Name: 新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学ぶレーザー捕捉微解剖法を用いてマウス大腿骨から骨細胞特異的な高品質RNAを抽出する技術。遺伝子発現解析に応用でき、骨生物学研究や疾患モデル解析に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、彼らの優れた技術的な助けだけでなく、彼らのサポートのためのVetcoreと動物ケアスタッフのためのUte ZeitzとニコルGinnerに感謝します。

マウスの骨組織は、動物のケアのための一般的なガイドラインに厳密に従って使用され、動物の苦しみを最小限に抑えるためにすべての努力がなされました。
1. 動物と凍結埋め込み
<ol><li>一定の室温(RT;24°C)および食糧および水への自由なアクセスが付いている12時間の光/12 h暗い周期の条件の家の動物。 注:本研究における骨組織は、生後3ヶ月の雄野生型C57BL/6マウスから得られた。</li>
	<li>壊死では、全身麻酔下の腹部静脈カバからマウスを駆除する(ケタミン/キシラジン、100/6mg/kg腹腔内)。 注:RNAの劣化を避けるために、RNaseフリーの器具や材料を使用し、手袋を着用し、実験全体を通してRTでサンプルの保管を迅速に回避します。</li>
	<li>大腿骨全体を素早く取り除き、メスとペーパータオルを使用して周囲の軟部組織をきれいにします。最適な切断温度(OCT)化合物を埋め込み金型に注ぎ、大腿骨を埋め込み金型の底部に入れます。液体窒素中のサンプルをスナップフリーズします。OCTはRTで透明で、凍結時は白色です。</li>
	<li>完全に凍結したら、サンプルをホイルで包み、ドライアイスで-80°Cに移します。さらに処理するまで-80°Cでサンプルを保存します。 注:プロトコルはここで一時停止できます。</li>
</ol>2. セクションの準備
<ol><li>クライオスタットの温度を-19 °C に設定し、ブロックホルダーの温度を -17 °C に設定します。70%エタノールを使用してクライオスタット内部を拭きます。硬いティッシュ、ガラススライド、フィッティングツールをクライオスタットに入れて冷却します。断面の間、クライオスタットの中に入れておいてください。</li>
	<li>ドライアイス上の凍結組織ブロックをクライオスタットに移し、少なくとも10分間平衡化させます。 注:凍結切除のために-80 °Cから-19 °Cまで1ブロックの繰り返し解凍と頻繁なサイクリングを避けてください。</li>
	<li>埋め込み金型の底部を押して、OCT ブロックを金型から押し出します。ブロックホルダーに十分なOCT培地を塗布し、ブロックに付着します。OCT メディアが完全に凍結されるまで待ちます。</li>
	<li>ブロックホルダーをオブジェクトホルダーに入れ、所定の位置に締めます。ブレードの位置を調整し、15 μm の切断増分を使用してブロックをトリムし、サンプルを覆うOCT を除去します。サンプルが以前に切断され、表面が空気にさらされた場合は、ブロックから最初の2−3組織セクションを破棄します。</li>
	<li>クライオスタットを調整して8 μmの断面を生成し、廃棄される2−3の凍結切片を切断します(最初の数は通常8μmより厚くなります)。粘着フィルムをブロック上に置き、フィッティングツールを使用してフィルムをブロックに付着させます。フィルムによってセクションを保持し、ゆっくりと一定の速度でカットを行います。</li>
	<li>サンプルの解凍を避けるために、フィルム(サンプルを上向き)をあらかじめ冷却されたガラススライド(クライオスタット内のクライオバー上)に直ちに置きます。テープを使用して、汚れを落としやすくするためにフィルムをガラススライドに固定します。染色プロトコルを直ちに続行します。</li>
</ol>3. ラピッド染色プロトコル
<ol><li>50 mLチューブで以下の溶液の40 mLを準備し、氷の上に置きます:95%エタノール、RNaseフリー水、100%エタノール、100%エタノール、100%キシレン。氷上のすべてのステップを実行します(染色を除く)。実験日ごとに、RNaseフリー水で新鮮なすべての水性試薬を準備します。 注意:キシレンによる中毒を避けるためにフードで作業します。</li>
	<li>95%エタノールで30sの切片をインキュベートし、その後、LCMおよび下流のアプリケーションを妨げる可能性があるOCTを慎重かつ完全に除去するために、RNaseフリー水でセクション30sを浸します。</li>
	<li>市販のLCM凍結部染色(材料表)を50μLの断面に塗布し、RTで10sをインキュベートし、スライドの端を吸収性ティッシュペーパー上に置いて排水します。100%エタノールで30sをすすいで余分な汚れを取り除きます。</li>
