大ボリューム内の特定の細胞内標的を見つけるため連続切片的階層構造イメージング

このワークフローの全体的な目標は、光学顕微鏡を使用して組織内の超微細構造イメージングの特定のターゲットを特定し、続いて非常に高い解像度でSEMで3Dイメージングを行うことです。ここで紹介するイメージングワークフローは、細胞生物学、発生生物学、神経科学、さらには病理学など、多くの分野における細胞または組織の超微細構造に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、実際にはアレイ断層撮影に基づいており、組織を連続セクションの配列にスライスすることで、最初は元のサンプルボリューム内に埋もれていたターゲット構造を簡単に特定できることです。

アレイトモグラフィーはもともと神経科学の文脈で導入されましたが、細菌、植物、動物、さらには病理学の患者サンプルなど、他のさまざまなシステムにも適用できます。この方法に不慣れな個人は、多くのシリアルセクションを収集するのが非常に難しいため、苦労するでしょう。追加のサポートなしで作業すると、セクションが失われたり、リボンが乱れたりする可能性があります。

つまようじに固定された数本の毛から形成された小さなブラシを使用して、事前にトリミングされたブロックの前側と後部を接着剤混合物で慎重にコーティングします。この混合物の溶媒は数秒で蒸発するため、この手順を迅速に実行してください。サンプルが乾燥している間に、シリコンウェーハ片をナイフボートに収まるサイズにカットし、ダイヤモンドスクライバーで印を付けます。

次に、シリコンウェーハをイソプロパノールと糸くずの出ないティッシュで手動で洗浄します。取り外し可能な接着剤を使用して、基板をキャリアプレートの一端に固定します。固まったら、プラズマは空気によるグロー放電を使用して基板を活性化し、親水性の表面を取得します。

取り付けられた基板をナイフエッジに近づけた状態で、キャリアをクランプに挿入しますamp 基板ホルダーの。次に、ナイフホルダーにジャンボダイヤモンドナイフを差し込み、クリアランス角度を0度にします。次に、ナイフボートに蒸留水を入れます。

サンプルから1〜2ミリメートル離れるようにナイフに近づきます。次に、基板ホルダーの1〜3本のネジを使用して、基板を水中に下げます。ウォーターラインが基板の上3分の1に位置していることを確認します。

シリコンウェーハを使用すると最低地上高が見えにくいため、基板が床に触れると感じるまで基板を下げてください。その後、基板を少し持ち上げます。カット中は、基板もキャリアもナイフボートに触れないようにしてください。

次に、シリンジまたはピペットを使用してボート内の水位を調整します。双眼鏡で観察しながら、水面の全領域がウルトラミクロトームの上部光照明の均一な反射を示すまで、水を追加または削除します。セットアップが完了したら、サンプルのセクショニングを開始します。

いくつかのセクションがカットされたら、セクショニングプロセスを停止し、まつげまたは非常に柔らかい猫の毛でナイフのエッジを優しくなでて、ナイフの刃からリボンを解放します。リボンを基板に向かって操作し、リボンの最初のセクションをそっと押して、基板の乾燥部分に取り付けます。サンプルの切片化とリボンの基板への取り付けを続けます。

基板の片側から始めて、新しいリボンごとに反対側に向かって徐々に移動します。基板がリボンで完全に覆われたら、基板ホルダーのマイクロマニピュレータネジを使用して、ナイフボートから基板をそっと持ち上げます。リボンアレイを乾かしてから、ほこりのない環境に保管してください。

乾燥後、接着剤で実装された基板をできるだけ早くキャリアから取り外してください。次に、付属のテキストプロトコルに記載されているように、サンプルを光学顕微鏡用に染色し、イメージングを行います。次に、電子顕微鏡用にサンプルを染色し、粘着性のあるカーボンパッドでアルミニウムスタブにマウントします。

次に、これらのアレイを電界放出型走査電子顕微鏡で画像化します。帯電を避けるためには、3kV以下の一次電子エネルギーと50〜800ピコアンペアのビーム電流を使用してください。ITOコーティングされたガラスカバースリップを使用する場合は、導電性表面を銅テープと銀塗料で顕微鏡キャリアに接続してください。

階層イメージングカスケードの最初のステップは、個々のセクションを認識できるようにアレイの概要を生成することです。まず、各コーナーの画像を低倍率 (約 100 倍) でグラフ化して配列の 4 つのコーナーを定義し、次に配列全体を囲む ROI を作成します。このROIにイメージングプロトコルを割り当て、以下のパラメータを使用します。

二次電子検出器を用いると、0.2マイクロ秒程度の短い滞留時間で高速イメージングができます。大きな画像のピクセル サイズと 2000 x 2000 ピクセルのタイル サイズを選択します。その結果、非常にノイズの多い画像になりますが、ここでも切片内の組織が見えています。

次に、関心領域を作成し、最初のセクションの組織だけを概説して、セクションセットを生成します。スタンプツールを使用して、後続のすべてのセクションにクローンを作成します。必要に応じて、曲がったリボンに対応するために、関心領域を回転させます。

