Name: 3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学ぶ3色1分子FRETを用いたタンパク質相互作用の相関関係と協同性の定量的解析法。Hsp90ダイマーの動態とAMP-PMP結合状態の遷移確率を3Dアンサンブル隠れマルコフモデルで解析し、複雑なタンパク質系の運動学的情報を抽出する。

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この作品は、ドイツ研究振興協会 (INST 39/969-1) し ERC 助成契約 n. 681891 を通じて欧州研究評議会によって資金を供給します。

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<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+pH+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
<li>Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Ylänne, J., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+force+sensing+of+filamin+revealed+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).</li>
<li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp012016x">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li>
<li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zero-mode+waveguides+for+single-molecule+analysis+at+high+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations.</a> Science. 299 (5607), 682-686 (2003).</li>
<li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

複雑なタンパク質系のこれらの測定値の分析の手順を追って説明 3色 smFRET データを取得する実験を紹介します。このアプローチでは、直接複数の相互作用部位や構造変化との相関を評価するユニークな可能性を提供しています。
タンパク質の適切なマルチカラー分子データを得るために低ノイズ レベルで再現可能な測定を行うことが重要です。これは、フロー商工会議所9効率的かつ信頼性の高い表面不活性化プロトコルを使用して実現できます。表面に固定化された分子の十分な密度は分子記録映画あたりの収量を高めるために使わなければなりません。これは、光の単一分子からの蛍光が記録されたイメージのピクセルの約 5-10% に当たるべきことを意味します。同時にオーバー ロードしないようにする、隣接する分子の重複になりますので。ラベルの付いた種がソリューションで無料 (AMP-PNP * 提示における)、濃度が低く、短い波長をもつレーザーから直接励起による測定に干渉されていないかどうかを確認 (すなわち、通常、マイクロモル以下も濃度)。また、これらの化合...