	<li>30秒の100%エタノールで第2のチューブに骨片を浸し、30秒の100%キシレンに移します。</li>
	<li>サポートとして、乾いたガラススライドに粘着フィルム(上向きのサンプル)を置きます。フィルムが影響を受け、可能な限り平らに配置されていないことに注意してください。サンプルを完全に乾燥させないようにしてください。</li>
	<li>その上にPET膜フレームスライドを置きます。まもなく、フィルム上の手袋の指を押してフィルムに取り付けます。その後、試料を膜と粘着フィルムの間に挟み込みます。粘着フィルムは折りたたんだりしわを付けたりするべきではないし、フィルムと膜の間に気泡があってはならない。LCM に直ちに進みます。</li>
</ol>4. レーザーキャプチャマイクロディスセクション
<ol><li>表面デコンタミタン(材料の表)を使用してRNaseからステージとキャップホルダーをきれいにします。スライドホルダーとキャップホルダーにそれぞれスライドとキャップをロードします。</li>
	<li>フォーカスを調整し、1.25倍の目標でスライドの概要を取得します。40倍の目標に変更し、フォーカスを調整します。スライドの概要を使用して、対象領域を選択します。次のようにレーザーパラメータを調整します: 絞り, 7;レーザーパワー、60;速度, 5;パルス周波数、201;標本バランス、20。これらのパラメータを目的ごとに最適化します。</li>
	<li>レーザーがサンプルをカットできない場合は、レーザーパワーを上げなさい。あるいは、レーザーを複数回適用することができる。さらに、ターゲットに不完全なカットのスポットがないか調べ、[移動とカット]オプションを使用してこれらのスポットの線を再描画します。後続のスライドの解剖用にレーザー設定を保存します。</li>
	<li>形態学的基準に基づいて遠位大腿骨の環状または皮質骨の骨細胞、骨細胞、骨細胞および骨の内層細胞を選択する。UVレーザーによる損傷を最小限に抑えるために、ターゲットセルから遠く離れたレーザーパスの線を引きます。染色後1時間以内にすべての微小切除を行う。</li>
	<li>各セルタイプを0.5 mLチューブの別個のキャップに集みます。 注:液体回収の代わりに乾燥捕捉は、RNAの劣化を回避することができる。さらに、マイクロ遠心管のキャップに含まれる非常に少量のバッファーは、LCM中に蒸発または結晶化(その組成に応じて)することができます。</li>
	<li>LCM後の回収管キャップを観察して捕獲の成功を確認する。RNA 抽出を直ちに続行します。</li>
</ol>5. RNA抽出
<ol><li>β-メルカプトエタノールを含むリシスバッファーの50μLを回収管のキャップに分配し、キャップ内で1分間ピペッティングしてサンプルを分解し、ライサートをスピンダウンし、β-メルカプトエタノールを含むリシスバッファーの300μLをチューブに加えます。複数のキャップをプールする場合は、RNA 抽出キット (材料の表)に推奨されるバッファーの総量に注意してください。 注意:β-メルカプトエタノールは、RNAを分解から保護するために添加する必要がありますが、それは有毒であると考えられています。防護服や手袋を着用し、フードの中で作業します。</li>
	<li>また、各スライドについて、β-メルカプトエタノールを含む350μLのリシスバッファーを有する1.5mLマイクロ遠心分離管を標識した1本を調製する。LCMの後に残っているセクションを使用してRNAを抽出します。フィルムを膜から慎重に分離し、ゆっくりとセクションにリシスバッファーを数回ピペッティングすることにより、サンプルをlyseします。 注:リシスバッファーの総量は350 μLでなければなりません。それはスライドから流れ出るように消化のために一度にそれをすべて使用しないでください。</li>
	<li>
ライサテサンプルをドライアイスに入れ、-80°Cに保存します。 注:プロトコルはここで一時停止できます。</li>
	<li>RTで溶融物を解凍し、LCM採取細胞から集採取管から1.5mLマイクロ遠心管にリサットを移す。複数のキャップを使用してサンプルを採取した場合は、複数のライサットをプールします。</li>
	<li>製造元の指示に従って RNA を抽出します。DNase Iでカラムを処理し、ゲノムDNAを除去します。14 μLのRNaseフリー水を含む溶出RNAを、12μL溶出物を生じる。RNAを-80°Cに保存します。 注:プロトコルはここで一時停止できます。</li>
</ol>6. RNA歩留まりと完全性の測定
<ol><li>湿った氷の上でRNAを解凍します。マイクロキャピラリー電気泳動を用いて、単離されたRNAの収量と完全性を測定します。製造元の指示に従って、総RNA(サンプル1μL)をチップ(材料の表)にロードします。</li>
</ol>

