Name: 化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学ぶHEVナノ粒子の表面化学修飾法。合成リガンドを用いたがん標的治療と診断のためのナノ医療プラットフォーム構築手法を解説。再現性の高い結合反応で治療薬送達を実現する。

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1 昆虫細胞で HEVNP 生産
注: すべての次の手順は、セル文化フードで行わなければなりません。詳細な HEVNP 生産手順11当社前の文書を参照してください。
<ol><li>Sf9 昆虫細胞のセル 6 ウェル プレートでの 50-75% 合流するメディア (材料表を参照してください)。</li>
	<li>組換えバキュロ ウイルスを生成する Sf99 セルに HEVNP-573 C ORF2 を含む Bacmids を transfect 製造元のプロトコルによると昆虫の細胞のトランスフェクション試薬を使用する。27 ° c transfected セルをセルの実行可能性によって、3-6 日にインキュベートします。</li>
	<li>(後に transfected セルは、バキュロ ウイルス感染による分離) P0 バキュロ ウイルス ストックとして感染後 3 〜 6 日で上清を収集します。</li>
	<li>P0 株式の 200 μ L を 25 cm2分子フラスコの 50-75% コンフルエント Sf9 細胞に適用する前に培地を削除します。接種の完全なカバレッジを確保するためには、フラスコ 15 分毎をロックします。60 分の合計 4 回を繰り返します。</li>
	<li>昆虫の細胞培養培地 2 mL をフラスコに追加および 27 ° C で 3-6 日間より高い力価をバキュロ ウイルスを増幅する細胞によって維持します。</li>
	<li>12を読んでバキュロ ウイルス力価を取得するプラクの試金を遂行します。</li>
	<li>昆虫細胞用培地フラスコ 250 mL に 100 mL で懸濁 Tn5 昆虫細胞 (材料表) の培養し、0.5 x 10 の力価に 150 rpm で 27 ° C に振る5 - 1 x 106接種のため。</li>
	<li>250 mL のフラスコで 5-10 に 100 mL Tn5 細胞のバキュロ ウイルス感染 (MOI) の多様性を追加します。接種後 5-7 日間 150 rpm で 27 ° C で横に振る。</li>
	<li>小胞を持っているようにほとんどの細胞と細胞の 70-90% は光学顕微鏡観察下で死んでいる、一度 Tn5 細胞を収集し、33 mL 遠心チューブに移します。25 ° C で 90 分 10,000 x g でバケツの回転子、バランス、および細胞の残骸や組換えバキュロ スピンダウンを振る場所、超遠心機チューブします。</li>
	<li>さらに浄化のための 4 ° C でリリースされた HEVNPs を含む上清をしてください。バキュロ ウイルス上清の拡張ストレージは、プロテアーゼ阻害剤を追加します。</li>
</ol>2. HEVNP 浄化
<ol><li>ペレットし、セシウム塩化 (CsCl) 勾配分離を使用して HEVNPs を分離できます。<ol>
<li>(ステップは 1.10) から収集した上清を転送し、20% を追加 0.5% の最終的な集中に各チューブに NP 40 NP-40 任意の残りの細胞膜を溶解します。軽くピペッティングにより混合し、25 ° C で少なくとも 30 分間インキュベート</li>
		<li>遠心上清から HEVNPs ダウン ペレットへの 4 ° C で 2 時間バケツの回転子を振る 112,400 x g で HEVNPs。遠心分離後上澄みを廃棄し、優しく再 200 μ L の 10 mM MES バッファー pH 6.2 各管内一晩 (O/N) 4 ° C での原油のペレットを中断SDS - 52 kDa のバンドとして原油のペレットの HEVNP ORF2 の存在を確認する (ステップ 3.1) のページを実行します。</li>
		<li>混合 1.96 g CsCl 38.5% (w/v) CsCl 勾配、再浮遊原油ペレット 5 mL 遠心チューブに 0.01 M MES pH 6.2 の 〜 4 mL を準備します。管のバランス、スイング バケツの回転子の場所します。4 ° C で 16 時間 147,000 × g で遠心</li>
	</ol>
</li>
	<li>CsCl 勾配後分数を収集します。<ol>
<li>主に軽量化細胞膜の破片は、トップ 500 μ L 分数を破棄します。チューブの先頭から、500 μ L の分数を収集し、各分画の間にチップの交換します。番号ラベル 1.5 mL チューブに各分画を配置します。 注: CsCl グラデーションは SDS のページ CsCl の高濃度のためのゲルを実行することによって検出できないから画の HEVNP ORF2 の存在。各分画の CsCl を削除または CsCl のクリーンアップの手順で希釈できます。また、CsCl の勾配は、10-40% ショ糖勾配13 CsCl の残留を避けるために取替えることができます。</li>
