マウス脂肪組織の採取と RNA 解析のための処理

この手順の全体的な目標は、さまざまなマウスからの白色脂肪組織デポの適切なサンプル収集を確保し、組織から高品質のRNAを大量に分離することです。この方法は、代謝、生化学、分子生物学の分野における重要な疑問に答えることができます。例えば、治療したマウスや遺伝子組み換えマウスの脂肪組織における遺伝子発現に関連するものなどです。この技術の主な利点は、通常、RNA含有量が低い脂肪組織から大量の良質なRNAを単離できることです。

その手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるエミリー・ピピンです。マウスを安楽死させた後、テキストプロトコルに従って白濁線の上の皮膚を切断し、胸郭の中央から右腕に向かって約2センチメートルの2つの切開を行い、右後肢の上の生殖器の近くに挿入します。開いた皮膚の片方の角を伸ばし、22ゲージの針を使用してパッドに固定します。

次に、もう一方の角をピンで留めます。手術用ハサミを使用して、できるだけ平らに皮膚に当てて、腹部皮下脂肪(SCF)の鈍的解剖を行い、それを事前にカットされたアルミホイル片に移します。動物の左側についても解剖を繰り返します。

次に、左右に集めた脂肪パッドをアルミホイルに引っ張り、液体窒素を使用してサンプルを凍結します。内臓脂肪組織にアクセスするには、白筋に沿って腹筋を切断します。次に、腹筋を性器からマウスの両側の後ろに向かって切開します。

生殖器官の周りの脂肪は、性腺周囲脂肪、またはPGFです。精巣上体、精巣、精管から左右の脂肪パッドをはがし、事前にラベル付けされたアルミホイルに移します。次に、サンプルを液体窒素で凍結します。

左側から始めて、腸を腹腔から右側に移動して腎臓を露出させます。ここで腎臓と副腎を取り巻く脂肪組織は、腎周囲脂肪、またはPRFです。

彼らは脂肪組織よりも少しピンク色であるため、これは面倒な場合があります。次に、PRFを背中の筋肉壁から分離し、PRFと腎臓を体の他の部分から分離する尿管、腎動脈、静脈を切断します。次に、腎嚢を切断して除去することにより、PRFを腎臓から分離します。

右のPRFを単離した後、左側から組織と一緒にサンプルをアルミホイルに移し、液体窒素を使用してサンプルを凍結します。テキストプロトコルに従って、1.5ミリリットルのRNaseフリーコニカルチューブ、乳鉢と乳棒、ヘラを液体窒素で冷やします。脂肪組織サンプルを乳鉢に入れ、茶色の紙を数層使用して乳棒を液体窒素から持ち上げ、乳鉢に取り付けます。

杵を紙で持ったまま、ハンマーを使って杵の上部を1〜2回叩きます。次に、微粉末が得られるまで回転運動を使用してサンプルを粉砕します。次に、乳棒を取り外し、液体窒素からへらを取り出し、それを使用してサンプルを対応する事前に冷却した1.5ミリリットルの円錐管に移します。

サンプルが溶けるのを防ぐために、スパチュラを時々液体窒素に戻します。また、サンプルが解凍するのを防ぐために、円錐形のチューブをドライアイスの上に置いてください。コニカルチューブを約2/3の容量まで粉砕サンプルで満たし、適切なRNA収量を得ます。

次に、テキストプロトコルに従って残りのサンプルを準備します。化学フードの下に、白衣、手袋、安全メガネを着用して、液体窒素から粉砕サンプルを取り出します。チューブをゆっくりと開き、500マイクロリットルのフェノール溶液を追加します。

チューブの蓋を閉め、最高速度で約5秒間渦巻き、その後、チューブをゆっくりと慎重に開いて窒素から圧力を解放します。チューブから空気が出てくる音が聞こえます。さらに500マイクロリットルのフェノール溶液をチューブにピペットで入れます。