組織の下部構造を最もよく表示するセクションにプロトコールを割り当てます。ここでは、60ナノメートルの中間ピクセルサイズ、12000×12000ピクセルのタイルサイズ、および3.2マイクロ秒の滞留時間を使用しました。品質が悪いため、選択したいくつかのセルを概説する2番目のセクションセットは、より小さなピクセルサイズとより感度の高い検出器を使用して作成されました。

これで、2つの標的細胞を非常によく認識することが可能になりました。ターゲット構造を含むセクションセット内に、より高解像度のSEMイメージング用のサイトセットを作成します。関心領域を、ステージングされた精度を考慮するのに十分な大きさにします。

サイトの位置を確認して調整します。オートチューニングは、多くのセクションが画像化されている場合に必要です。中心が構造的な詳細(液胞など)のない空の材料の上に座らないように、関心領域を配置することが重要です。

次に、オートフォーカス設定を定義し、イメージングするサイトに近い小さな関心領域でリボンの長さにわたるイメージングパフォーマンスを確認します。次に、高分解能SEM取得のためのイメージングプロトコルを定義します。メンブレンコンパートメントを表示するには、3ナノメートルから5ナノメートルの画像ピクセルサイズを選択します。

検出器に応じて滞留時間を選択し、画像のノイズが多すぎないようにします。ステージはこのセクションとこのセクションの録画の間に長い距離を移動する必要があるため、check プロトコル オプションを使用して、各リボンの少なくとも最初のセクションでフォーカス値を定義します。次に、一連の対象領域全体に対して自動SEMイメージングを開始します。

終了したら、取得したデータを画像シリーズとして、できればTIF形式でエクスポートします。画像シリーズを仮想スタックとしてフィジーにインポートします。次に、対象の構造にできるだけ近い領域をトリミングして、スタックをトリミングしてさらに処理します。

また、明るさとコントラストを調整してスタックを保存します。トリミングして最適化したら、[ファイル]メニューから新しいTrakEMを開きます。画像フィールドを右クリックし、スタックをレイヤーごとに1つのスライスとしてTrakEMにインポートします。

右クリックして、[レイヤーの整列]を選択します。モードとして最小二乗法を選択し、範囲を最初から最後まで設定し、参照としてなしを選択します。次に、デフォルト設定の値を選択し、目的の変換として[リジッド]を選択します。

登録が完了して問題がなければ、右クリックして[エクスポート]を選択し、整列したデータセットを保存します。フラットな画像を作成し、最初の画像から最後の画像までの範囲を設定し、ソフトウェアに結果のスタックを表示させます。終了したら、スタックをTIF形式で保存します。

準備後、セクション配列は、シリアルセクションのいくつかのリボンで構成される配列として表示されます。このセクションでは、ヨウ化プロピジウムで染色されたシロイヌナズナの根の先端の概要を示します。このサンプルのシーケンシャルセクションは、プロトコルで説明されているように位置合わせされ、サンプルが 3D で 1 つのムービーファイルとして表示されるように結合されました。

ここでは、後でSEMでナノメートルの分解能で画像化される2つのターゲット細胞を見ることができます。酢酸ウラニルとクエン酸血中による追加染色後、アレイを電子顕微鏡で画像化しました。この静止画像は、最初に20ナノメートルの解像度でイメージングされたサンプルセクションと、2回目のイメージングラウンドで5ナノメートルの解像度でイメージングされたサンプルセクションを示しています。

ここでは、電子顕微鏡からの210枚の連続画像を、プロトコルに記載されているように整列させ、トリミングしました。このビデオは2つの細胞のみを対象としており、細胞内の液胞がどのように配置され、場合によっては3Dで接続されているかを示しています。ここに示すSEMのアレイの自動階層イメージングは、アレイ全体の概要から細胞内の詳細まで、さまざまな分解能レベルでシームレスなマッピングを提供できます。

最高倍率では、液胞、ミトコンドリア、核、小胞体が認識できます。マスターすると、セクションリボンを一般的な基板に並べて配置することは、適切に実行されれば数時間で行うことができます。これにより、イメージングのために1つの基板上に数百のセクションが提供される場合があります。

このような多数の切片のイメージング時間は顕微鏡によって異なり、お気に入りのイメージング機器の自動化レベルが異なる場合はなおさらです。興味深いことに、一般的なワークフローは、標準的なヒスト染色やカンドルミネッセンスなどの他のイメージング技術と簡単に組み合わせることができますし、単に大量の関節構造イメージングのためのスタンドアロンツールとしても使用できる点です。このワークフローのもう一つの側面は、アクセスのしやすさです。

初期の研究は、追加のツールや自動化がなくても、つまり大きな投資をしなくても実現可能です。このビデオを見れば、ワークフローと、マルチモーダルイメージングと階層イメージングを使用して、さまざまな解像度レベルの大きな3Dボリューム内の興味深い構造をターゲットにし、イメージングする方法について理解できるはずです。