Name: マウス脂肪組織の採取と RNA 解析のための処理 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学ぶマウス白色脂肪組織の採取と高品質RNA抽出法。遺伝子改変マウスを用いた代謝・生化学研究に適し、低RNA含量の脂肪組織から高収量のRNAを分離できる信頼性の高い手法です。

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著者が明らかに何もありません。

次 HF 食事供給、肥満マウスは体と白色脂肪組織重量 N 飼料飼育マウスと比較して増加するいると見つけられました。フェノール溶液を使用して抽出した RNA 純度の良い試料が得られました。レプチンは主に脂肪組織によって生成、アデポカイン、脂肪質量16と正の相関が知られています。予想通り、自分の脂肪の塊な肥満マウスにおけるレプチン mRNA の発現が増加しました。
このメソッドは、いくつかの重要な手順です。主要である別の 1 つの白色脂肪組織のデポの汚染さまざまな機能2,5を別の脂肪組織の拠点にいる知られています。汚染は、下流のアプリケーションで、誤解を招く結果をもたらすことができます。さらに、脂肪は、一度マウスの間に定期的かつ一貫したペースで白色脂肪組織を収集、空気との接触に乾燥する傾向があるお勧めかどうか重量は取られる必要があります。そうでなければ、脂肪パッドの総重量は正しいかもしれない。最近公開された MIQE、次の...

肥満はタイプ 2 の糖尿病1などの合併症につながることが世界的に流行です。食餌誘導性肥満と遺伝子組み換え動物モデルは、肥満とその関連する合併症で研究に頻繁に使用されます。通常、白色脂肪組織は余分なエネルギーのための収納スペースとして知られている、脂質の構成は主にエネルギーに変える褐色脂肪組織熱2,3間。脂肪組織は動的と拡大し、食品の摂取量、身体活動など多くの要因によって縮小します。したがって、これらの変更に貢献の要因を決定する適切な脂肪組織の採取と処理が必要な4 です。
白色脂肪組織の間で、皮下脂肪および内臓脂肪質のターミナルを解剖学的局在など異なるプロパティを持つ機能2、5それを一般に認められます。その結果、矛盾する結果や大規模な変動を避けるためには、注意を脂肪パッドを収集するときこれらの異なる脂肪質のターミナル間の交差汚染を避けるために取られる必要があります。
また、白いマウス脂肪組織からタンパク質や RNA を隔離するときの 3 つの主要な課題があります。まず、肥満マウスの脂肪パッドを収集別の白い脂肪質のターミナルを隔てる境界線は常に明確で心6腎臓など他の臓器とは対照的ではない、簡単な作業ではありません。第二に、RNA または蛋白質の分離の間に、脂肪の高い脂質含量のため、脂質の層の上に浮かぶし、サンプルに直接アクセスできなくなります。第三に、褐色脂肪組織や他の組織ではなく白色脂肪組織は RNA および蛋白質含量がかなり低いとこれは若いマウスを使用する場合の大きな懸念材料は、投与されたマウスは通常の (N) 食事あり、マウスが期待される低脂肪塊 (すなわちKO モデル、薬物による治療は運動トレーニングなど)。7,8。
したがって、脂肪組織からの RNA を隔離する適切な方法を選択することは重要です。フェノール/クロロホルム抽出する別の方法は、商業キットです。彼らは通常列9の RNA の浄化に続いて、初期のフェノール抽出手順に基づいています。しかし、これらのキット通常より高価なと RNA の品質は、変数かもしれない低い収率のサンプルを与えるより時間がかかる。ただし、フェノールのソリューション/クロロホルム抽出ここで説明する最も大きな利点の 1 つは単一のサンプル10からの蛋白質、DNA、RNA を分離する可能性です。マウス脂肪パッドは、通常小さい (無駄のないマウス モデル) を中心に少量の RNA および蛋白質を与えるので、これらのプロトコルは、小さなサンプル 1 つ得ることができるデータを最大化します。
本稿の目的は、白い 3 つのマウス脂肪組織拠点と同様の RNA の隔離の質と量から適切なサンプル収集を確保する方法を詳しく説明するようです。このプロトコルに従うことによって得られる RNA は、リアルタイム PCR の試金を実行する使用できます。このプロトコルは培養された主な脂肪細胞からの RNA の隔離のためのものではありません。