<ol><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+laser+microdissection+technology%3A+follow+the+yellow+brick+road+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research.</a> American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).</li>
<li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+Big+data+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+histopathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li>
<li>Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+laser+capture+microdissection+with+quantitative+real-time+PCR%3A+effects+of+tissue+manipulation+on+RNA+quality+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).</li>
<li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li>
<li>Golubeva, Y. G., Warner, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Microdissection+Workflow+for+Isolating+Nucleic+Acids+from+Fixed+and+Frozen+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).</li>
<li>Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Method+for+Robust+Transcriptome+Profiling+of+Minute+Tissues+Using+Laser+Capture+Microdissection+and+Low-Input+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185(2017).</li>
<li>Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+protocol+for+gene+expression+analysis+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).</li>
<li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot%27s+film+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).</li>
<li>Streicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+Regulates+Bone+Turnover+by+Targeting+RANKL+Expression+in+Bone+Lining+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6460(2017).</li>
<li>Vaidya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast-specific+overexpression+of+amphiregulin+leads+to+transient+increase+in+femoral+cancellous+bone+mass+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice.</a> Bone. 81, 36-46 (2015).</li>
<li>Jay, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiregulin+lacks+an+essential+role+for+the+bone+anabolic+action+of+parathyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).</li>
<li>Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+Osteocytic+Fgf23+Secretion+Contributes+to+Pyrophosphate+Accumulation+and+Mineralization+Defect+in+Hyp+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice.</a> PLoS Biology. 14 (4), e1002427(2016).</li>
<li>Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmented+Fibroblast+Growth+Factor-23+Secretion+in+Bone+Locally+Contributes+to+Impaired+Bone+Mineralization+in+Chronic+Kidney+Disease+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 311(2018).</li>
<li>Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Frozen+Sample+Preparation+for+Laser+Microdissection%3A+Assessment+of+CryoJane+Tape-Transfer+System%C2%AE%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66854(2013).</li>
<li>Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection+and+Transcriptional+Analysis+of+Sub-Populations+of+the+Osteoblast+Lineage+from+Undecalcified+Bone%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).</li>
<li>Nioi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Profiling+of+Laser+Capture+Microdissected+Subpopulations+of+the+Osteoblast+Lineage+Provides+Insight+Into+the+Early+Response+to+Sclerostin+Antibody+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).</li>
<li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+time-dependent+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+in+cortical+bone+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone Reports. 8, 95-103 (2018).</li>
<li>Taylor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+cellular+and+transcriptional+changes+in+the+osteoblast+lineage+associated+with+sclerostin+antibody+treatment+in+ovariectomized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats.</a> Bone. 84, 148-159 (2016).</li>
<li>Martin, L. B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+of+tomato+fruit+cell+and+tissue+types+for+transcriptome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).</li>
<li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), e56(2005).</li>
<li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).</li>
<li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42(2014).</li>
<li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC Cell Biology. 11, 95(2010).</li>
<li>Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahalingam%2C+M+%22Laser+Capture+Microdissection%3A+Methods+and+Protocols%22">Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols</a>. Murray, G. I. , Humana Press. New York, NY. 1-17 (2018).</li>
<li>Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+quality+RNA+retrieved+from+samples+obtained+by+using+LMPC+%28laser+microdissection+and+pressure+catapulting%29+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology%2C+Research+and+Practice%22%5BJournal%5D)">High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology.</a> Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).</li>
<li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li>
<li>Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li>
<li>Kölble, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+LEICA+microdissection+system%3A+design+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The LEICA microdissection system: design and applications.</a> Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).</li>
<li>Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbeam+MOMeNT%3A+non-contact+laser+microdissection+of+membrane-mounted+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).</li>
<li>Micke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluid+cover+medium+provides+superior+morphology+and+preserves+RNA+integrity+in+tissue+sections+for+laser+microdissection+and+pressure+catapulting%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting.</a> The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