		<li>5 mL の遠心管に各画分を転送し、4.5 ml の 10 mM MES の pH 6.2 の CsCl を希釈します。管のバランス、スイング バケツの回転子の場所します。ペレット、HEVNPs ダウンへの 4 ° C で 2 時間 147,000 × g で遠心。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、優しく再各管内 10 mM MES pH 6.2 の 100 μ L で、HEVNPs を停止します。蒸発を避けるために、, O/N 4 ° C でチューブをカバーします。</li>
		<li>分光光度計を用いた A260/A280 nm 比 A280 読書を記録します。として ORF2 のおおよその濃度を決定します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57020/57020eq1.jpg"> 1 システイン サイトと化学の活用のための 1 の Lys サイトそれぞれの ORF2 が含まれます。 注: HEVNP ORF2 のモル吸光係数は、60,280 1.019 mg/mL × A280 と同等であります。これは 1:1 に近く、A280 としたがって、上記式で ORF2 の濃度 (mg/mL) で HEVNPs の濃度を近似できるということ。1 の A280 読書と HEVNP が 1 mg/mL、18.8 μ M に相当する濃度を持っている例えば、ORF2。</li>
		<li>SDS ページを準備します。各画分から 6 μ L のサンプルを使用して、53.3 HEVNP ORF2 タンパク質 (ステップ 3.1) を含む分数を決定します。HEVNPs は、分数の 3-5、~1.25 グラム/mL の濃度で発見されるべき。</li>
		<li>存在と tem による HEVNPs の純度を確認してください。準備または 0.5 - 2.0 mg/mL TEM の HEVNP サンプルを薄めます。TEM で空の正二十面体蛋白質、~ 27 として表示されます、HEVNPs nm の直径 (図 2)。いくつかの蛋白質の汚染物は分数で残ることがあります、TEM (ステップ 3.2) の下で観察されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>不純物が電子顕微鏡の下で存在している場合、ステップ 2.1.3 -、HEVNPs のよい純度 2.2.6 を繰り返します。 注: CsCl 勾配によって余分な浄化 HEVNPs の歩留まり損失があります。また、CsCl 勾配浄化は残留 CsCl13を避けるために 10-40% ショ糖密度勾配によって置き換えることができます。</li>
</ol>3. HEVNP の評価
<ol><li>SDS のページ 4-12% ビス トリス タンパク質ゲル、1.0 mm、ユーザーズ マニュアル14によると 17 井戸 (材料の表を参照) を準備します。<ol>
<li>6 μ L の蛋白質のサンプルにローディングバッファー x 4 の 2 μ L を追加します。タンパク質を変性する 100 ° C で 10 分間の熱ブロックのサンプル混合物を孵化させなさい。ゲルに蛋白質のサンプルをロードします。</li>
		<li>10 分間、45 分サンプルをゲルの下端の上約 1 cm に実行までの 150 V、100 V DC 電源アダプターを設定することにより SDS のページを実行します。</li>
		<li>Coomassie 青い (0.25% (w/v) Coomassie ブリリアント ブルー R250、30% (v/v) メタノール、酢酸 10% (v/v))、1 h の SDS ページのゲルの汚れ。</li>
		<li>染色の手順後 Coomassie 青い汚れを削除し、蛋白質ゲルの重複染色バッファー (30% (v/v) メタノール、酢酸 10% (v/v)) を適用 > 室温で 12 時間。</li>
		<li>52 kDa のバンドで HEVNP ORF2 の存在を確認する白色光の下でゲルを文書化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>TEM を使用して HEVNPs を観察します。<ol>
<li>準備または 0.5 - 2 mg/mL 10 mM MES pH 6.2 TEM 画像で HEVNP サンプルを薄めます。</li>
		<li>30 40 mA グロー放電の炭素被覆グリッドをイオン化親水性炭素表面を生成する s。グロー放電装置は、材料表の説明です。 注: グリッドの親水性炭素表面だけ最後グロー後 30 分間放出できる治療。</li>