<table><tbody><tr><td>1 mL seringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X TE 溶液 (10 mM Tris-HCl および 1 mM EDTA&bull;Na2.pH 8.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 G 針</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>26 G 針</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブロックヒーター (ドライバス)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ</td><td>C2432-500mL</td><td></td></tr><tr><td>dATP&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>R0141</td><td></td></tr><tr><td>dCTP&nbsp;&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>dGTP&nbsp;&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0161</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (1 U/&micro;l)&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dTTP&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0171</td><td></td></tr><tr><td>Faststart Universal SYBR green Master (Rox)</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td></td></tr><tr><td>Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>フィルターチップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鉗子&nbsp;</td><td>Instrumentarium</td><td>HB275</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハンマー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高脂肪げっ歯類ダイエット</td><td>Bio-Serv、フレンチタウン、ニュージャージー</td>州<td>F3282</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール&nbsp;</td><td>ラボラトリー MAT</td><td>IH-0101</td><td></td></tr><tr><td>レプチン フォワード PCR プライマー (5'-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>レプチン リバース PCR プライマー (5'-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxima 逆転写酵素 (酵素および 5x バッファー)</td><td>Thermo scientific</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>ナノ純水(超純水と呼ばれる)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニトリル検査用手袋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニトリル手袋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>通常のげっ歯類の食事</td><td>Harlan Laboratories, Madison, WI</td><td>Harlan 2018</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20ピペットマン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200ピペットマン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェノール溶液(トリゾール)&nbsp;</td><td>アンビオンライフテクノロジー</td><td>ズ15598018</td><td></td></tr><tr><td>事前に識別されたアルミホイ</td><td></td><td></td><td></td></tr>ル <tr><td>クォーツ分光光度計</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCRチューブストリップ</td><td></td><td></td><td></td>用ラック</tr><tr><td>RT-PCRチューブストリップ</td><td></td><td></td><td></td>用ラック</tr><tr><td>ランダムヘキサマー&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>58875</td><td></td></tr><tr><td>リアルタイム PCR ローター遺伝子システム&nbsp;</td><td>Corbett research</td><td>RG-3000 Rotor-Gene サーマルサイクラー</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵ベンチトップ遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 1.5 mL スクリューキャップチューブ</td> RNase-free <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR チューブストリップ (0.2 mL) &</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR machine</td><td>Qiagen</td><td>Rotor-Gene Corbett 3000</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR チューブストリップ (0.1 mL) とキャップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 フォワード PCR プライマー (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 リバース PCR プライマー (5'ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3')10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼の乳鉢と乳棒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手術用パッド</td><td>ホームは使い捨ての吸収性アンダーパッド</td><td></td><td></td>で包まれた発泡スチロール板を作りました</tr><tr><td>外科用ハサミ&nbsp;</td><td>Intrumentarium</td><td>130.450.11</td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー&nbsp;</td><td>Biometra</td><td>Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>計量スパチュラ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス脂肪組織の採取と rna 解析のための処理

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

他の組織と比較して、白色脂肪組織は、脂質がほとんど含まれているのでは、下流用リアルタイム PCR および西部のしみなどかなり少ない RNA および蛋白質内容です。これらの脂質を避けるために余分な手順が必要と脂肪組織サンプルからの RNA の隔離も挑戦します。これらのサンプルを処理し、RNA の隔離を実行するマウスから 3 つの異なる解剖学的白色脂肪組織を集めるための手順を紹介します。さらにリアルタイム PCR を用いた cDNA や遺伝子発現実験の合成について述べる。ここに記載されているプロトコルには、動物の毛や組織コレクション中に別の脂肪パッド間の交差汚染と同様、脂肪パッド上の血からの汚染の削減ができます。また、抽出した RNA の十分な量と質を確保するため最適化されています。このプロトコル脂肪組織サンプル、リアルタイム PCR など日常の実験に必要な任意のマウスのモデルに広く応用することができますが、主な脂肪細胞培養からの分離のためのものではありません。

剖検手順に従って 3 つの白色脂肪組織は収集されマウス (N と HF 食飼育マウス) の 2 つのグループから加重します。予想通り、心不全の食事療法のマウスは最終的な体重と同腹子 N ダイエット (表 1) と比較して体重を増加していた。これらの観察と一緒に伴われたよりも N 食事のものと比較して肥満マウスの PGF、PRF、および SCF の体重の 2 倍増加します。
隔離された RNA で実験を実行する前にその純度は手順 4.9 を評価しました。それぞれの白色脂肪組織のフェノール溶液による RNA の隔離は RNA (表 2) の純粋として考慮される OD260/OD280 が 2.0 前後比として十分な品質でサンプルを生産しました。リアルタイム PCR のデータは、レプチン mRNA 発現も PGF、PRF、N 食事 (図 4</str...