多くの蛋白質は、動的錯体の構造変化と幅広い時間スケール1,2,3の一時的な連合を介した他の分子とその機能を発揮します。外部のエネルギー源 (例えばATP) これらの動的相互作用することができます機能サイクルの方向性につながる、最終的に生活のための前提条件のセルに非平衡定常状態を維持する結合。
これらの分子機械を完全に理解するためには、静的な記述の構造研究に導かれては十分ではありません。さらに、基になる運動モデルの知識を持って運動速度定数を決定するために不可欠です。いくつかの既存の方法許可バイナリ相互関心、表面プラズモン共鳴など、(例えば、ジャンプまたはストップト フロー分光読み出しと緩和法の 2 つの分子のダイナミクスを研究する研究者テクニック) と核磁気共鳴。ただし、適用性は、(例えば、 1 つのバインドとバインドされていない状態) の単純な 2 状態系平均一括実験に固有のために制限されてほとんどの場合です。以上の国または中間体が関与している場合、彼らは唯一速度定数の複雑な混合物をもたらします。単一分子光ピンセットや磁気ピンセットや 2 色 smFRET、つまり1 ドナー表面固定化したサンプルを 1 つの受容体 fluorophore など方法は、立体配座の変化すべての速度定数を回復できます。しかしときに、1 つ以上の結合部位に影響を与える相互作用は、これらの方法が限られている残る、2 つ (またはそれ以上) の可能な相関相互作用についてのみ、一連の実験から結論は間接を通じてアクセスできます。
マルチカラー smFRET4,5,6,7,8,9は、リアルタイムで直接、下のこれらのコンポーネント間の相互作用を研究する機会を提供しています近く生理的条件10。これにより、たとえば、リガンドまたは別タンパク質8,9,11のコンホメーション依存的結合を調査する 1 つ。ここで示した全体的なアプローチは、測定チャンバーの表面にタンパク質を付けると時間をかけて (の詳細についてを参照してください9プリズム型観察上の蛍光強度を追跡するための特定の位置で興味のタンパク質のラベルには,12) します。 異なる染料の空間的近接性することができますそれらの間のエネルギー移動から決定されます。(文献13) 蛋白質蛋白質から異なる場合があります戦略をラベリングと smFRET 測定におけるアーティファクトを避けるためのガイドライン14が存在します。
ドナー色素は、マルチカラー smFRET 実験で異なるアクセプター色素にエネルギーを移す可能性があります、ので、すべての染料の相対位置は 1 つの染料だけで15,16の興奮からアクセスできません。しかし、交互にレーザー励起 (アレックス17、および18の見直し) との組み合わせでこのメソッドは、1 秒未満でサブナノ メートル分解すべての時空間的情報を提供します。
原則として、構造情報は色素間の距離を使用して実現できます高解像度はアレックスとマルチカラー smFRET 実験ではすべての蛍光強度の組み合わせから計算されます。しかし、ここで状態の識別、分離、マルチカラー smFRET が不可欠である、運動のモデルの抽出に着目します。三角形分割による構造決定「のみ」が必要な場合、高い信号対雑音比の単純な 2 色 smFRET 実験セットは実行12,19にできます。
部分的な蛍光を用いて (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq1.jpg">) 2 つの同時7間のエネルギー移動のためのプロキシとして。PFは、2 色実験の FRET 効率に類似した蛍光強度から計算されます。
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq2.jpg">
ここで、<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq3v2.jpg">カラー exと励起後放出チャネルemの強度は、 cが最も長い波長を持つ受容体です。検出チャンネルは、試料室が蛍光ライトのスペクトル範囲が異なるレコードの同じ位置を表しています。励起と放射の同じ識別子はこのプロトコルで使用される (すなわち、 「青」、「緑」と"red")。
実験的欠点のため測定された蛍光強度はエネルギー転送のみならず、fluorophore およびセットアップ プロパティにも依存します。2 フルオロ間真のエネルギー伝達効率を得るために修正する測定強度があります。次の手順は、参照9に基づいています。明らかな漏れ (lk、すなわち、別の染料のため指定されたチャネルの蛍光体からの光子検出) の明白なガンマ補正係数 (ag、すなわち色素の蛍光量子収率とチャネルの検出効率) 表示するイベントを漂白アクセプター分子トレースから取得されます。
すべての可能な受容体チャネルにドナー色素の漏出、アクセプター色素漂白しますが、ドナーはまだ蛍光記録された蛍光トレース内のすべてのデータ ポイントから計算されます (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq4.jpg">)。
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq5.jpg">
漏れヒストグラムの中央値は明らかな漏洩ファクターとして使用されます。漏れの訂正後、明白なガンマ係数はトレースの同じセットによって決定されます。それはアクセプター色素の漂白時にドナーのチャネルで蛍光の変化による受容体チャネルの蛍光の変化を割ることによって計算されます。
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq6.jpg">
