続します。3色測定用の機器の構成を開始するには、電子増倍CCDカメラソフトウェアを開き、EMCCDセンサーを可能な限り低い温度に設定します。カメラの垂直シフト速度を 3.3 マイクロ秒に設定し、通常の垂直クロック電圧を選択し、水平読み取り速度を 16 ビットで 17 ミリヘルツに設定し、事前増幅ゲインを 3 に、電子増倍管ゲイン レベルを 1000 に設定します。

外部集録トリガを選択します。露出時間を 70 ミリ秒に設定します。そして、動画撮影時間は750回まで

測定ファイル用の新しいフォルダを作成します。EMCCDソフトウェアで自動保存を有効にし、ムービーフレームのファイル形式をTIFFに設定します。自動保存ファイルのパスを新しく作成したフォルダに設定します。

次に、音響光学チューナブルフィルターを制御するソフトウェア、レーザー制御ソフトウェア、およびレーザーAOTF、光学シャッター、およびカメラを同期するトリガーソフトウェアを開きます。AOTFを使用して、プリズムに入る前にレーザー出力を約3ミリワットに調整します。交互レーザー励起のすべてのデバイスを同期するトリガーパターンをロードし、サンプルホルダーを装置に取り付けます。

インレットチューブの端を、実験バッファーが入ったマイクロ遠心チューブに入れます。出口チューブを引き出しモードに設定されたシリンジポンプに接続します。チャンバーを150マイクロリットルのバッファーで洗い流します。

CCDカメラを機能化されたインターフェースに焦点を合わせ、励起ビームと漂白蛍光汚染物質を整列させます。次に、脱グリコシル化アビジンとバッファーの0.25ミリグラム/ミリリットルの溶液を300マイクロリットルをチャンバーに流し、1分間インキュベートします。未結合の脱グリコシル化アビジンをチャンバーからバッファーで洗い流します。

次に、BSA濃度が0.5ミリグラム/ミリリットルの300マイクロリットルのバッファーをチャンバー内に流し、表面の機能化欠陥をブロックします。次に、十分な表面密度が得られるまで、BSA含有バッファー中のBSA含有緩衝液に150マイクロリットルのビオチン化蛍光標識Hsp90をフローチャンバーにロードします。チャンバーから未結合のタンパク質を300マイクロリットルのBSA含有緩衝液で洗浄します。

標識AMP-PMPおよびBSA含有緩衝液の25ナノモル溶液150マイクロリットルをチャンバーにロードし、5分間インキュベートします。ローディングとインキュベーションを一度繰り返します。次に、ピエゾステッパーを使用してサンプルチャンバーを励起ビームに対して垂直に動かし、必要に応じて視野を変更します。

必要に応じて画像のピントを調整します。図のように信号を取るボタンをクリックして、カメラソフトウェアでカメラの録画を開始します。トリガーソフトウェアで励起集集サイクルを開始し、データ集録を開始します。

データ解析を開始するには、解析ソフトウェアを開き、2台のカメラの録画動画をインポートします。「トレースの検索」をクリックして、潜在的な単一分子に対応する蛍光強度トレースを決定します。分子ごとに、同じ励起色でそのスポットのすべての微量の合計を計算します。

ジョイントの生強度のほぼ平坦なプラトーと、すべての励起色に対する単一の漂白ステップについて、すべてのチャンネルの強度プロファイルを評価します。適切な検出チャネルで反相関挙動を確認し、トレース中に赤色蛍光が発生していないか探します。すべての基準が満たされている場合は、さらなる分析のために蛍光トレースを保存します。

この例では、示された分子のみが基準を満たします。フラットなプラトーを持たないトレース、反相関ではなく点滅するイベントを示すトレース、または複数の漂白ステップがあるトレースを除外します。トレース選択は、すべての単一分子技術において重要なステップです。

明確に定義された基準を満たすトレースのみを選択する必要があります。ここで、これらの基準は、反相関、単一漂白ステップ、およびフラットプラトーです。次に、保存された分子を次々と表示し、1セットの強度トレースで、すべてのフロアフォーがすでに漂白されている時間間隔を選択します。

この時間間隔のビームバックグラウンド強度を計算し、Hsp90上の両方の色素が存在するFRET効率範囲を選択し、点滅イベントのあるトレースを確実に除外します。部分蛍光トレースを計算します。トレース内のS/N比が低い分子を除外します。

次に、部分蛍光データのバインド 2D 投影を生成し、相対母集団計算ツールを開始します。[初期化] をクリックします。対象のピークの周囲にポリゴンを描画します。

そして、カウントをクリックして、そのピークの相対的な母集団を計算します。部分蛍光データの3Dヒストグラムを生成し、ヒストグラムを正規化します。3D ガウス近似の初期パラメーターを超過し、パラメーター ベクトルの末尾に状態母集団を追加します。

データを適合させ、結果を表示します。3D部分蛍光空間の各状態の位置と幅を定義した後、Hidden Markov Modelインターフェースを初期化します。適切なステート数、入力信号の次元数、および入力タイプを選択します。

HMM パラメーターを最適化して、遷移確率の最尤推定量を決定します。データサブセットの母集団選択、フィッティング、HMM 最適化を繰り返します。最後に、遷移確率の信頼区間を計算し、コンフォメーション状態を折りたたむことで、データを簡略化してさらに分析します。

Hsp90タンパク質の立体配座状態を、標識されたレポーターヌクレオチドAMP-PMPの存在下で3色の単一分子FRETを用いて研究しました。5つのコンフォメーション状態は蛍光強度によって区別でき、そのうち4つの状態は機能的に区別されました。3色の単一分子FRETは、3D空間にまたがる部分的な蛍光データをもたらしました。

実験条件下で理論的に予想されるすべての状態は、2D投影法での部分的な蛍光によって区別できるため、2D投影法は状態を分離するために使用されました。これらの状態の相対母集団は 2D 投影法から決定され、3D ガウス近似の制約として使用されました。その後のアンサンブル3D HMMの最適化とモデリングにより、抽出された状態遷移の確率が得られました。

信頼区間は、抽出された各率定数について計算しました。さらに250マイクロモルの非標識AMP-PMPの存在下で実験を繰り返すと、Hsp90ダイマーの2番目の結合部位に対する1つのヌクレオチドの結合の影響が解明されました。結合した立体配座と非結合立体配座を折りたたむことで、追加の標識されていないAMP-PMPの存在下と非標識のAMP-PMPの存在下で、Hsp90からの蛍光AMP-PMP解離の平均滞留時間を計算することができました。

このビデオを見れば、マルチカラーFRETとTIRF顕微鏡を使用して動的タンパク質システムから速度論情報を抽出する方法について十分に理解できるはずです。この手法は、ライフサイエンスの研究者がマルチタンパク質システムにおける相関相互作用を決定するための道を開きます。これは、協力性などの基本的な制御メカニズムをより深く理解するために重要です。