本稿の目的は、マウスから異なる白色脂肪組織を収集、脂肪質のサンプルを処理および RNA を抽出する手順を提示することです。

マウス脂肪組織の採取と RNA 解析のための処理

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

この手順の全体的な目標は、さまざまなマウスからの白色脂肪組織デポの適切なサンプル収集を確保し、組織から高品質のRNAを大量に分離することです。この方法は、代謝、生化学、分子生物学の分野における重要な疑問に答えることができます。例えば、治療したマウスや遺伝子組み換えマウスの脂肪組織における遺伝子発現に関連するものなどです。この技術の主な利点は、通常、RNA含有量が低い脂肪組織から大量の良質なRNAを単離できることです。その手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるエミリー・ピピンです。マウスを安楽死させた後、テキストプロトコルに従って白濁線の上の皮膚を切断し、胸郭の中央から右腕に向かって約2センチメートルの2つの切開を行い、右後肢の上の生殖器の近くに挿入します。開いた皮膚の片方の角を伸ばし、22ゲージの針を使用してパッドに固定します。次に、もう一方の角をピンで留めます。手術用ハサミを使用して、できるだけ平らに皮膚に当てて、腹部皮下脂肪(SCF)の鈍的解剖を行い、それを事前にカットされたアルミホイル片に移します。動物の左側についても解剖を繰り返します。次に、左右に集めた脂肪パッドをアルミホイルに引っ張り、液体窒素を使用してサンプルを凍結します。内臓脂肪組織にアクセスするには、白筋に沿って腹筋を切断します。次に、腹筋を性器からマウスの両側の後ろに向かって切開します。生殖器官の周りの脂肪は、性腺周囲脂肪、またはPGFです。精巣上体、精巣、精管から左右の脂肪パッドをはがし、事前にラベル付けされたアルミホイルに移します。次に、サンプルを液体窒素で凍結します。左側から始めて、腸を腹腔から右側に移動して腎臓を露出させます。ここで腎臓と副腎を取り巻く脂肪組織は、腎周囲脂肪、またはPRFです。彼らは脂肪組織よりも少しピンク色であるため、これは面倒な場合があります。次に、PRFを背中の筋肉壁から分離し、PRFと腎臓を体の他の部分から分離する尿管、腎動脈、静脈を切断します。次に、腎嚢を切断して除去することにより、PRFを腎臓から分離します。右のPRFを単離した後、左側から組織と一緒にサンプルをアルミホイルに移し、液体窒素を使用してサンプルを凍結します。テキストプロトコルに従って、1.5ミリリットルのRNaseフリーコニカルチューブ、乳鉢と乳棒、ヘラを液体窒素で冷やします。脂肪組織サンプルを乳鉢に入れ、茶色の紙を数層使用して乳棒を液体窒素から持ち上げ、乳鉢に取り付けます。杵を紙で持ったまま、ハンマーを使って杵の上部を1〜2回叩きます。次に、微粉末が得られるまで回転運動を使用してサンプルを粉砕します。次に、乳棒を取り外し、液体窒素からへらを取り出し、それを使用してサンプルを対応する事前に冷却した1.5ミリリットルの円錐管に移します。サンプルが溶けるのを防ぐために、スパチュラを時々液体窒素に戻します。また、サンプルが解凍するのを防ぐために、円錐形のチューブをドライアイスの上に置いてください。コニカルチューブを約2/3の容量まで粉砕サンプルで満たし、適切なRNA収量を得ます。次に、テキストプロトコルに従って残りのサンプルを準備します。化学フードの下に、白衣、手袋、安全メガネを着用して、液体窒素から粉砕サンプルを取り出します。チューブをゆっくりと開き、500マイクロリットルのフェノール溶液を追加します。チューブの蓋を閉め、最高速度で約5秒間渦巻き、その後、チューブをゆっくりと慎重に開いて窒素から圧力を解放します。チューブから空気が出てくる音が聞こえます。さらに500マイクロリットルのフェノール溶液をチューブにピペットで入れます。その後、渦を巻いて、前と同じようにゆっくりと開きます。サンプルが完全に溶解するまでボルテックスします。次に、追加のサンプルを処理する前に、チューブを開いて圧力を解放します。すべてのサンプルを処理したら、最大速度で短時間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートします。チューブをGの12, 000倍、摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、チューブを室温に戻します。コンタミネーションを避けるために、各サンプルについて、チップがろ過されたP1000ピペットを使用して、チューブの側面近くの脂質相を突き刺すことにより、中央のピンク層からできるだけ多くのRNAを分離します。RNAをチューブの側面に触れずに新しい円錐形チューブに分注し、チップの外側に存在する脂質の移動を防ぎます。各サンプルに200マイクロリットルの純粋なクロロホルムを加え、チューブを反転して15秒間混合します。次に、サンプルを室温で10分間インキュベートした後、チューブを12,000倍のGおよび摂氏4度で15分間遠心分離し、チューブを室温に戻します。各サンプルについて、P1000ピペットとフィルター付きチップを使用して、透明RNAを含む水性トップフェーズをできるだけ多くの水性透明RNAチューブの2番目のセットに移します。次に、各サンプルに500マイクロリットルの100%イソプロパノールを加え、チューブを15秒間反転して混合します。次に、サンプルを室温で10分間インキュベートします。チューブを室温に戻す前に、Gと摂氏4度の12,000倍で10分間チューブを遠心分離します。イソプロパノールを各チューブから注ぎ出して廃棄します。次に、各サンプルに1ミリリットルの75%エタノールを加え、チューブを最大速度で短時間ボルテックスします。次に、サンプルをGの7,500倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。サンプルを回転させて室温に戻した後、各チューブを反転させ、茶色の紙に軽くたたいて照明を当てて75%エタノールを廃棄し、残留エタノールを除去します。蓋を開けたままにして、RNAペレットを約15〜20分間風乾します。RNAペレットのサイズを評価した後、各サンプルに10〜25マイクロリットルのRNaseフリー水を加えます。サンプルを摂氏60度のヒートブロックで5分間インキュベートします。次に、チューブを短時間渦巻きにします。サンプルを同じヒートブロックでさらに5分間インキュベートします。次に、すべてのサンプルをすばやく回転させ、すぐに氷の上に置きます。脂肪組織での遺伝子発現のためのRT-PCRをテキストプロトコルに従って実施します。予想通り、高脂肪食を摂取したマウスは、通常の飼料を摂取した同腹仔と比較して、体重と体重増加が増加しました。これらの観察結果により、肥満マウスのPGF、PRF、およびSCFの体重は、通常の食事を摂取したマウスと比較して2倍以上増加しました。この表は、各白色脂肪組織について、フェノール溶液によるRNA単離により、OD280よりもOD260が約2.0の試料を生成したことを示しています。これはRNAとしては純粋であると考えられています。この棒グラフに見られるように、リアルタイムのPCRデータによると、肥満マウスのPGF、PRF、SCFでは、通常の食事を摂取したマウスと比較して、レプチンmRNAの発現が有意に高かったことが示されています。レプチンmRNA発現に観察された違いは、s16の変動によるものではなく、CT値が変更されなかったため、マウスの2つのグループ間で結果を正規化するために使用された参照遺伝子でした。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば4時間で完了します。この手順を試みる際には、RNA抽出手順中にRNaseフリーの環境で作業することを忘れないでください。この手順に続いて、遺伝子発現修飾などの追加の質問に答えるために、リアルタイムPCR増幅などの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、代謝の分野の研究者がげっ歯類の肥満と糖尿病に関連する脂肪組織の調節を探求する道を開きました。このビデオを見た後、さまざまな脂肪パッドを分離し、それらからRNAを分離する方法をよく理解しているはずです。フェノール溶液の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、白衣や手袋を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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液体窒素冷凍庫ミルを用いてマウス足を処理する極低温粉砕法を開発し、組織から抽出されたRNAまたはタンパク質の収率と品質を向上させ、炎症に関連する分子プロファイルの解析を可能にした。応答。...