		<li>ピンセットで保持してグリッドに HEVNP サンプルの 2 μ L を追加、15-30 秒待って、ろ紙をしみ。</li>
		<li>DdH20 グリッドとろ紙をしみをすぐに洗ってください。</li>
		<li>すぐにグリッド、待機 15 秒、ろ紙をしみに酢酸 2% ウランの 2 μ L を追加します。乾燥、電子に入れてサンプル グリッド除湿 O/n 乾燥キャビネット</li>
		<li>TEM および 10-80 k 倍率で画像にグリッドを転送します。HEVNPs TEM で ~ 27 である空の正二十面体蛋白質として表示されますウイルス RNA の不在のための直径の nm。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 ビオチン、がんをターゲット リガンド、フルオロと HEVNPs の化学の活用
<ol><li>HEVNPs とリンクしたマレイミド ビオチンの 1 つのステップの活用を実行します。<ol>
<li>バッファーの変更: ミニ透析ユニットの HEVNPs を適用し、製造元のプロトコル (材料表) に従って 1 時間室温で 0.01 M PBS pH 7.4 に対して dialyze。1.5 mL チューブに、HEVNPs を転送し、280 タンパク質濃度測定分光光度計を用いた nm。</li>
		<li>1 mg/mL、Cys 反応サイト (2.2.4 の手順で詳細を参照してください)、マレイミド ビオチン (100 μ M) を 1:5 のモル比; に 0.01 M pbs は、pH 7.4 の同量の 18.8 μ M に相当する HEVNP をミックスします。O/N を 4 ° C で反応します。製造元のプロトコル (材料表) によると 40 K MWCO スピン海水淡水化列手順を非連結したマレイミド ビオチンを削除します。</li>
		<li>SDS ページ (手順 3.1) を減らす標準的サンプルを分析します。</li>
		<li>標準的な手順を使用して、化学発光西部のしみ HRP リンク ストレプトアビジンを使用して準備します。X 線フィルム (図 2) で発光信号をキャプチャします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>HEV NPs (図 5) の表面に露出したシステインに 2 つのステップ LXY30 活用を実行します。<ol>
<li>バッファー交換: ミニ透析ユニットの HEVNPs を適用、1, 1.5 mL チューブへの転送、HEVNPs の室温で 0.01 M PBS pH 7.4 に対して dialyze し、280 タンパク質濃度を測定 nm の吸光度。</li>
		<li>200 μ M CuSO4と 1 mM アスコルビン酸マレイミド リンク LXY30 を形成すると 0.01 M PBS pH 7.4 で 650 μ M マレイミド アジと 650 μ M アルキン LXY3010を追加 (Mal LXY30) 650 μ M で 4 ° C で混合物を O/N. インキュベートします。</li>
		<li>1 mg/mL、Cys 反応サイトの 18.8 μ M に相当する HEVNP をミックス (2.2.4 の手順で詳細を参照)、約 10% のマル LXY30 のボリューム (650 μ M) 0.01 M PBS ph 7.4 では、モル比 1:3; するO/N を 4 ° C で反応します。 注: Mal LXY30 の比較的高い濃度、CuSO4など、反応の最終濃度が減少します。 約 10 倍 HEVNPs への損傷を防ぐため、混合した後。別のオプションは、Cu 無料活用法15。</li>
		<li>削除したマレイミド-クリック-LXY30 製造元のプロトコルによると 40 K MWCO スピン脱塩カラムを非連結 (材料表を参照してください)。4 ° C で LXY30 リンク HEVNPs (LXY30-HEVNPs) を維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>LXY30 HEVNPs や Cy5.5 NHS エステル (NHS Cy5.5) の 1 つのステップ活用を実行します。<ol>
<li>ミックス 1 mg/mL、Cys 反応サイトの 18.8 μ M に相当する LXY30 リンク HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (2.2.4 の手順で詳細を参照)、NHS Cy5.5 の等量を (100 μ M) 0.01 M PBS ph 7.4 に 1:5 モル比;O/N を 4 ° C で反応します。</li>
		<li>削除は製造元のプロトコルによると 40 K MWCO スピン脱塩カラム プロシージャ Cy5.5 NHS を非連結 (材料表を参照してください)。4 ° C で LXY30、Cy5.5 リンク HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) を維持します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5 HEVNP へのバインディングと MDA MB231 乳癌細胞に内在
