Name: ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学ぶ 停止流蛍光共鳴エネルギー移動法を用いたタンパク質複合体形成の動態解析。COL1-CAND1複合体をモデルに、結合・解離のリアルタイムモニタリングにより、タンパク質間相互作用の定量的評価を可能にする。

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フレットの試金の開発に洞察力に富んだ議論ありがとう集 Ou シャン (カリフォルニア工科大学)。X.L.、Y.Z.、m. g. Y.Z. にパデュー大学からスタートアップ資金によって資金が供給された、X.L.This 作業はパデュー大学センターからのシード補助金によって植物生物学の部分で支えられました。

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著者が明らかに何もありません。

フレットは、勉強し、生物学的システム19を理解に非常に役立つは物理現象です。ここでは、テストのフレットを使用して 2 つの相互作用の蛋白質の結合の動力学を調査するためのプロトコルを提案する.フレットをデザインするとき、我々 は 3 つの主要な要因を考慮: ドナーの排出量と受容体の励起、2 つの同時と fluorophores28の双極子の方向間の距離間スペクトルの重なり。フレットの蛍光物質を選択するには、我々 は励起し、蛍光物質の発光スペクトルを重ね、fluorophores が付いてその発光ピークはよく分かれているドナーの発光スペクトルは励起と大幅重なる中で検索受容体 (図 2) のスペクトル。Interfluorophore 距離および方向を最適化するため我々 は援助の結晶構造を使用し、我々 は主に主に蛋白質の構造および活動を中断のリスクが低いため、タンパク質テルミニへ fluorophores のアタッチと見なされます。Cand1 の N 末端間距離 (Cand1NT...