RNAの質および量は両方とも、組織操作、LCMプロセス、RNA抽出などのサンプル調製のすべての段階で負の影響を受ける可能性があります。そこで、その後の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るためにLCMプロトコルを開発した。
LCMの場合、ほとんどの実験室ではセクション7−8 μm厚さ2を使用しています。より厚いセクションは、より多くの材料を収穫することを可能にします。しかし、厚すぎると顕微鏡分解能が低下し、レーザーが切り抜けることができない場合があります。最適な組織厚さは、使用されるLCMシステム(およびレーザーおよびスライドタイプ)、ならびに質問8、25の組織に依存する可能性が高い。本研究では、異なる厚さの凍結切片(4、8または12 μm)を試験した。8 μm 厚の断面はLCMに最適であることが判明し、12μmの骨切片はレーザーで切断するのがより困難であり、4μmの断面はRNAの量を少なぞった。
<p class="jove_c...

組織は、異種および空間的に分散した細胞タイプで構成されています。特定の組織内の異なる細胞タイプは、同じシグナルに異なる反応を示す場合があります。したがって、生理学的および病理学的条件の両方における異なる細胞型の役割の評価のために特定の細胞集団を単離できることが不可欠である。レーザー捕捉微分解子(LCM)は、複雑な組織1から指定された細胞を分離および除去するための比較的迅速かつ正確な方法を提供する。LCMシステムは、レーザービームの力を使用して、酵素処理や培養中の増殖を必要とせずに組織組織切片から目的の細胞を分離します。これは、細胞が自然組織の生息地にあり、異なる細胞間の空間的関係を含む組織構造が保持されていることを意味します。捕捉された細胞と残留組織の両方の形態はよく保存され、複数の組織成分を同じスライドから順次サンプリングすることができます。単離された細胞は、その後、そのRNA、DNA、タンパク質または代謝産物含有量2、3のその後の分析に使用することができる。
異なる細胞集団における遺伝子発現を分析するためには、または異なる処置後に、その後の分析4、5に対して十分な品質および量のmRNAを得る必要がある。DNAとは対照的に、RNAは固定に敏感であり、目的がRNAを研究する場合は凍結組織の使用が推奨されます。mRNAはユビキタスリボヌクレアーゼ(RNase)によって急速に分解されるので、試料の取り扱いや調製時の厳格なRNaseフリー条件と室温でのサンプルの保管を回避する必要があります。さらに、長期の水相段階を伴わずに迅速な技術は、RNAの劣化を防ぐために重要である6.RNAの歩留まりと完全性は、LCMプロセスおよび使用されるLCMシステム7、8の影響を受ける可能性もある。現在、動作原理が異なる4つのLCMシステムが利用可能です2.RNA抽出の方法は、異なるRNA単離キットがRNA量および品質7、8の有意な差で試験されているので、重要である場合もある。
任意の組織調製方法は、良好な形態コントラストを得ることと、さらなる分析のためにRNAの完全性を維持することとの間のバランスを見つける必要があります。骨から凍結切片を作製するために、粘着フィルムを開発し、継続的に改善した9.骨のセクションは、粘着フィルム上で直接切断され、染色されます。この粘着フィルムは、多くのタイプの染色に適用可能であり、LCM9、10、11、12、13を使用して骨凍結切除から目的の細胞を分離するために使用することができる、 14.外科的除去、埋め込み、凍結、切断および染色を含むすべてのステップは1時間以内に完了することができる。重要なことに、破骨細胞、骨内層細胞、および破骨細胞などの細胞は、9、10、11、12、13、14を明確に同定することができる。この方法は、迅速かつ簡単であるという利点があります。骨凍結切片を生成するための別の方法は、テープ転送システム15を使用することです。しかし、後者の技術は、より時間がかかり、セクションは、紫外線(UV)架橋によって前コーティングされた膜スライドに粘着テープから転送する必要があるため、追加の器械使用を必要とします。テープ転送システムはLCM16、17、18、19と正常に結合されていますが、架橋コーティングは背景パターンを作成できることに留意すべきです。細胞型識別20を妨害する可能性があります。
典型的には、微小解剖細胞から少量のRNAのみが抽出され、RNAの質および量は、しばしばマイクロキャピラリー電気泳動21によって評価される。コンピュータプログラムは、RNA整合性番号(RIN)と呼ばれるRNA抽出物に品質のインデックスを割り当てるために使用されます。RIN 値 1.0 は完全に分解された RNA を示し、10.0 の値は RNA が完全に22であることを示します。通常、5を超えるインデックスはRNA研究に十分と考えられています。RIN値が5.0−10.0のサンプルにおける遺伝子発現パターンは、互いに23とよく相関することが報告されている。この方法の感度は高いが、総RNAの50pg/μLが検出できるため、試料中のRNA濃度が非常に低い場合に品質評価を得ることは非常に困難である。したがって、RNA品質を評価するために、LCM後に残存する組織部は、多くの場合、スライド24上にバッファをピペッティングすることによってRNAを抽出するために使用される。
LCMは異なる凍結組織に広く使用されていますが、抽出されたRNAのRIN値が報告されることはほとんどありません。さらに、マウスの骨中のRNAを研究するための最も適切な方法を明らかにする比較研究はありません。本研究では、成虫マウス大腿骨からの凍結切片を用いて、高品質のRNAを得るためにサンプル調製、LCMプロトコルおよびRNA抽出を最適化した。本プロトコルは、特にサンプル収集に重力を使用するLCMシステム用に最適化された。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Σ</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>無水エタノール EMPLURA</td><td>メルク ミリポア</td><td>8,18,76,01,000</td><td></td></tr><tr><td>接着フィルム (LMDフィルム)</td> <td>Section-Lab</td><td>C-FL001</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 バイオアナライザーシステム</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus HistoGene 染色溶液</td><td>Applied Biosystems</td><td>12241-05</td><td></td></tr><tr><td>クライオフィルムフィッティングツール</td><td>Section-Lab</td><td>C-FT000</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット ライカ CM 1950</td><td>ライカバイオシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡 スライド、カット カラー つや消しオレンジ</td><td>VWR ライフサイエンス</td><td>631-1559</td><td></td></tr><tr><td>組織学 組織金型 PVC</td><td>MEDITE</td><td>48-6302-00</td><td></td></tr><tr><td>LMD7&nbsp;レーザー&nbsp;ミクロディセクション&nbsp;システム</td><td>ライカ マイクロシステム</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>ロー プロファイル ミクロトーム ブレード ライカ DB80 XL</td><td>ライカ バイオシステム</td><td>14035843496</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>VWR ライフサイエンス</td><td>E476-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PET メンブレン スライド 1.4 &mu;m</td><td>分子機械 &Industries GmbH</td><td>50102</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away surface decontaminant</td><td>Molecular BioProduct</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 最適切断温度 (OCT) 化合物</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>VWR ライフサイエンス</td><td>2,89,73,363</td><td></td></tr></tbody></table>