<ol><li>シード MDA MB231 乳癌細胞に 35 ミリメートルのガラス底皿 (皿あたり 5 × 104 ) 哺乳類の細胞培養のキャビネットの O/N。</li>
	<li>セルの結合実験のため次の手順 4.2 4.3 LXY30 HEVNP Cy5.5 を準備します。0.01 mg/mL、HEVNP ORF2 の 0.188 μ M に相当する LXY30 HEVNP Cy5.5 を希釈 (ステップ 2.2.4 を参照してください)、0 - 250 μ L で 1 %fbs/DMEM。<ol>
<li>NHS Cy5.5 色素のみ (HEV Cy5.5) 共役ですが、手順 4.3 HEVNP Cy5.5 の 0.01 mg を mL で否定的な制御サンプルを準備します。0.01 mg/mL、HEVNP ORF2 の 0.188 μ M に相当する HEVNP Cy5.5 を希釈 (ステップ 2.2.4 を参照)、10% の 250 μ L の FBS 添加 DMEM。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 M PBS バッファー pH 7.4 の 250 μ L を適用することによって細胞を一度洗います。細胞培養ディッシュである一部のバッファーを維持しながら、洗浄後 PBS バッファーを削除します。</li>
	<li>250 μ L LXY30 HEVNP Cy5.5 の FBS 添加 DMEM または HEVNP Cy5.5 FBS 添加 DMEM 培養 MDA MB231 乳癌細胞に 10% の 10% を適用します。シールド セルは、アルミ箔で光から料理を培養しました。</li>
	<li>キャビネット内部の 1 h の 37 ° C の細胞培養の細胞培養皿をしてください。</li>
	<li>3 回、1 M PBS、pH 7.4 の 250 μ L での洗浄あたり 5 分氷の上培養細胞を洗います。</li>
	<li>4% のセルを修復する pbs は 1 M、1 M PBS、pH 7.4 の 250 μ L で 1 回 20 分、洗いの pH 7.4 PFA。 注: セルは、共焦点顕微鏡によるイメージを作成する準備が整いました。代表的なデータは、図 5のとおりです。</li>
</ol>

<ol><li>Ludwig, C., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-like+particles-universal+molecular+toolboxes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Virus-like particles-universal molecular toolboxes.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).</li>
<li>Galaway, F. A., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS2+viruslike+particles%3A+a+robust%2C+semisynthetic+targeted+drug+delivery+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform.</a> Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).</li>
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</ol>

著者は、彼らは競争の興味があることを宣言します。

週間かかる、時間がかかる遺伝子工学プロシージャと対照をなしてここに示す簡単な 2 ステップとリガンドをターゲット癌を追加する、3 日間内に完了できるワンステップ化学の活用手順や蛍光検出色素 HEVNPs のシステイン/リスのサイトへ。テクニックを使用することができます候補者のプール、したがって合理的なコストと配信時に利用可能なペプチド/小分子合成サービスの活用から最高の配位子ターゲットの画面に。
興味の蛋白質にはポリペプチドにのみ挿入できます、従来の遺伝子工学とは異なり化学の活用は、ポリペプチド、小分子化合物の表面にナノ粒子など様々 な材料を接続できる、反応サイトとして使用するシステインまたは Lys 残基がある限り、興味の蛋白質。化学活用サイトでこのような残留が、単純なシステイン/リス交換は以前の研究4で示されるように化学的にアクティブにできるように興味の蛋白質の遺伝子変更ことができます。
それを制御するには、化学の活用は共役分子と分子内反応を避けるために徹底的に勉強する必要は...