生物活性最終的に最もうちで適切な生物学的機能の他のユーザーと対話する蛋白質によって実行されます。計算論的アプローチを使用して、650,000 〜1、人間蛋白質蛋白質の相互作用の総量を推定し、病2につながる多くの場合これらの相互作用の中断。酵母 2 ハイブリッド、分子蛍光補完、分割ルシフェラーゼなどのタンパク質間の相互作用を研究する細胞と個体のプロセスを制御するに重要な役割のための多数の方法を開発されています。補完、および co 免疫沈降分析3。これらのメソッドが検出および蛋白質蛋白質の相互作用を確認するのに優れている、彼らは通常定量的なしたがって、相互作用タンパク質の親和性について限られた情報を提供します。定量的プルダウン ・ リストを使用して、結合親和性 (例えば、解離定数Kd) を測定できますが、バインディングのキネティクスはからずも、それKdが不十分のため非常に低い場合に適用されます。信号対雑音比の4。表面プラズモン共鳴 (SPR) 法による拘束運動を定量化が比表面積、表面、反応5のバインドのプロパティを変えることができる潜在的に 1 つの反応の固定化が必要です。さらに、高速協会と解離率5を測定するための SPR の困難だし、SPR を使用して蛋白質の複合体の蛋白質の亜単位の交換イベントを特徴付ける適切ではないです。ここでは、蛋白質複雑なアセンブリおよびミリ秒のタイム スケールでの分解の率を測定できるようにする方法をについて説明します。このメソッドは、F 箱蛋白質交換要因6,7としてCullin-ssociated -Nedd8 -dissociated 蛋白質1 (Cand1)の役割を決定するために不可欠だった。
Cand1 は、Cullin リング ユビキチンリ ガーゼの大家族に属している Skp1•Cul1•F ボックス蛋白質 (SCF) E3 リガーゼのダイナミクスを調整します。SCFs は、リング ドメイン蛋白質 Rbx1 を結合する Cul1、F ボックス蛋白質が交換可能な基板を募集し、アダプター蛋白質 Skp18を介して Cul1 をバインドのカリンで構成されます。E3 リガーゼとして SCF は、その基板にユビキチンの共役を触媒して基板が F 箱蛋白質によって採用されていると Cul1 がユビキチン様タンパク質 Nedd89によって変更されたときそれがアクティブになります。Cand1 はそのまま Cul1 をバインドし、結合、それが両方の Skp1•F ボックス蛋白質 Cul1 の協会、Cul110、11,12,13Nedd8 活用妨害します。その結果、Cand1 は in vitro での SCF 活動の阻害剤のように見えたが、生物における Cand1 欠乏 vivo14,15,16の SCF の活動を調節する Cand1 の肯定的な役割を示唆している欠陥が発生,17. このパラドックスは最終的に Cul1、Cand1、Skp1•F ボックス蛋白質間の動的相互作用を明らかにする量的な研究によって説明されました。SCF と Cul1•Cand1 複合体の形成を検出蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) 試金を使用して、協会と解離速度定数 (k上とオフk、それぞれ) あった個別に測定します。測定は、Cand1 と Skp1•F ボックス蛋白質フォーム非常にタイトな複雑な Cul1、しかし、 kオフの SCF とは Cand1 で劇的に増加し、 kオフの Cul1•Cand1 が大幅に向上を明らかにしました。Skp1•F ボックス蛋白質6,7。これらの結果は、古い SCF 複合体から Cul1 のリサイクルを通じて新しい SCF 複合体の形成を触媒するタンパク質の交換要因として Cand1 の役割を定義する初期および重要なサポートを提供します。
ここでは、開発と Cul1•Cand1 複雑な7ダイナミクスを研究するフレットの試金を使用しての手順を提案して同じ原理は、様々 な生体分子のダイナミクスを研究に適用できます。フレットは、適切な波長で励起ドナーとドナーの発光スペクトルを重複する励起スペクトルを持つ受容体は 10-100 の範囲内で存在が発生します Å。励起状態は、ドナーの強度を減少させる受容体強度18を増加し、受容体に転送されます。フレット (E) の効率・ フォシュテル半径 (R0) およびドナーとアクセプター フルオロ (r) の間の距離によって異なります、によって定義されます: E = R06/(R06 + r6)。フェルスター半径 (R0) 配向角度を含むいくつかの要因に依存し、ドナー ・ アクセプターのペアとソリューションのスペクトルの重複使用19。リアルタイムでドナーの排出量の変化を監視し、高速でkとkオフの測定が可能、ストップト フロー蛍光にフレット アッセイを適用する効率的なフレットを確立する必要があることドナーの排出量の大幅な削減の結果。したがって、染料を付ける適切な蛍光染料とターゲット蛋白質のサイトのペアを選択することで効率的なフレットの設計は重要であり、このプロトコルで説明。

<table><tbody><tr><td>陰イオン交換クロマトグラフィー</td>カラム <td>GE Healthcare</td><td>17505301</td><td>HiTrap Q FF 陰イオン交換クロマトグラフィーカラム</td></tr><tr><td>卓上型冷蔵遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>2231000511</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) コンピテントセル</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C600003</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>C78-500</td><td></td></tr><tr><td>陽イオン交換カラム</td><td>クロマトグラフィー GE Healthcare 17505401</td><td></td><td>HiTrap SP Sepharose FF</td></tr><tr><td>脱塩カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>フロアモデル遠心分離機(高速)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>J2-MC</td><td></td></tr><tr><td>フロアモデル遠心分離機(低速)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>J6-MI</td><td></td></tr><tr><td>蛍光スペクトルビューア</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td></tr><tr><td>FluoroMax蛍光計</td><td>HORIBA</td><td>FluoroMax-3</td><td></td></tr><tr><td>FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>GGGGAMC ペプチド</td><td>ニューイングランド ペプチド</td><td>カスタム合成</td><td></td></tr><tr><td>グルタチオンビーズ</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td>17075605</tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP310-100</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル -&β;-D-チオガラクトシド (IPTG)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15-529-019</td><td></td></tr><tr><td>LB ブロス</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA アガロース</td><td>キアゲン</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>オボアルブミン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A2512</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-4T-2 ベクター</td><td>GE ヘルスケア</td><td>28954550</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ミリポアシグマ</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>還元型グルタチオン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP25211</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵シェーカー</td><td>エッペンドルフ</td><td>M1282-0004</td><td></td></tr><tr><td>ロゼッタ コンピテントセル</td><td>MilliporeSigma</td><td>70953-3</td><td></td></tr><tr><td>サイズ排除クロマトグラフィーカラム</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>Superdex 200 10/300 GL カラム</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>ストップフロー蛍光計</td><td>Hi-Tech Scientific</td><td>SF-61 DX2</td><td></td></tr><tr><td>TCEP&middot;HCl</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>・シンPI20490</td><td></td></tr><tr><td>トロンビン</td><td>・ミリポアシグマ</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>限外ろ過膜</td><td>ミリポアシグマ</td><td>UFC903008</td><td>アミコン・ウルトラ-15 遠心フィルターユニット、ウルトラ-15、30,000 NMWL</td></tr></tbody></table>

ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

タンパク質は生物学的システムの主な演算子と通常他のマクロ - または彼らの生物学的機能を遂行する小分子とやり取りします。このような相互作用は、非常にダイナミックな相互作用の亜単位は常に関連付けられているし、特定のレートで解離を意味することができます。高速方法に洞察力を提供定量的プルダウン バインディング機構研究、相互作用の強さを明らかにするようなテクニックを使用する結合親和性を測定しながら相互作用が発生し、それぞれの複合体が存在することができますどのくらい。さらに、相互作用の重要な知識を提供する他の因子によって調節されているメカニズムを明らかにするのに役立ちます蛋白質交換因子、薬物など、その他の要因の存在下での相互作用の動力学を測定、医学生物学の進歩。ここでは、高い組み込み協会率を持ち、別の蛋白質によってすぐに解離することができます蛋白質の複合体の結合動態を測定するためのプロトコルについて述べる。メソッドでは、蛍光共鳴エネルギー移動を使用して、in vitro タンパク質複合体の形成を報告でき高速協会・ ストップト フロー蛍光上でリアルタイムに複合体の解離を監視できます。この試金を使用して、複雑なタンパク質の協会と解離速度定数は定量化しました。

Cul1 間のフレットをテストするAMCとフラッシュCand1、我々 はまず 70 の発光強度を決定 nM Cul1AMC (ドナー) と 70 nMフラッシュCand1 (受容体)、それぞれ (図 3 a-c、青いライン)。各分析だけで 1 つの発光ピークは現状と Cand1 のフラッシュの発光 (受容体) は低かった。とき 70 nM の各 Cul1 のAMCと Cand1 のフラッシュは、フレットを生成する混合された、2 つの発光ピーク発光スペクトルに存在していた、Cul1 ピークAMCが低くなったし、フラッシュCand1 のピークより高い (図 3 a になった -C、赤の線)。ドナー...

蛋白質蛋白質の相互作用、生物学的システムにとって重要と拘束運動の研究は、ダイナミクスとタンパク質複合体の機能に対する洞察を提供します。蛋白質の蛍光共鳴エネルギー移動ストップト フロー法を適用した複合体の速度論的パラメーターを定量化する手法について述べる。