その後、渦を巻いて、前と同じようにゆっくりと開きます。サンプルが完全に溶解するまでボルテックスします。次に、追加のサンプルを処理する前に、チューブを開いて圧力を解放します。

すべてのサンプルを処理したら、最大速度で短時間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートします。チューブをGの12, 000倍、摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、チューブを室温に戻します。

コンタミネーションを避けるために、各サンプルについて、チップがろ過されたP1000ピペットを使用して、チューブの側面近くの脂質相を突き刺すことにより、中央のピンク層からできるだけ多くのRNAを分離します。RNAをチューブの側面に触れずに新しい円錐形チューブに分注し、チップの外側に存在する脂質の移動を防ぎます。各サンプルに200マイクロリットルの純粋なクロロホルムを加え、チューブを反転して15秒間混合します。

次に、サンプルを室温で10分間インキュベートした後、チューブを12,000倍のGおよび摂氏4度で15分間遠心分離し、チューブを室温に戻します。各サンプルについて、P1000ピペットとフィルター付きチップを使用して、透明RNAを含む水性トップフェーズをできるだけ多くの水性透明RNAチューブの2番目のセットに移します。次に、各サンプルに500マイクロリットルの100%イソプロパノールを加え、チューブを15秒間反転して混合します。

次に、サンプルを室温で10分間インキュベートします。チューブを室温に戻す前に、Gと摂氏4度の12,000倍で10分間チューブを遠心分離します。イソプロパノールを各チューブから注ぎ出して廃棄します。

次に、各サンプルに1ミリリットルの75%エタノールを加え、チューブを最大速度で短時間ボルテックスします。次に、サンプルをGの7,500倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。サンプルを回転させて室温に戻した後、各チューブを反転させ、茶色の紙に軽くたたいて照明を当てて75%エタノールを廃棄し、残留エタノールを除去します。

蓋を開けたままにして、RNAペレットを約15〜20分間風乾します。RNAペレットのサイズを評価した後、各サンプルに10〜25マイクロリットルのRNaseフリー水を加えます。サンプルを摂氏60度のヒートブロックで5分間インキュベートします。

次に、チューブを短時間渦巻きにします。サンプルを同じヒートブロックでさらに5分間インキュベートします。次に、すべてのサンプルをすばやく回転させ、すぐに氷の上に置きます。

脂肪組織での遺伝子発現のためのRT-PCRをテキストプロトコルに従って実施します。予想通り、高脂肪食を摂取したマウスは、通常の飼料を摂取した同腹仔と比較して、体重と体重増加が増加しました。これらの観察結果により、肥満マウスのPGF、PRF、およびSCFの体重は、通常の食事を摂取したマウスと比較して2倍以上増加しました。

この表は、各白色脂肪組織について、フェノール溶液によるRNA単離により、OD280よりもOD260が約2.0の試料を生成したことを示しています。これはRNAとしては純粋であると考えられています。この棒グラフに見られるように、リアルタイムのPCRデータによると、肥満マウスのPGF、PRF、SCFでは、通常の食事を摂取したマウスと比較して、レプチンmRNAの発現が有意に高かったことが示されています。レプチンmRNA発現に観察された違いは、s16の変動によるものではなく、CT値が変更されなかったため、マウスの2つのグループ間で結果を正規化するために使用された参照遺伝子でした。

このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば4時間で完了します。この手順を試みる際には、RNA抽出手順中にRNaseフリーの環境で作業することを忘れないでください。この手順に続いて、遺伝子発現修飾などの追加の質問に答えるために、リアルタイムPCR増幅などの他の方法を実行できます。

その開発後、この技術は、代謝の分野の研究者がげっ歯類の肥満と糖尿病に関連する脂肪組織の調節を探求する道を開きました。このビデオを見た後、さまざまな脂肪パッドを分離し、それらからRNAを分離する方法をよく理解しているはずです。フェノール溶液の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、白衣や手袋を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。