治療および診断の配信、nanotheranostics、として知られているナノサイズのベクターの開発は、ターゲットを絞った配信1に向かって一般的な治療から生物医学分野の多くをシフトしています。Theranostic 分子安定的に特定の病気にかかったティッシュまたは生化学的経路2,3,4 theranostic 分子を直接にターゲットを絞った nanotheranostic 配信統合ナノサイズ ベクトル (ナノ粒子).ナノメディシンは、最適なサイズのナノ粒子 theranostic 分子の循環を安定し、病気にかかったティッシュの提示細胞表面分子を選択的にターゲットする能力を持っているので、ターゲットを絞った配信の最前線に来ています。まだ多くの nanotheranostic プラットフォーム パッシブ セル吸収, 事前に成熟し劣化、毒性、および theranostic 分子と不十分な協会に苦しみます。群集は、ターゲットを絞った配信でこれらの障害の多くを克服します。彼らは外国のエピトープを表示および/または小さい分子を提供するナノキャリアとして使用されている: 療法は多くの病気1を戦うために使用することができます。このアプリケーションのプロパティに主に依存する特定のエンドユーザのために設計されたアプリケーションを満たすために、遺伝の修正の容易さだけでなく、自己集合。遺伝子工学と比較して、VLP に異質ペプチドの化学的活用のための重要な利点を表示多種多様なペプチドやオリゴ糖、変調の群集の表面に共役するなどのエンティティをことができますので、柔軟 VLP アセンブリの変化なし。
組換え HEV キャプシド蛋白質、2ndオープンから派生した HEVNPs フレーム (ORF2) を読んで、非感染性、カプシド セルの結合、およびエントリの対応を自己組み立てます。粘膜感染の HEV が進化したので組み立てカプシド蛋白はプロテアーゼ、酸性の粘膜条件5同様に安定です。HEVNPs は、T の中空を形成レンダリング非常に安定したストレージと過酷な生理的条件の両方、ORF2 の 60 の同一ユニット6,7から成る、1 の正二十面体キャプシドを =。任意のウイルスの遺伝的要素に欠けている、効率的、高収率生産はバキュロ ウイルス昆虫細胞発現システムによって実現されます。蛋白分解性が高く、自己組織化 HEVNPs を抽出され、細胞培養上清より精製した必要な精製工程を大幅に削減します。さらに、HEVNPs は安定した正二十面体ベースに柔軟なヒンジを介して接続されている表面の露出した突起ドメイン (P ドメイン) を所有しています。P ドメインは、融通がきく蝶番は、大幅に基本の正二十面体構造を損なうことがなく P ドメインを変更することが可能、正二十面体ベースの上に表面に露出したスパイクを形成します。化学変調 60 対称サイトで 60 の繰り返し単位、1 つのサイト固有の変更結果します。最近では、提案するナノ プラットフォーム配位子または theranostic 用小分子化学的に共役することができます HEVNP を使用して。これは、マレイミド リンク ペプチドや分子と反応サイトとして単一のアミノ酸を HEV VLP の突起ドメインのシステインに置き換えることによって達成されました。HEV VLP とよく研究免疫原性エピトープ8,9の前の構造の分析に基づいて、次の 5 HEV VLP アミノ酸に置き換えられたシステイン潜在的な候補として: Y485C、T489C、S533C、N573C、T586C (図 1)。透過電子顕微鏡 (TEM) 観察 (図 2)、によって確認されたその VLP 形成発現と昆虫細胞から精製後、公開されているシステイン サイトは西部によって分析されたビオチンのマレイミド リンク後のしみ活用 (図 2)。5 つの変異体の間で HEVNP-573 C はマレイミド ビオチン活用 (図 2) の最も強い信号を表示され、フォロー アップ4 (図 3) をターゲット乳癌細胞のナノキャリアとしてデモに使用されました。
このプロトコルは、表面システイン共役を通じて腫瘍ターゲット分子を HEVNPs にアタッチする化学の活用方法を示しています。我々 は N573 でシステインを含む組換え HEVNPs と腫瘍腫瘍配信対象と検出分子の共役の詳細 (HEVNP-573 C)。ペプチド、LXY3010 HEVNPs にフォーム LXY30 HEVNP (図 4) 乳房癌腫瘍をバインドする 2 段階クリック化学接合過程に着目しました。その後、N hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 いた HEVNPs を構築する LXY30 HEVNP Cy5.5 蛍光検出の両方生体外で(図 5) で別の Lys サイトに共役と体内4 。

