Name: 大ボリューム内の特定の細胞内標的を見つけるため連続切片的階層構造イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学ぶ連続切片的階層構造イメージング法により、組織内の特定細胞標的を光顕微鏡と走査型電子顕微鏡で高解像度に可視化する手法。この方法は細胞生物学や神経科学など幅広い分野で応用可能です。

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この仕事は、教育・研究、プロジェクト MorphiQuant 3 D ドイツ連邦環境省から補助金 FKZ 13GW0044 によって支えられました。テクニカル サポートありがとうカロリン バーテルス。

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キットには、基板ホルダーの機能モデルの供給のための Boeckeler メンツによる払い戻しを受けています。マレーネ Thaler はツァイス顕微鏡 gmbh 社は、この資料に記載されている顕微鏡システムのメーカーの従業員です。さらに、ツァイスはツァイス アトラス SEM と FIB SEM の楽器のための大面積、3 D イメージング アプリケーションの広い範囲のソリューション パッケージなど特定のソリューションを提供しています。他のすべての著者が明らかにする何もあります。

マルチ モーダル階層が組織内の特定のセルを対象にワークフローを示した: 連続切片、特注基板ホルダーを用いた導電性基板上に配置されたアレイに樹脂包埋標本をスライスします。ラベリング、fluorophore および FLM で画像処理、再生ボリュームが標的細胞を選択するため使用されます。後にコントラストを紹介する重金属ラウンド追加染色, 自動化されたソフトウェア プラットフォームを使用して SEM でナノスケールの分解能でいくつかの百のセクションこれらのターゲットが作成されます。
いくつかの長いリボンで密集配列を生産するには、ここで説明したような基板ホルダーが必要です。熟練した、患者の人は、いくつかのリボンを付けるナイフ ボート半浸漬シリコン基板と基板上に座っている、リボンまで徐々 に水のレベルを下げることによって配列を取得することがあります。しかし、私たちの経験、基板ナイフ ボート (cf. 注プロトコルに 1.3.2 で) の任意の部分に触れているときに形成を粉砕する傾向があります。さらに、この手順は難しく ito 基板: (1) 伊藤ガラスの透明性のためリボンの両端が添付される; が、水のエッジを参照してくださいすることは困難です。(2) と ito の表面は非常に洗練されたシリコンウエハよりはるかにざらざら、リボン リフト アウトいくつかのセクションから成る小さな断片が浮かぶかもしれないしセクションの順序をこのように破壊の間に壊れる傾向にあります。
ワークフロー全体 FLM データに相関することがなく可能です。この場合、いくつかのセッションで実行する、SEM でのデータ収集があります。初期の 3 D 再構成または少なくとも低または中程度の解像度のデータの評価のターゲットを識別する必要があります。また、明視野 LM の従来の組織学的汚れ、(要求しない FLM) を適用する可能性があります。もちろん、その他オプション6,7,8 18での初期の論文ですでに実証として、アレイにラベルまたは遺伝子蛍光タンパク質 (XFPs) をエンコードまたはラベルを埋め込み済み抗体試料中の蛍光の温存。
議論法の一般的な制限は、特定の厚さのセクション、3 D ボリュームの結果として得られる離散サンプリングの使用: SEM セクション表面 (d からのみデータを収集するために、Z の解像度をセクションの厚さと同じくらい良いのみすることができます選択したプライマリ エネルギー/着陸エネルギー epending)。つまり、結果として得られる 3D ボリュームが例えば異方性ボクセル。、100 nm3場合 100 x 5 x 5 nm のセクションと 5 の画像ピクセル サイズ nm を使用。1 μ m 以下のサイズの範囲で非常に小さなエンティティは、これは真の微細構造の説明のために十分はない可能性があります。技術的な制限は、自動化イメージング、SEM で使用段階の精度です。このため、完全なターゲット領域がイメージ化されることを保証するためステージ精度の仕様よりも大きな ROI を選択する必要は。
相関 AT に比べて SBF SEM と FIB SEM ブロック顔画像処理方法として、上記の異方性ボクセルの決定的な欠点があります。FIB-SEM、適切なドリフト補正されている場合、5 nm3 x 5 x 5 の等方性ボクセルを取得できます。
配列の準備中のセクションの損失による再建された量のギャップは、SBF SEM や FIB SEM. が検出されない懸念もあります。接着剤によって、良いリボン安定化と、通常リボンの最後のセクションの唯一の問題はある: まつげを使用してナイフエッジから離すときは破損している可能性があります。しかし、我々 の経験ですべての 20-50 のセクションで 1 つのセクションの損失は画像の位置合わせに影響しません。
その一方で、後の配列を染色する可能性使うと良好な信号と SEM 用もここに示すルート ヒントを冷凍高圧など弱くメタライズド サンプルのコントラスト。したがって、多数の化学固定法と配線の手順によって最適な微細構造保全を妥協する必要はありません。また、金属の中間程度で病理学研究室からルーチンのサンプルは、優れたデータ10を提供します。このようなポスト埋め込みコントラスト強調は一般的に SBF SEM と FIB SEM のため不可能です。さらに、これらのメソッドは破壊的なので、すなわちイメージング、異なる解像度でサイト画像階層または時間の後で、繰り返されるイメージング中にサンプルを消費することはできません。原則として、大きな FOVs (例えば、コネクトミクス全体のマウスの頭脳の複数のミリメートルまで) から成る、無制限のボリューム作成モザイクをステッチで、AT 中 100 μ x 100 μ m を超えて FOVs FIB SEM によるセクションの膨大な数を得ることができます。ルーチンの楽器と達成するために困難です。
説明でワークフローのさらなる自動化 SBF SEM と FIB SEM の上記の方法を実行両方区分および完全に自動化された方法で同じ楽器内イメージングので決定的な利点であります。断面のオートメーションの 1 つの種類が存在する:、ATUMtome12を生成し、セクションの何千もの収集が、カプトン テープの使用基板はこのような配列、FLM の画像に困難。ここで使用される ito の coverslips にも超解像イメージングが可能なはず。自動化のためのさらに、非常に望ましいターゲットを FLM データ スタックの記録となります。その一方で、オートメーションが高くなり、基板ホルダーを除くここに示すワークフローに依存している (ハードウェア) の面でのみ計測ルーチン EM 研究所または中核施設、ロウで通常利用可能なアクセスのレベルします。