新鮮な凍結マウスの骨から高品質のrnaを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNAの収率と完全性は、RNA分析の決定的な方法です。しかし、多くの場合、レーザーキャプチャマイクロディスセクション(LCM)手順全体を通じてRNAの完全性を維持することは技術的に困難です。LCM研究は少量の材料で動作するため、限られたRNA収率に関する懸念も重要です。そこで、骨細胞の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るためにLCMプロトコルを開発しました。染色プロトコルの効果は、凍結切片の厚さ、微分解組織量、RNA抽出キット、および微小解剖骨細胞から得られるRNA収率および完全性に用いられるLCM系を評価した。8μm厚の凍結骨切片を粘着フィルムを用いて作製し、市販のLCM染色のための迅速なプロトコルを使用して染色した。試料をポリエチレンテレフタレート(PET)膜と粘着フィルムとの間に挟み込んだ。サンプル採取に重力を用いたLCMシステムとカラムベースのRNA抽出法を用いて、十分な収率の高品質RNAを得た。現在の研究は、マウス大腿骨のセクションに焦点を当てています。しかしながら、ここで報告されるLCMプロトコルは、生理学的条件および疾患プロセスの両方における任意の硬質組織の細胞におけるその状態遺伝子発現における研究に用いることができる。

マウス大腿骨の骨細胞における遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るためにLCMプロトコルを開発した。最適化されたプロトコルでは、8 μm厚の凍結骨切片を粘着フィルム上で切断し、市販のLCM凍結部染色のための迅速なプロトコルを使用して染色した。試料をPET膜と粘着フィルムとの間に挟み込んだ。マウス骨細胞は、サンプル採取に重力を用いたLCMシステムを用いて微小分解剖した。カラムベースのRNA抽出法を用い、十分な収率の高品質RNAを得た。単離されたRNAの収率および完全性は、マイクロキャピラリー電気泳動を用いて測定した(図1)。
異なるlysisプロトコルを用いて得られたRNAの質および量の違いは、代表的なゲルおよびエレクトロフェログラムで見ることができる。試料をキャップ内で上下に1分間溶解させた場合、1mm2マイクロ解剖骨組織(8μm厚部)からRNAの約8.5ngを分離することができた。RIN値は8.60(図2)でした。
<p cl...

骨細胞の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るために、レーザー捕捉微細解剖(LCM)プロトコルが開発されました。現在の研究は、マウス大腿骨のセクションに焦点を当てています。しかしながら、ここで報告されるLCMプロトコルは、任意の硬質組織の細胞における遺伝子発現を研究するために使用することができる。