<table><tbody><tr><td>MINI透析ユニット、10K MWCO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69572</td><td>mini透析ユニット</td></tr><tr><td>High Five細胞</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>Tn5細胞</td></tr><tr><td>SF9細胞&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11496015</td><td>Sf9細胞</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac バキュロウイルス発現システム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A11101, A11100</td><td>バキュロウイルス発現システム</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac バキュロウイルス発現システム</td><td>Life Technologies</td><td>10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024</td><td>Bacmid</td></tr><tr><td>ESF921 Insect Cell Media</td><td>Expression Systems LLC</td><td>96-001-01</td><td>昆虫細胞培地</td></tr><tr><td>Cy5.5 NHS エステル、5mg</td><td>Lumiprobe Corp</td><td>27020</td><td>Cy5.5 NHS エステル</td></tr><tr><td>Zeba スピン脱塩カラム、40K MWCO、0.5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>87766</td><td>スピン脱塩カラム</td></tr><tr><td>MES ハイドレート</td><td>Sigma-Aldrich Chemical Co</td><td>M8250-250G</td><td>MES</td></tr><tr><td>超透明遠心分離機 薄壁超遠心チューブ</td><td>ベックマン・コールター Inc</td> ローター<td>による</td><td>超遠心チューブ</td></tr><tr><td>NuPage 4-12% Bis-Tris タンパク質ゲル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NPO321BOX</td><td>SDS タンパク質ゲル</td></tr><tr><td>セルフェクチンII 試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10362100</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>EMS グローディスチャージャー</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td></td><td>グローディスチャージャー</td></tr></tbody></table>

化学の活用方法を使用して e 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

ウイルス様粒子 (群集) は、外国のエピトープを表示および/または小さな分子の検出と様々 な病気の治療を提供するナノキャリアとして使用されています。遺伝子組み換えは、自己組織化でこのアプリケーションが依存しているし、組換え群集の腫瘍を対象としたアプリケーションを満たすためにシステイン抱合に比べ遺伝的群集に外国のペプチッドの変更だけでも、化学の活用を提供しています、重要な利点の合成ペプチドやオリゴ糖、VLP アセンブリの変更することがなく、変調かつ柔軟に群集の表面に共役するためなどのエンティティの様々 なをことができますので。