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

我々の方法は、タンパク質複合体形成の運動学を研究するのに役立ちます。タンパク質複合体がいかに緊密であるか、またタンパク質複合体形成が他のタンパク質によって干渉される場合について説明します。この技術により、蛍光をレポーターとして定量的に用いたタンパク質とタンパク質の相互作用を研究することができ、当社のアッセイは、タンパク質複合体の関連付けと解離をリアルタイムで監視することができます。まず、タンパク質データベースからCOL1 CAND1複合体のデータから始まるFRETアッセイを設計します。PyMOLで構造をロードし、ウィザードメニューに移動し、CAND1の最初のアミノ酸とCOL1の最後のアミノ酸との間の距離を推定するために測定機能を使用します。次に、オンラインスペクトルビューアをロードし、7-アミノ-4-メチルクマリンとFlASHの励起および発光スペクトルを同時に見る。AMCはフレットドナーであり、FlASHはフレットアクサクサです。付随するテキストプロトコルに従ってFRETドナータンパク質を用いて細胞を調製する。次いで、まず、COL1ソーターゼRBX1複合体を発現する大腸菌細胞のペレットに50ミリリットルのリシスバッファーを添加することにより、COL1ソーターゼRBX1複合体を精製する。50%振幅で超音波処理で氷上の細胞を氷。電源を 3 分間切り替えて 1 秒オンにし、サンプルが過熱しないように 1 秒オフします。得られた細胞ライセートを50ミリリットルの遠心チューブに移し、25,000回gで遠心分離して45分間細胞の破片を取り除きます。その後、上清を5ミリリットルのグルタチオンビーズに加え、4°Cでインキュベートして細胞のリセートをクリアします。インキュベーションに続いて、ビーズのライセート混合物を摂氏4度で2分間1、500回gで遠心分離する。その後、上清を取り除く。次に、プロテアーゼ阻害剤を有さない5ミリリットルのリシス緩衝液でビーズを洗浄する。溶液を遠心した後、上清を取り除きます。次に、洗浄されたビーズに3ミリリットルのリシスバッファーを加え、ビーズスラリーを空の列に移します。新しい列に、5ミリリットルの溶出バッファーを加え、そのカラムを10分間インキュベートし、溶出液を回収します。次に、グルタチオンビーズから溶出物に1ミリリットル当たり5ミリグラムで200マイクロリットルのトロンビンを加える。摂氏4度で一晩インキュベーションした後、タンパク質サンプルをバッファーAで3倍希釈し、タンパク質サンプルを1分間に5ミリリットルのゼロポイントで平衡化されたカチイオン交換クロマトグラフィーカラムにロードします。次に、バッファAにゼロ~50%の緩衝値Bを加えて、1分間に1ミリリットルの流量でタンパク質を溶出させる。次に、FRETドナータンパク質を含む溶出画をプールし、30キロダルトンカットオフを有する限外濾過膜を使用して2ポイント5ミリリットルに濃縮する。さて、最初に脱塩カラムを使用してFRETドナータンパク質サンプルのバッファーをソーターゼバッファーに変更することによって、ソーターゼ媒介トランスペプチドを介してCOL1のc末流に7-アミノ-4-メチルクマリンを加える。これを達成するために、まず25ミリリットルのソーターゼバッファーで脱塩カラムを平衡化する。次に、FRETドナータンパク質溶液の2点5ミリリットルをカラムにロードし、流れを捨てます。次に、ソーターゼバッファーの3ポイント5ミリリットルでサンプルを溶出し、流れを通して収集します。溶出液の900マイクロリットルに、600マイクロモル精製ソーターゼA溶液の100マイクロモルリットルと25ミリモルGGGG-AMCペプチドの10マイクロリットルを加える。一晩暗闇の中で摂氏30度で反応混合物をインキュベートし、COL1-AMC-RBX1を生成する。次に、すべてのサンプルをサイズ除外クロマトグラフィー列にロードし、バッファーのカラム体積の5倍の1ポイントで溶出します。最後に、COL1-AMC-RBX1を含む溶出画分をプールします。テキストプロトコルに従って、FRET アクソクタータンパク質を調製します。多くのステップは、FRETドナータンパク質調製物と同様である。完了したら、Flash CAND1溶液を準備します。まず、FlASH溶液の1マイクロリットルを、作りたてのテトラサイ-CAND1溶液の50マイクロリットルに加えます。