場所c再び、最長波長を持つ受容体の検出チャンネルです。結果の分布の中央値は、明らかな補正係数として使用されます。
各チャンネルで修正された強度は、によって得られます。
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq7.jpg">
PFによると計算されます。
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq8.jpg">
別の集団は、 PFs 多次元空間で分離できます。位置と各状態の幅は、継ぎ手の多次元ガウス関数とデータによって決まります。すべてPFトレースに基づく 1 つのグローバルな HMM の後続の最適化は、観測された挙動の定量的な説明を提供します。率の小さな変更は検出です。
Hmm は、騒々しい時間トレースの収集から状態モデルを推定する方法を提供します。システムは、任意の時点と実際の観測 (すなわち、排出量) で隠された状態はこの隠し状態20の確率関数、離散のセットのいずれかにすると見なされます。観察 smFRET データの場合、放出確率bは私の状態は私あたりは連続ガウス確率密度関数でモデル化できます。定期的に間隔をあけられた離散時間ポイントでから 1 つ別の状態への遷移、時不変であり現在の状態にだけ依存する遷移確率によると発生します。遷移行列Aでは、これらの遷移確率ijをすべて非表示のステート間を含まれています。初期状態分布<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq9.jpg">状態固有の確率を与える<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq10.jpg">時間トレースの最初の時間の点。最大尤度アプローチを使用して、これらのパラメーターは最高前後バウム ウェルチ アルゴリズム20,21とデータを記述するために最適化できます。最尤推定 (MLE) が得られます。最後に、最も可能性の高い観察の軌道を生成状態シーケンスはビタビ アルゴリズムで推測できます。HMM、単なる「平滑化」のデータが必要とせずデータ セットから抽出運動の状態モデルのドウェル時間を嵌合するための smFRET データ24,25,26の他の HMM 解析と対照をなして使わないヒストグラム27。HMM 解析は、Igor Pro を使用してスクリプトを内部で行われます。コードの実装は、参照21に基づいています。我々 は次のセクション 5 および 6 はこのプロトコル (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret) のために当社ホームページのソフトウェア キットと模範的なデータを提供します。完全なソフトウェアは、リクエストを承ります。
時間でPFを使用してデータ ポイント &lt;-1 またはPF &gt; 任意の検出チャンネルで 2 がすべての州 (10-200) の発生が少ない確率を割り当てられます。これは、これらのデータ ポイントで人工の遷移を防ぎます。
放出確率のパラメーターは、手順 5.7 ガウス関数による 3 D PFヒストグラムのフィットから取得されます。これらのパラメーターは、HMM の最適化中に固定されます。
提示されたアプローチで初期状態分布ベクトルと遷移行列が、トレースの全体のアンサンブルを記述するグローバルに使用されます。参照27に従って、データ セットからのすべてのN分子に基づいて更新されます。
初期状態の配布の開始パラメーターはPFヒストグラム (ステップ 5.3) の投影から決定され、遷移確率に設定されて 0.05 確率を除いて同じ状態に滞在するそのような物選ばれました。特定の状態のままにする確率を団結を正規化します。
プロファイル尤は、すべて移行率21,22不確実性の意味のある見積もりとなるための信頼区間 (Ci) を与えるためです。特定のレートの CI の境界を計算するための関心の遷移確率は尤以外の値に固定されています。これにより、テスト モデル λ'。尤度の尤度比 (LR) 検定<img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq16.jpg">によると特定のデータ セット0が実行されます。
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq11.jpg">
バインド パラメーターはLR 3.841、 2xの 95% の変位値を超えたときに 95% の信頼-1 自由度22,23配布。
Hsp90 を使用してメソッドの力を発揮します。この豊富なタンパク質は、細菌と真核生物で発見され、細胞ストレス応答28の一部です。がん治療29で有望な薬剤標的であります。Hsp90 は各サブユニットの30の N 末端ドメインの 1 つのヌクレオチド結合ポケットのホモです。それは、少なくとも 2 つのグローバル異なるコンフォメーション、閉鎖の 1 つと 1 つ N ターミナル オープン、V 字構造19,31,32間の遷移を受けることができます。二量体の性質は直接 Hsp90 2 つのヌクレオチド結合部位間の相互作用の問題を発生させます。
以下では、データ集録および酵母 Hsp90 とヌクレオチドの 3色 smFRET 実験の解析の手順プロトコルを提供します。蛍光に分類されたアンプ PNP のコンホメーション依存的結合 (AMP-PNP *、非加水分解性 ATP アナログ) が分析します。記述されていたプロシージャのアプリケーション研究ヌクレオチド結合のと同時に Hsp90 のコンフォメーション変化が許認可により Hsp90 の 2 つのヌクレオチド結合ポケットの間の協同性を明らかにします。