新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

自然環境内の特定の骨細胞の遺伝子発現解析にレーザー捕捉マイクロ解剖の力を利用することを考えたことがありますか?ここでは、マウスの骨のクライオセクションから十分な量の高品質RNAを得ることができるプロトコルについて説明します。この技術は、遺伝子組み換えマウスモデルや疾患モデルにおける特定の骨細胞における遺伝子発現の変化を調べる素晴らしいツールです。ここで説明するプロトコルは、マウスの骨に焦点を当てていますが、任意の種の任意の硬い組織の細胞における遺伝子発現をその際に研究するために使用することができます。この手順を実証するのに役立ちます, クリスチャンシューラー, 私の研究室からの技術者になります.全身麻酔下でマウスを排泄してマウスを安楽死させた後、大腿骨全体を迅速に除去する。周囲の軟組織の大腿骨をきれいにするためにメスとペーパータオルを使用してください。次に、最適な切断温度化合物を埋め込み型に注ぎ、大腿骨を埋め込み金型の底に入れます。液体窒素でサンプルを凍結スナップします。サンプルが完全に凍結したら、ホイルで包み、ドライアイスで冷凍庫に移します。さらに処理する準備ができるまでマイナス80°Cで保管してください。まず、クライオスタットの温度をマイナス19°C、ブロックホルダーの温度をマイナス17度に設定します。次に、70%エタノールでクライオスタットの内部を拭き取ります。硬い組織、ガラススライド、および冷却するために凍結スタットにフィッティングツールのための使い捨てブレードを置き、切断の間、クライオスタットの中に保管します。凍結した組織ブロックをドライアイス上の凍結した組織ブロックをクライオスタットに移し、少なくとも10分間平衡化させます。次に、埋め込み金型の底部を押して、OCT ブロックを金型から押し出します。ブロックホルダに十分なOCT培地を適用してブロックを固定し、OCTメディアが完全にフリーズするまで待ちます。この後、ブロックホルダーをオブジェクトホルダーに入れ、所定の位置に締めます。ブレードの位置を調整し、ブロックを15マイクロメートルの切削増分でトリミングして、サンプルを覆うOCTを取り除きます。クライオスタットを調整して8マイクロメートルのセクションを生成し、廃棄される2〜3つのクライオセクションをカットします。ブロックに粘着フィルムを置き、フィルムをブロックに付着させるためにフィッティングツールを使用します。さて、フィルムによってセクションを保持しながら、ゆっくりと一定の速度でカットを行います。サンプルの解凍を避けるために、クライオスタット内のクライオバーの上にあらかじめ冷却されたガラススライドの上にサンプルを上に向けてフィルムを置きます。テープを使用してフィルムをガラススライドに固定し、染色を容易にします。ヒュームフードで、テキストプロトコルで概説されているように、エタノール、RNaseフリー水、および氷上のキシレンの必要な溶液を準備します。95%エタノールで30秒間インキュベートする。その後、RNaseフリーの水のセクションを慎重に30秒間浸してOCTを完全に取り除きます。次に、50マイクロリットルの市販LCM凍結セクション染色をセクションに分配し、室温で10秒間インキュベートします。スライドの端を吸収性のティッシュペーパーの上に置いて、セクションを排水します。100%エタノールで30秒間リンスし、余分な汚れを取り除きます。100%エタノールを含む第2のチューブに骨切片を30秒間浸し、30秒間100%キシレンに移します。粘着フィルムを支材としてドライガラススライドに貼り付け、できるだけ平らにしてください。この後、フィルム上にPET膜フレームスライドを置き、フィルムに取り付けるために膜上に手袋をした指を短く押します。このサンプルは、膜と粘着膜の間に挟まれる。接着フィルムは折り畳んだりしわを入れたりしてはならないし、膜と膜の間に気泡があってはならない。表面デコン剤を使用してステージエンドキャップホルダーを清掃します。スライドをスライドホルダーに、キャップをキャップホルダーに取り付けます。次に、フォーカスを調整し、1.25xの目的でスライドの概要を取得します。40xの目標に変更し、フォーカスを調整します。