化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

HEVナノ粒子表面の化学的官能基化の全体的な目標は、診断および治療目的で、HEVナノ粒子の表面に免疫原性分子、治療分子、および診断分子を標的とする結合のための再現性のある一貫したアプローチを提供することです。この方法は、がんの標的化の強化やナノ治療薬の分布をどのように監視できるかなど、ナノメディシン分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝子工学を生成する場合と比較して、再現性が高く、効率的で、達成がはるかに容易であることです。

手順を実演するのは、私たちの研究室の研究助手であるMichelle NguyenとIvan Ruizです。このプロトコルは、テキストプロトコルに記載されているように、E型肝炎ウイルスナノ粒子の生成と精製から開始します。HEVナノ粒子サンプルを10ミリモルMES、TEMイメージング用のpH 6.2で1ミリリットルあたり0.5〜2ミリグラムに希釈します。

カーボンコーティングされたグリッドを40ミリアンペアのグロー放電で30秒間イオン化して、親水性のカーボン表面を生成します。グリッドの親水性カーボン表面は、グロー放電処理後30分間しか持続しません。イオン化後、グリッドとピンセットを保持し、2マイクロリットルのHEVナノ粒子サンプルをグリッドに加えます。

15〜30秒後、グリッドを濾紙で拭き取ります。次に、すぐにグリッドを二重蒸留水で洗い、濾紙で再度拭き取ります。すぐに2マイクロリットルの2パーセント酢酸ウラニルをグリッドに追加します。

15秒後、グリッドを濾紙で拭き取ります。サンプルグリッドを電子除湿機のドライキャビネットに一晩入れて乾燥させます。サンプルによっては、構造の可視化と特性評価のために極低温電子顕微鏡またはクライオ電子顕微鏡が必要になる場合があります。

グリッドをTEMに転写し、10〜80Kの倍率で画像化します。HEVナノ粒子は、ウイルスRNAがないため、直径約27ナノメートルの空の二十面体タンパク質としてTEMに現れます。HEVナノ粒子とマレイミド結合ビオチンのワンステップ結合を行うには、まずHEVナノ粒子をミニ透析ユニットに適用します。

ナノ粒子を0.01モルのPBS pH 7.4に対して室温で1時間、メーカーのプロトコルに従って透析します。透析後、HEVナノ粒子を1.5ミリリットルのチューブに移し、分光光度計を用いて280ナノメートルのタンパク質濃度を測定します。ナノ粒子を1ミリグラム/ミリリットルで、等量の100マイクロモルのマレイミドビオチンと0.01モルのPBS pH 7.4と混合して、1〜5モルの比率を作ります。

摂氏4度で一晩反応させた後、メーカーのプロトコルに従ってスピン脱塩カラム手順で未結合のマレイミドビオチンを除去します。標準の還元SDSページを通じてサンプルを分析します。標準的な手順を使用して、HRP結合ストレプトアビジンを使用して化学発光ウェスタンブロットを調製し、X線フィルムで化学発光シグナルを捕捉します。

乳がん細胞特異的リガンドLXY30をHEVナノ粒子上に露出したシステイン表面に2段階結合させるには、まずナノ粒子をミニ透析ユニットに適用し、0.01モルPBS pH 7.4に対して室温で1時間透析します。次に、HEVナノ粒子を1.5ミリリットルのチューブに移し、分光光度計を使用して280ナノメートルのタンパク質濃度を測定します。次に、650マイクロモルのマレイミドアジドと650マイクロモルのアルキンLXY30を、200マイクロモルの硫酸銅と1ミリモルのアスコルビン酸と組み合わせます。

これにより、650マイクロモルでマレイミド結合LXY 30が形成されます。混合物を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、HEVナノ粒子を1ミリグラム/ミリリットルに約10%の容量のマレイミド結合LXY 30と混合して、1〜3モル比を作ります。

摂氏4度で一晩反応します。マレイミドLXY 30の濃度が比較的高いため、硫酸銅などの反応物の最終濃度は、混合後に約10倍減少します。E型肝炎ウイルスナノ粒子への損傷を避けるために、別の選択肢は銅フリー寄与法です。

未結合のマレイミドを、メーカーのプロトコルに従ってスピン脱塩カラムでLXY 30をクリックします。LXY 30結合HEVナノ粒子を摂氏4度に保ちます。LXY 30 HEVナノ粒子とCy5.5蛍光タグのワンステップ結合を行うには、まずLXY 30結合ナノ粒子を等量のCy5.5蛍光タグと1ミリグラム/ミリリットルに混合して、1〜5モル比にします。

混合物を摂氏4度で一晩反応させた後、メーカーのプロトコルに従ってスピン脱塩カラム手順で結合していないCy5.5 NHSを除去します。LXY 30 Cy5.5結合HEVナノ粒子を摂氏4度に保ちます。腫瘍細胞の標的化のためのHEVナノ粒子のLXY 30機能化のために、2つの方法が試みられました。

HEV 573Cナノ粒子を最初にマレイミドアジドに結合させ、続いてLXY 30アルキンにクリック化学反応を行ったところ、HEV 573Cナノ粒子はTEM観察下で分解したように見えました。しかし、LXY 30アルキンとマレイミドアジドとの間の最初のクリックケミストリー反応によるマレイミド結合LXY 30の形成と、それに続く修飾HEVナノ粒子の補助のための結合は、その構造に影響を与えず、HEV 573Cナノ粒子は無傷のままでした。LXY 30およびCy5.5結合HEVナノ粒子を培養乳がん細胞に適用し、共焦点顕微鏡で観察しました。

共焦点顕微鏡による近赤外蛍光画像は、LXY 30 Cy5.5結合HEVナノ粒子が、Cy5.5結合HEVナノ粒子と比較して、MDA MB 231乳がん細胞の内在化の増加に対してより高い結合親和性を示したことを示しています。この技術の意味するところは、正常細胞に損傷を与えることなく腫瘍の正確な標的化と診断を可能にするマルチモーダルターゲティングおよび治療分子の検討にまで及びます。この方法は、化学的表面調節を通じてがんと腫瘍の標的化に関する洞察を得ることができますが、早期のがん診断、スクリーニング、および画像誘導治療にも適用できます。