<table><tbody><tr><td>Setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>振動減衰光学テーブル&nbsp;&nbsp;</td><td>米国カリフォルニア州アーバイン市ニューポート</td><td>RS2000</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 473nm LX 75mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1185052</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 532nm LS 50mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1261779</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 594nm LS 60mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1233470</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 637nm LX 140mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1196625</td><td></td></tr><tr><td>レーザー制御ユニット</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1234465</td><td>Scientific Remote</td></tr><tr><td>非球面望遠鏡レンズ</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td></td><td>d=25.4mm, f=50mm and f=100mm</td></tr><tr><td>CF ex1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml;bingen,</td><td>ドイツ ZET 473/10</td><td>クリーンアップフィルター励起</td></tr><tr><td>CF ex2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml;bingen,</td><td>ドイツ ZET 532/10</td><td>クリーンアップフィルター励起</td></tr><tr><td>CF ex3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml;bingen,</td><td>Germany ZET 594/10</td><td>クリーンアップフィルター励起</td></tr><tr><td>CF ex4</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td>FL635-10</td><td>クリーンアップフィルター励起</td></tr><tr><td>DM ex1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml;bingen, ドイツ</td><td>ZQ594RDC</td><td>ダイクロイックミラー励起</td></tr><tr><td>DM ex2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml;bingen、ドイツ</td><td>570DCXR</td><td>ダイクロイックミラー励起</td></tr><tr><td>DM ex3</td><td>AHF analysentechnik AG、T&uuml;bingen, Germany</td><td>ZQ491RDC</td><td>ダイクロイックミラー励起</td></tr><tr><td>AOTFnC-Vis</td><td>AA Opto-Electronic, Orsay, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lambda;/4 plate</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td>AQWP05M-600</td><td></td></tr><tr><td>CFI Apo TIRF 100x</td><td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td><td></td><td>high-NA objective</td></tr><tr><td>piezo focus positioner MIPOS 250 CAP</td><td>piezosystem jena GmbH, Jena,ドイツ</td><td></td><td>ピエゾコントローラー NV 40/1 CLE</td></tr><tr><td>ピエゾステッパー</td><td>ニューポート、アーバイン、カリフォルニア州、米国</td><td>PZA12</td><td>PZC200-KT NanoPZ アクチュエータキット</td></tr><tr><td>アクロマティック非球面レンズ</td><td>Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, G&ouml;ttingen, Germany</td><td>G322-304-000</td><td>d=50mm, f=200mm</td></tr><tr><td>adjustable optical slit</td><td>Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany</td><td>27.160.1212</td><td>max. aperture 12 x 12 mm</td></tr><tr><td>DM det1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml;bingen, ドイツ</td><td>T 600 LPXR</td><td>ダイクロイックミラー検出</td></tr><tr><td>DM det2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml;ビンゲン、ドイツ</td><td>H 560 LPXR スーパーフラット</td><td>ダイクロイック ミラー検出</td></tr><tr><td>DM det3</td><td>AHF analysentechnik AG、T&uuml;ビンゲン、ドイツ</td><td>HC BS R635</td><td>ダイクロイックミラー検出</td></tr><tr><td>BP det1</td><td>AHF analysentechnik AG、T&uuml;bingen, ドイツ</td><td>525/40 BrightLine HC</td><td>バンドパス フィルター検出</td></tr><tr><td>BP det2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml;bingen, ドイツ</td><td>586/20 BrightLine HC</td><td>バンドパス フィルター検出</td></tr><tr><td>BP det3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml;bingen, ドイツ</td><td>631/36 BrightLine HC</td><td>バンドパス フィルター検出</td></tr><tr><td>BP det4</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml;bingen, Germany</td><td>700/75 ET Bandpass</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>optical shutters detection</td><td>Vincent Associates, Rochester, NY, USA</td><td>Uniblitz VS25S2T0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD iXon Ultra 897</td><td>Andor Technology Ltd、ベルファスト、北アイルランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デジタルI / Oカード、PCIe-6535</td><td>National Instruments、テキサス州オースティン、米国</td><td></td><td></td></tr>シ<tr><td>リンジポンプ</td><td>ハーバード装置、マサチューセッツ州ホリストン、米国</td><td>PHD22 / 2000</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Flow chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>quartz slides</td><td>G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA</td><td></td><td>Spectrosil2000, h=3mm</td></tr><tr><td>TEGADERM film</td><td>3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td><td>1626W</td><td>10 x 12cm</td></tr><tr><td>spray adhesive</td><td>3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td><td>フォトマウント 050777</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td>Immersol G</td><td></td></tr><tr><td>immersion oil</td><td>OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Germany</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>prism</td><td>Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany</td><td></td><td>Suprasil1</td></tr><tr><td>アルミプリズムホルダー</td><td></td><td></td><td>特注の中</td></tr><tr><td>空止めネジ</td><td>Thorlabs Inc、ニュートン、ニュージャージー、米国</td><td></td><td>、カスタムドリル</td></tr><tr><td>Tygon S3 E-3603チューブ</td><td>neoLab Migge GmbH、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>2-4450</td><td></td></tr><tr><td>ACF00001 PTFEチューブ</td><td>Bohlender GmbH、Gr&uuml;nsfeld、ドイツ</td><td>S1810-08</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Sample</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yeast Hsp90 D61C、Q385C_biotin</td><td></td><td></td><td>UniProt ID P02829</td></tr><tr><td>Atto488のマレイミド誘導体、Atto550</td><td>ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP*</td><td>Jena Bioscience, Jena, Germany</td><td></td><td>&gamma;-[(6-アミノヘキシル)-イミド]-AMP-PNP-Atto647N</td></tr><tr><td>Fluospheres</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>F8764</td><td>amine-modified, 0.2 &mu;m, 黄緑色の蛍光</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td><strongstrong>コメント</td></tr><tr><td>strongSoftware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor</td><td>Solis Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td><td></td><td>version 4.30</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>NationalInstruments, Austin, Texas, USA</td><td></td><td>version 2012, 32bit; misc. hardware control</td></tr><tr><td>MDS control software</td><td>AA Opto-Electronic, Orsay, France</td><td></td><td>version 2.03a</td></tr><tr><td>Coherent Connection</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>version 3</td></tr><tr><td>Igor</td><td>Pro WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA</td><td></td><td>version 6.37</td></tr></tbody></table>