ここでは、多機能配信キャリアとして肝炎 E ウイルス粒子 (HEVNP)、モジュール化された theranostic カプセルを使用する方法を示します。HEVNPs の機能には、組織を対象とした、イメージング、および治療薬デリバリーが含まれます。HEVNP の確立の構造調査に基づき、構造的に独立して表面に露出した残基は、チオール選択的リンケージを介してマレイミド リンク化学グループの活用サイトとしてシステイン置換に選ばれました。1 つの特定のシステイン変更 HEVNP (573 アスパラギン システイン交換 aa (HEVNP-573 C)) は乳房がん細胞特異リガンド、LXY30 共役し、近赤外線 (NIR) 蛍光色素 (Cy5.5) 腫瘍ターゲットのレンダリングにラベル付け効果的な診断カプセル (LXY30-HEVNP-Cy5.5) として HEVNPs。Theranostic 配信への応用可能性を探索するよく知られている原子の構造を持つ他の高分子複合体と同様のエンジニア リング戦略を採用できます。

HEV-群集に似ているすべて形成 HEVNPs 可溶性正二十面体のカプシドを変更し、したソリューションの製造及び精製中に集計はありません。シングル ステップ マレイミド ビオチン活用、Cys の各変更の前後に HEVNPs は否定的な汚れの EM (図 2) で HEV 群集から区別されました。マレイミド ビオチン活用効率 Cys 修正 HEVNPs 最初化学発光ストレプトアビジン結合を介してウェスタンブロットでテストされました。次のマレイミド ビオチン共役, システイン表示 HEVNPs ストレプトアビジン結合信号 (図 2) に変更。
効果的な二段システイン抱合を活用を行った順序によって影響を受けていた。Α3β1 インテグリンは乳癌腫瘍細胞、合成リガンド LXY30、発現されるため α3β1 に特定の親和性では、<sup clas...

我々 は、theranostic ナノ粒子 (HEVNP) として肝炎 E のウイルスのカプシド蛋白を設計しました。HEVNP 自己粘膜配信で安定した正二十面体のケージにアセンブルします。ここでは、表面に露出したシステインは、とりわけ腫瘍細胞を結合する配位子の合成を共役残基の変異を対象とした腫瘍に対する HEVNPs の変更について述べる。

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

HEVナノ粒子の表面を化学的に機能化させる全体の目的は、診断および治療目的で、標的となる免疫原性分子、治療分子、および診断分子をHEVナノ粒子の表面に結合させるための、再現性および一貫性のある手法を提供することです。この手法は、がんへのターゲティングの強化やナノ治療薬の分布をどのようにモニタリングできるかといった、ナノメディシン分野における重要な課題への回答に寄与します。この技術の主な利点は、遺伝子工学的な手法と比較して、再現性が高く効率的であり、はるかに容易に達成できる点にあります。手順の実演は、当研究室のリサーチアシスタントであるMichelle NguyenとIvan Ruizが行います。テキストプロトコルに記載されているE型肝炎ウイルスナノ粒子の作製および精製から、本プロトコルを開始してください。TEM観察のため、HEVナノ粒子試料を10 mM MES（pH 6.2）を用いて0.5から2 mg/mLに希釈します。カーボンコートグリッドを40 mAで30秒間グロー放電処理し、親水性のカーボン表面を作成します。グリッドの親水性表面は、グロー放電処理後30分間しか維持されません。イオン化後、グリッドとピンセットを保持し、HEVナノ粒子試料を2 µLグリッドに滴下します。15～30秒後、フィルターペーパーでグリッドをブロットします。次に、直ちに二回蒸留水でグリッドを洗浄し、再びフィルターペーパーでブロットします。直ちに2%ウラニル酢酸を2 µL、グリッドに滴下します。15秒後、フィルターペーパーでグリッドをブロットします。サンプルグリッドを電子除湿ドライキャビネットに入れ、一晩置いて乾燥させます。サンプルによっては、構造の可視化および特性評価にクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）が必要となる場合があります。グリッドをTEMに導入し、10〜80Kの倍率で観察します。