組み合わせた溶液をよく混ぜ合わせ、暗闇の中で室温で混合物を1〜2時間インキュベートし、FlASH CAND1溶液を形成します。300マイクロリットルのFRETバッファーで、コル1-AMC-RBX1を70ナノモルの最終濃度に加え、溶液をキュベットに移します。キュベットをフッ素計のサンプルホルダーに入れます。350ナノメートルの励起光でサンプルを励起し、1ナノメートル単位で400〜600ナノメートルの発光信号をスキャンします。次いで、300マイクロリットルのFRETバッファーに、COL1-AMC-RBX1とFlASH-CAND1の両方を70ナノモルの最終濃度に加えます。350ナノメートルの励起光でサンプルを励起し、400〜600ナノメートルの発光信号を1ナノメートル単位でスキャンします。励起光を350ナノメートルに設定し、450ナノメートルの発光光を通過させ、500〜650ナノメートルの発光光をブロックするバンドパスフィルタを使用します。充填位置のサンプルバルブで、水で満たされた3ミリリットルのシリンジを接続します。次に、サンプルシリンジドライブを上下に数回動かして2本のサンプル注射器を水で洗い、完成したら水を捨てます。次に、FRETバッファーで満たされた3ミリリットルのシリンジを接続します。サンプルシリンジドライブを数回上下に動かしてFRETバッファーで2つのサンプルシリンジを洗浄し、終了時に水を捨てます。さて、3ミリリットルのシリンジを接続し、FRETバッファーに100ナノモルCOL1-AMC-RBX1を使用して、最初のサンプルシリンジ、シリンジAをロードします。その後、サンプルバルブを駆動位置に回し、3ミリリットルのシリンジをシリンジBに接続し、FRETバッファにFlASH CAND1のナノモルを100ナノモルでシリンジBをロードし、そのバルブを駆動位置に回します。ソフトウェアで取得中のコントロールパネルを開き、60秒間にわたってCOL1-AMCの放出を記録します。その後、単一のショットを取ります。各ショットから時間の経過と経過とともに測定された蛍光信号の減少と単一の指数曲線に適合させます。先に示したようにシステムを洗浄し、FRETバッファー内の100ナノモルCOL1-AMC-RBX1と100ナノモルFlASH CAND1の溶液をシリンジAに追加します。次に、Skp1-Skp2の溶液をシリンジBにロードし、充填位置にある間にシステムに接続します。シリンジBをロードし、サンプルをドライブ位置に回します。ソフトウェアで、コントロールパネルを入手して開きます。COL1-AMC の放出を 30 秒にわたって記録するようにプログラムをセットアップします。その後、単一のショットを取ります。蛍光シグナルは、シリンジAとシリンジBからの溶液を混合した後、時間の経過とともに増加する。そして、COL1-AMCのピークが低くなり、FlASH CAND1のピークが高くなりました。全長CAND1をFRETに使用した場合、ドナーピークは強度の10%減少を示した。しかし、最初のらせんを切り捨てたCAND1を使用した場合、ドナーピーク強度の低下を30%に増加させ、FRET効率の向上を示唆し、COL1-AMCとFlASH CAND1の間のFRETから信号変化が生じることを確認し、ドナーFRETは受入器のチェイスとして知られている過剰なラベルなしCAND1と混合した。その結果、ドナーピークは完全に回復し、アクサクサピークは減少した。ここに示されているのは、線形回帰分析後のCAND1濃度を用いた平均観測K値のプロットである。複合体の定数上で測定するために、50ナノモルCOL1-AMCを一連の観察された解離速度定数に使用し、FlASH CAND1の濃度を増加させると50ナノモルCOL1-AMCを混合して測定した。オン定数の測定と同様に、COL1およびCAND1の観測解離定数は、停止流量フルオロメーター上でドナー信号の回復を時間経過に伴って監視することによって発見された。ここでドナーシグナルは急速に増加し、1秒間にゼロポイント4の観測K値を明らかにした。対照的に、あらかじめ組み立てられた複合体にバッファーを添加した場合、COL1 CAND1の急速な解離がSkp1 Skp2によって引き起こされたことを示唆するシグナルの増加は認められなかった。できるだけ暗闇の中で蛍光色素を保つようにしてください。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

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