3色 1 分子 fret を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

単一分子蛍光共鳴エネルギー移動 (smFRET) 生体分子のダイナミクスを調べるため広く使用されている生物物理学的技術となっています。自分のタスクを満たすために機能サイクルの相互作用パートナーと共に行動する細胞蛋白質の多くの分子機械を持っています。延長にマルチカラー 2 色 smFRET はそれに 1 つ以上の相互作用や構造変化を同時に調査することが可能。これだけではなく smFRET 実験新しいディメンションを追加しますが、イベントのシーケンスを直接研究して固定化サンプルと全反射蛍光相関相互作用を検出するユニークな可能性を提供しています顕微鏡 (TIRFM)。したがって、マルチカラーの smFRET は以前達成不可能の詳細で定量的な方法で生体分子複合体を研究するための多目的なツールです。
ここでは、蛋白質のマルチカラー smFRET 実験の特別な課題を克服する方法を示します。データを取得するため、運動情報を抽出するための詳細なプロトコルを提案します。これは、トレース選択基準、国家の分離、および 3 D アンサンブル隠されたマルコフ モデル (HMM) を用いたノイズの多いデータから状態軌道の回復が含まれています。他の方法と比較して、運動情報はドエル時間ヒストグラムから、直接 HMM からを回復しません。最尤フレームワーク キネティック モデルを批判的に評価して料金の意味のある不確実性を提供することが出来ます。
熱ショックタンパク質 90 (Hsp90) に本手法を適用しておりますはヌクレオチド結合および蛋白質のコンフォメーション変化が世界を解きほぐすことができます。これにより、Hsp90 二量体の 2 つのヌクレオチド結合ポケットの間の協同性を直接観察できます。

マルチカラー smFRET 測定は、2 つ以上の異なる相互作用部位との相関の直接検出を許可します。これは蛋白質の複合体などの多成分システムを検討するユニークな技術をレンダリングします。具体例として 3 色 smFRET 実験がここでは、プレゼンテーションに着目します。
図 1にメソッドの一般的なワークフローを示します。最初の部分には、プリズム式全反射顕微鏡にマルチカラーの smFRET データの記録が装備されています。付着戦略とセットアップの回路図は、図 2 aに描かれています。セットアップの詳細な説明、9を参照を参照してください。提示されたメソッドの 2 番目の部分は、データの分析に焦点を当てください。図 2 bには、模範的な...