スライドの概要を使用して、対象領域を選択します。次に、ここに示すようにレーザーパラメータを調整し、各目的に合わせてこれらのパラメータを最適化します。レーザーでサンプルのカットに失敗した場合は、レーザーパワーを上げます。形態学的基準に基づいて、遠位大腿骨の概観または皮質骨の骨芽細胞、骨形成細胞、骨内皮細胞を選択します。ターゲットセルから遠ざかるようにレーザー経路の線を引き、UVレーザーによる損傷を最小限に抑えます。レーザーがサンプルを切断できない場合は、レーザーを複数回適用するか、不完全な切り傷のスポットのターゲットを検査し、移動と切断オプションを使用してこれらのスポットの組織を切断します。各セルタイプを別々の0.5ミリリットルチューブキャップに集める。まず、βメルカプトエタノールを含む50マイクロリットルのリシスバッファーを回収管のキャップに分配する。キャップの中でサンプルを1分間上下にピペットしてライスします。次に、ライセートをスピンダウンし、β-メルカプトエタノールを含むリシスバッファーの00マイクロリットルをチューブに加えます。各スライドに対して、βメルカプトエタノールを含む350マイクロリシスバッファーを用いた標識されたマイクロ遠心分離管を調製する。LCMの後に残っているセクションを使用してRNAを抽出します。膜から膜を慎重に分離し、数回セクションにリシスバッファーをゆっくりとピペットすることによってサンプルを分解します。その後、ライセートサンプルをドライアイスに入れ、マイナス80度で保存します。続行する準備ができたら、室温でライセートを解凍します。その後、コレクションチューブのLCM採取細胞から新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにライセートを移し、メーカーの指示に従ってRNAを抽出します。本研究では、マウス大腿骨の骨細胞における遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るために、LCMプロトコルが開発された。LCMは、サンプル収集に重力を使用するLCMシステムを使用して実行されます。単離されたRNAの収率と完全性をマイクロキャピラリー電気泳動を用いて測定した。異なるライシスプロトコルを用いて得られるRNAの質と量の違いは、代表的なゲルおよびエレクトロフェログラムでここで見ることができます。試料をキャップ内で上下に1分間ピペットして分解すると、1平方ミリメートルのマイクロディセプトされた骨組織から約8.5ナノグラムのRNAを単離することが可能です。RIN 値は 8.60 です。あるいは、LCMは、焦点が合っていないレーザーパルスを使用するLCMシステムを使用して実行され、材料を張り出した粘着キャップにカタパルトします。新鮮な凍結した骨の場合、マイクロディセクテッドされた骨組織の1平方ミリメートルから約1.6ナノグラムのRNAを単離することが可能です。RIN 値は 1 です。結論として、この手順で覚えておくべき最も重要なことは、正しい方法で立っているプロトコルを適用し、サンドイッチ複合体内のセクションの完全な乾燥を防ぎ、適切なLCMシステムを使用し、細胞を収穫するための時間制限を超えないことです。捕獲された細胞からRNAを単離したら、RNAシークなどによって発現プロファイリングにRNAを使用できます。最後に、キシレンとβ-メルカプトエタノールはフードの下で取り扱う必要がある有害物質であることを思い出させてください。また、液体窒素やクライオトームブレードの取り扱いには適切な注意をしてください。

a-laser-capture-microdissection-protocol-that-yields-high-quality-rna

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

マウス脳の特定の領域におけるRNA発現プロファイリングには、正確で再現性のある組織採取戦略が必要です。ここでは、冠状断による脳切断と組織コーラーを用いたマイクロダイセクションの両方を併用するプロトコルについて説明します。得られたサンプルから抽出した全RNAの収量と品質により、本手法の有用性が確認されています。...

トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

高品質の総RNAは、70%エタノールでAzure Bで脊髄部を染色した後、レーザー捕捉マイクロ解剖によってマウス脊髄運動ニューロンの細胞体から調製された。3,000~4,000個の運動ニューロンから十分なRNA(約40~60...

レーザー捕捉マイクロ解離によるマウス脊髄運動ニューロン細胞体からの転写解析のためのRNAの生成

特定の組織中の細胞のサブセットの遺伝子発現解析は、主要な課題である。この記事では、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで迅速な免疫標識法を組み合わせることにより、特定の細胞集団から高品質のトータルRNAを分離する方法について説明します。...

迅速な免疫標識と合わせてレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、細胞特異的な亜集団からのRNAの単離

ここでは、実験用マウスから後肢の長骨(大腿骨と脛骨)を解剖するためのプロトコルを提示します。さらに、骨髄空間から骨髄を除去するために遠心分離を利用する、これらの骨からの骨髄分離のための迅速な技術について説明します。...

マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離

連続凍結切片を、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いた遺伝子発現の測定のための組織学的応用およびRNAの濃縮を可能にするために収集されます。直接アプリケーション間で比較され、プールされた凍結切片と測定30mgの - 高品質のRNAが20から得られます。...

遺伝子発現と組織学的分析のためにシングルマウス骨格筋の連続領域の凍結切片化

ここでは、下流の RNA 解析のための小柱網 (TM) を隔離するため再現性のあるレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) のためのプロトコルについて述べる.TM での遺伝子発現の変化を分析する能力は、TM...

遺伝子発現解析のためのマウスの目から非常に純粋な小柱網のキャプチャ マイクロダイゼクション

このプロトコルは、視覚化し、キャプチャ レーザーマイクロダイ死後人間小脳から新鮮凍結組織におけるプルキンエ細胞を分離する染色無料のアプローチを使用します。このプロトコルの目的は、RNA 配列のため質の高い RNA...

ステンレス高品質レーザーからの RNA の隔離のプロトコルをキャプチャ人間死後小脳 Microdissected プルキンエ細胞

このプロトコルは、マウス胚の新鮮な凍結切片から軟骨および骨を分離するためのレーザー捕捉マイクロセクションを記述する。軟骨および骨はクレシルバイオレット染色によって急速に視覚化され、正確に集めることができるので、トランスクリプト工学的分析のための高品質のRNAを得ることができます。...

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

レーザーマイクロディション(LMD)は、グリオーマの不均一性と侵入を媒介する経路を明らかにするために使用できる、敏感で再現性の高い技術です。ここでは、レーザーLMDを用いて、トランスクリプトーム解析を用いて、グリオーマ組織から離散領域を分離するための最適化されたプロトコルについて述べている。...

腫瘍性異種性、オンコストリーム、および浸潤の空間・分子特性解析のための神経膠腫部分領域のレーザー捕捉微小切除

ここでは、新たに得られた骨組織の脱灰と高品質なRNAの保存を可能にする方法について述べます。また、脱灰されていない骨のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプルを切片化して、新鮮な組織が利用できない、または採取できない場合に高品質の結果を得る方法も示されています。...

骨組織の空間的トランスクリプトミクスを可能にする方法

本プロトコルは、パラホルムアルデヒド固定および最適切断温度化合物埋め込みマウス肝組織の定義された組織領域からRNAをレーザーキャプチャマイクロ解剖を用いて単離し、ターゲットを絞った下流遺伝子発現解析を可能にする方法を説明しています。...

パラホルマルデヒド固定マウス肝組織のレーザーキャプチャ顕微解剖によるRNA解析

学ぶレーザー捕捉微解剖法を用いてマウス大腿骨から骨細胞特異的な高品質RNAを抽出する技術。遺伝子発現解析に応用でき、骨生物学研究や疾患モデル解析に有用です。

新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

さらに動画を探す