HEVナノ粒子は、ウイルスRNAが存在しないため、TEMでは直径約27 nanometersの空の正二十面体タンパク質として観察されます。HEVナノ粒子とマレイミド結合ビオチンのワンステップ結合を行うには、まずHEVナノ粒子をミニ透析ユニットに適用します。製造元のプロトコルに従い、0.01 molar PBS pH 7.4を用いて室温で1時間、ナノ粒子の透析を行います。透析後、HEVナノ粒子を1.5 milliliterチューブに移し、分光光度計を用いて280 nanometersにおけるタンパク質濃度を測定します。1 mg/mLのナノ粒子に、100 micromolarマレイミド-ビオチンと0.01 molar PBS pH 7.4を等量ずつ混合し、モル比を1:5にします。4 °Cで一晩反応させた後、製造元のプロトコルに従い、スピン脱塩カラムの手順で未結合のマレイミド-ビオチンを除去します。標準的な還元SDS-PAGEを用いてサンプルを分析します。標準的な手順に従い、HRP標識ストレプトアビジンを用いて化学発光ウェスタンブロットを行い、X線フィルムで化学発光シグナルをキャプチャします。乳がん細胞特異的リガンドLXY30をHEVナノ粒子の表面に露出したシステインに2段階で結合させるには、まずナノ粒子を小型透析ユニットに入れ、室温で0.01 M PBS pH 7.4に対して1時間透析します。次に、HEVナノ粒子を1.5 mLチューブに移し、分光光度計を用いて280 nmでのタンパク質濃度を測定します。続いて、650 µMのマレイミド-アジドと650 µMのアルキン-LXY30を、200 µMの硫酸銅および1 mMのアスコルビン酸と混合します。これにより、650 µMのマレイミド結合LXY30が形成されます。この混合物を4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、1 mg/mLに調整したHEVナノ粒子に、1:3のモル比になるよう約10%容量のマレイミド結合LXY30を混合します。4 °Cで一晩反応させます。マレイミドLXY30の濃度が比較的高いため、混合後の硫酸銅などの反応物の最終濃度は約10分の1に減少します。H型肝炎ウイルスナノ粒子への損傷を避けるための別の選択肢として、銅フリーの結合法があります。メーカーのプロトコルに従い、スピン脱塩カラムを用いて未結合のマレイミドクリックLXY30を除去します。LXY30結合HEVナノ粒子は4 °Cで保存してください。LXY30 HEVナノ粒子とCy5.5蛍光タグのワンステップ抱合を行うには、まず1 mg/mLに調整したLXY30結合ナノ粒子に、モル比が1:5となるよう同量のCy5.5蛍光タグを混合します。混合液を4 °Cで一晩反応させた後、メーカーのプロトコルに従い、スピン脱塩カラムの手順で未結合のCy5.5 NHSを除去します。LXY30 Cy5.5結合HEVナノ粒子は4 °Cで保存してください。腫瘍細胞標的に向けたHEVナノ粒子のLXY30機能化において、2つの方法を試みました。まずHEV 573Cナノ粒子をマレイミド・アジドに結合させ、次いでLXY30アルキンとのクリック化学反応を行ったところ、TEM観察においてHEV 573Cナノ粒子が崩壊しているように見えました。しかし、最初にLXY30-アルキンとマレイミド-アジドの間でクリック化学反応を行い、マレイミド結合LXY30を形成させた後、これを修飾済みHEVナノ粒子に接合させる方法では、構造に影響はなく、HEV 573Cナノ粒子は元の形態を維持していました。LXY30およびCy5.5結合HEVナノ粒子を培養した乳がん細胞に適用し、共焦点顕微鏡で観察しました。共焦点顕微鏡による近赤外蛍光画像から、LXY30 Cy5.5結合HEVナノ粒子は、Cy5.5結合HEVナノ粒子と比較して、MDA MB-231乳がん細胞に対してより高い結合親和性を持ち、細胞内への取り込みが増加していることが示されました。この手法の意義は、正常細胞に損傷を与えることなく、腫瘍の正確な標的化および診断を可能にするマルチモーダル標的化および治療分子の検討にまで及びます。本手法は、化学的な表面修飾を通じて癌および腫瘍の標的化に関する知見を提供できるだけでなく、癌の早期診断、スクリーニング、およびイメージング誘導治療にも適用可能です。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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