ここでは、3色 smFRET データと 3 D アンサンブル隠されたマルコフ モデルとその解析を取得するためのプロトコルを提案する.このアプローチでは、科学者は複雑な蛋白質のシステム、協同性や相関相互作用などからキネティック情報を抽出できます。

3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

この手順の全体的な目標は、協同性などの相関相互作用に焦点を当てて、複雑なタンパク質システムのダイナミクスを定量的に研究することです。この方法は、タンパク質複合体とその動的相互作用が中心的な重要性を持つ定量的生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、動的多色単一分子FRETを生物学的に関連性のあるシステムに適用できることです。フローチャンバーを組み立てる前に、厚さ40ミクロンの透明接着剤フィルムに流路を切り取り、フィルムの非接着面にクイック固定接着剤をスプレーし、接着剤を乾燥させます。フローチャンバーの組み立てを開始するには、厚さ3ミリメートルのPEG、ビオチンPEG、注入口と出口の穴を備えた溶融石英スライドを取得します。天井フィルムのスプレー接着剤コーティング面をスライドの機能化された面に塗布し、チャネルを入口と出口のフックに揃えます。ホットプレートの上でスライドを80°Cに1分間加熱します。追加の顕微鏡スライドを使用してフィルムをスライドに30秒間押し付け、圧力を均等に分散させます。その後、アセンブリを1分間冷まします。接着剤を覆っている保護シートをはがします。露出した接着剤の上にカバースリップを置き、フローチャンバーを形成します。チャンバーを摂氏80度に1分間加熱します。カバースリップを接着剤に30秒間押し付けてチャンバーを密閉し、組み立てたチャンバーを冷まします。プリズム面にグリセロールを一滴塗布してから、フローチャンバーをプリズムの上に置きます。フローチャンバーをホルダーに取り付けて、マルチカラープリズムタイプのTIRF顕微鏡に取り付けます。終了したら、インレットチューブとアウトレットチューブを接続します。3色測定用の機器の構成を開始するには、電子増倍CCDカメラソフトウェアを開き、EMCCDセンサーを可能な限り低い温度に設定します。カメラの垂直シフト速度を 3.3 マイクロ秒に設定し、通常の垂直クロック電圧を選択し、水平読み取り速度を 16 ビットで 17 ミリヘルツに設定し、事前増幅ゲインを 3 に、電子増倍管ゲイン レベルを 1000 に設定します。外部集録トリガを選択します。露出時間を 70 ミリ秒に設定します。そして、動画撮影時間は750回まで。測定ファイル用の新しいフォルダを作成します。EMCCDソフトウェアで自動保存を有効にし、ムービーフレームのファイル形式をTIFFに設定します。自動保存ファイルのパスを新しく作成したフォルダに設定します。次に、音響光学チューナブルフィルターを制御するソフトウェア、レーザー制御ソフトウェア、およびレーザーAOTF、光学シャッター、およびカメラを同期するトリガーソフトウェアを開きます。AOTFを使用して、プリズムに入る前にレーザー出力を約3ミリワットに調整します。交互レー

using-three-color-single-molecule-fret-to-study-correlation-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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イメージングタンパク質間相互作用 in vivoで</em

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単一分子蛍光エネルギー移動は、リボソームタンパク質合成中のtRNAダイナミクスを追跡する方法である。個々のリボソームを追跡することにより、不均一な集団が同定され、メカニズムに光が当たります。この方法は、生物学的立体構造の変化を一般的に追跡し、他の多くの複雑なバイオシステムにおける動的機能関係を明らかにするために使用することができる。単一分子法は、平均効果のために従来のアンサンブル法ではアクセスできない非レート制限ステップおよび低人口のキー中間体を観察することができる。...

リボソームタンパク質合成の単一分子蛍光エネルギー転移研究

ここでは、BiFCベースのFRET-FLIMアッセイによる蛍光タグ付きタンパク質を用いた3つのタンパク質パートナー間の三元複合体形成を可視化する方法を提示する。この方法は、...

BIFC-FRET-FLIMアッセイによるMADS型転写因子の2つのモノマーとカルシウムセンサタンパク質の三者間相互作用の測定

我々は、現代の蛍光標識技術を用いて生細胞における膜受容体ダイナミクスを研究するために、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせた生細胞二重色蛍光相互相関分光(FCCS)を行う実験プロトコルとデータ分析ワークフローを提示する。...

生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

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生体分子凝縮物内のタンパク質相互作用ダイナミクスの1分子測定

学ぶ3色1分子FRETを用いたタンパク質相互作用の相関関係と協同性の定量的解析法。Hsp90ダイマーの動態とAMP-PMP結合状態の遷移確率を3Dアンサンブル隠れマルコフモデルで解析し、複雑なタンパク質系の運動学的情報を抽出する。

3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

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