細胞毒性の評価と肺癌精密カット スライスで物質の免疫調節効果

この精密切断された肺切片の3次元モデルの全体的な目標は、ヒト組織を用いたex vivoモデルで細胞毒性と免疫調節効果を評価することです。これらの方法は、安全性を評価し、天然の人間環境における物質に対する生理学的反応を評価するために、薬理学および毒物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、新鮮で生存可能なヒト組織を使用することで、細胞毒性または免疫調節効果に関してヒト呼吸器疾患を模倣できることです。

この方法は、ヒトの細胞間相互作用、生理学、および病態メカニズムに関する洞察を得ることができますが、呼吸器疾患では、他の種だけでなく他のアプリケーションにも使用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、ヒト組織を評価し、信頼性の高いインフラストラクチャを確立する組織に苦労します。さらに、充填プロセスには、肺の不均一性のために、多くのトレーニングと経験が必要です。

この手順を開始するには、シリコンチューブを挿入し、チューブと平行なクランプで固定して気管をカニューレ挿入します。クランプがシリコンチューブと並んで組織を挟み込まずに押し込むようにします。他のすべての気管支、血管、および怪我をクランプで閉じて、充填手順中にアガロースが漏れないようにします。主気管支をカニューレに送るには、優れた解剖学的スキルが必要です。

肺を広げすぎてはいけません、そうでなければ組織が気を散らし、組織が十分に満たされていないと、組織が柔らかすぎるためにPCLSを作ることができなくなります。次に、等量の3%低ゲル化アガロースをビーカー内の培地と混合します。15ミリリットルの注射器を使用して混合物を肺に点滴します。

シリンジに培地を補充する前に、指またはクランプでカテーテルをclで閉じますamp気泡とアガロースの逆流を防ぎます。.肺組織を3〜5センチメートルのスラブに切ります。ティッシュスライサーに400ミリリットルの氷冷EBSSを入れます。

コアリングツール付きの半自動ドライバーを使用して、すぐに円筒形の組織コアを肺スラブから切り取ります。その後、ティッシュコアをティッシュスライサーのティッシュホルダーに移します。ティッシュコアの上にウェイトを置き、ティッシュコアをPCLSにスライスし始めます。

メディウムは、ガラスシリンダーのクランプを開いて、ティッシュスライサーからビーカーに排出する必要があります。次に、スライスをビーカーから培地でペトリ皿に移します。その後、ペトリ皿をインキュベーターに入れ、洗浄ステップの前に培地を温めます。

次に、肺スライスを2ウェルあたり2スライス用の最低500マイクロリットルの培養培地を備えた24ウェル培養プレートに慎重に移します。ワーキング溶液のマスターミックスを調製するには、各ウェルについて25マイクロリットルのWST-1試薬と225マイクロリットルの培地を希釈します。次に、各ウェルについてWST-1のマスターミックス作業溶液250マイクロリットルをピペットで取り、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。

インキュベーション中は、PCLSがWST-1試薬によって完全に覆われていることを確認してください。その後、プレートを200 RPMのオービタルシェーカーに置き、WST-1試薬が完全に混合されるように30秒間慎重に振とうします。次に、24ウェルプレートの各ウェルから上清100マイクロリットルを新しい平底の96ウェルプレートに二重にピペットで移します。

マイクロプレートリーダーを使用して、450ナノメートルで各ウェルの吸収を測定し、450ナノメートルの基準から630ナノメートルの吸収を差し引きます。PCLSを試験剤の有無にかかわらずインキュベートした後、50マイクロリットルの上清を重複して新しい96ウェルプレートに移します。これにより、24ウェルプレートの各処理済みウェルから重複が生成されます。

アッセイの直前に、125マイクロリットルの触媒溶液と6.25ミリリットルの色素溶液を96ウェルプレートに完全に混合することにより、LDHフリー薬剤のワーキング溶液のマスターミックスを調製します。次いで、マスターミックスの作業溶液50マイクロリットルを、既に50マイクロリットルの上清を含んでいる各ウェルにピペットで移す。プレートを暗所で室温で20分間インキュベートします。

その後、マイクロプレートリーダーを使用して492ナノメートルで各ウェルの吸収を測定し、492ナノメートルの吸収から630ナノメートルの基準で吸収を差し引きます。顕微鏡評価を行うには、cLSM を使用して、少なくとも 2 つのランダムに分布した Z スタックを実行します。「Ocular」タブをクリックして、10倍の対物レンズを選択します。

オンラインをクリックして、cLSMを標準の光学顕微鏡として使用し、PCLSの表面を見つけます。次に、[オフライン]をクリックして接眼設定を終了します。続いて、[Acquisition]タブをクリックし、蛍光色素に適したレーザーをオンにします。

「Acquisition」タブの「Light Path」をクリックし、実験に必要なフィルターとミラーを設定します。ライブボタンを押すと、対応するレイヤーのライブビューが画面に表示されます。フォーカスを上下に動かして、鋭い信号でPCLSの表面を見つけます。

その後、赤色エチジウムホモダイマー-1チャネルのピンホールを1エアユニットに設定して、集光効率と光学セクショニングの最適なトレードオフを実現し、それに応じてカルセインチャネルを調整します。ゲインの検出信号を増加させます。デジタルオフセットを増減して、チャンネルカラーロックアップテーブルがアクティブ化されたライブ画像に青で表示されるように背景を調整します。

[Zスタック]ボックスをチェックして、微視的な体積の上限と下限を設定します。30マイクロメートルの範囲に達するまでフォーカスをゆっくりと上下にシフトし、[最後に設定]を押して保存します。次に、もう一度Liveをクリックしてライブ画像を無効にし、Start Experimentを押してイメージングを開始します。

ここに示されているのは、PCLSの顕微鏡生存率画像であり、効果的な毒性物質としての洗剤に対するヒト組織の応答性を示しています。毒性影響は、カルセイン陽性組織の評価とエジウムホモダイマー-1陽性細胞核の比較によって視覚的に評価されます。ヒト肺組織の生存率はドナーによって異なりますが、生存組織と比較した死細胞核の数は、組織制御の15%を超えてはなりません。

この図は、SLSであるヘキサクロロプラチネートアンモニウムのヒト肺組織に対する免疫調節効果の代表的なデータを示しています。細胞外および細胞内のIL-1αおよびTNF-αは、ELISAによって決定され、総タンパク質含有量に正規化されました。その開発後、この技術は、薬理学および基礎科学の分野の研究者が生存可能なヒト肺組織内の生理学的応答を探求する道を開きました。

この手順に続いて、気管支拡張薬の有効性などの追加の質問に答えるために、気道狭窄などの他のエンドポイントを実行できます。このビデオを見れば、精密に切断されたヒトの肺切片を作製し、処理する方法について、一般的な理解が深まるはずです。一度習得すると、このテクニックは6〜8時間以内に行うことができ、適切に実行すれば、最初の結果は最初の24時間以内に利用可能になります。

ただし、人間の固定されていない材料を扱う作業は感染性がある可能性があるため、この手順を実行するときは常に防護服などの予防策を着用する必要があることを忘れないでください。さらに、可能な限り無菌条件下で作業することを忘れないことが重要です。