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この手順は、安価で一般的に入手可能なツールを使用して高品質のタンパク質およびRNAを得るために離散的な凍結脳領域のコレクションを記述する。...

下流解析のための凍結げっ歯類の脳領域の収集

この出版物は、成熟したアディポサイトからの核の単離、蛍光活性化分類による精製、および単一細胞レベルのトランスクリプトミクスのためのプロトコルを記述する。...

単細胞ゲノムアプリケーションのための脂肪組織核の分離

このプロトコルは脂肪細胞から良質のRNAを得る方法論および流れのcytometryによって分析のための多数の膜区切られたマーカーの汚損によってSVFマクロファージの表現型化を含む単一のプロセスの人間の内臓の脂肪からの生存可能な脂肪細胞そして間質の管の部分SVFのセルの隔離に有効なコラゲナーゼの消化力方法を提供する。...

RNA解析およびマクロファージ表現型解析に適したヒト内臓脂肪組織からの生存脂肪細胞および間質血管画分の単離

ここでは、マウスの鎖骨上褐色脂肪組織の組織学的および遺伝子発現解析を解剖および実行するための実用的な手順を提供します。...

マウス鎖骨上褐色脂肪組織の解剖、組織学的処理、遺伝子発現解析

本プロトコルは、パラホルムアルデヒド固定および最適切断温度化合物埋め込みマウス肝組織の定義された組織領域からRNAをレーザーキャプチャマイクロ解剖を用いて単離し、ターゲットを絞った下流遺伝子発現解析を可能にする方法を説明しています。...

パラホルマルデヒド固定マウス肝組織のレーザーキャプチャ顕微解剖によるRNA解析

学ぶマウス白色脂肪組織の採取と高品質RNA抽出法。遺伝子改変マウスを用いた代謝・生化学研究に適し、低RNA含量の脂肪組織から高収量のRNAを分離できる信頼性の高い手法です。

マウス脂肪組織の採取と RNA 解析のための処理

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