大量の超微細構造の解像度で組織を再構築するため SEM に基づくさまざまなイメージング手法の数は、使用される1をされている: 包括的なレビューは利用できる例えばSBF SEM2、FIB SEM3、および配列のために、。(AT)4断層撮影。後者の方法のサンプル素材は、基板上のシリアル セクションの配列として保存されて、しながら SBF SEM FIB SEM は、破壊的な方法は、サンプル ブロックに取り組んでいるイメージング中にかかります。SEM で樹脂の充電のため強くメタライズド サンプル ブロック5にも依存します。
その一方で、特定の細胞または組織サンプル内の対象の構造体を識別すると、相関光と電子顕微鏡 (クレム)6,7,8から特に利益することができます。これは蛍光信号9を消すだろうから重金属の大量のアプリケーションを排除する対象 FLM を使用します。このような少しメタライズド サンプルのみ AT が選択の方法です配列は、LM のイメージング後重金属染色後簡単に場合がありますので。また、AT のほぼすべてのサンプルの型を使用する、日常も採取病理学者の宝箱10。
AT のもう一つの大きな利点は、階層11または多重解像度画像12の可能性: 高解像度で、すべてのイメージを必要はありません (例えばFLM) 異なるモダリティや、目標を選択可能性がありますように、低解像度の SEM 画像。高解像度組織またはセル人口の興味深い領域のみを画像デジタル データ ストレージ領域を節約し、は扱いやすい、小型のイメージ データ セットが生成されます。ここでは、AT ワークフローはむしろ弱くメタライズド サンプルを使用して示されて: 親水性の樹脂に埋め込まれた高圧冷凍植物の根 (シロイヌナズナ)。
配列を準備、ステンド グラス、FLM の SEM、イメージ画像のスタックは、登録方法などを説明しています。また、FLM ボリュームの 3 D 復元を使用して、ナノスケールの分解能 SEM イメージングのための特定のセルを選択する方法を示しています。

<table><tbody><tr><td>Instrumentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>RMC</td><td>PT-PC</td><td>の代替品:ライカUC7</td></tr><tr><td>基板</td><td>ホルダーRMC</td><td>ASH-100</td><td>代替品:自家製</td></tr><tr><td>のプラズマ</td><td>クリーナーDiener</td><td>Zepto 40kHz</td><td>代替案:Ted Pella Pelcoまたはその他のベンチトッププラズマクリーナー 40kHzジェネレーター(0-100W)を備えたDienerZeptoのパラメーターの例。0.5 mbar、5 sccm(空気)、10%の性能&nbsp;</td></tr><tr><td>広視野蛍光光学顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td>代替: ライカ、ニコン、オリンパス</td></tr><tr><td>蛍光フィルターセット</td><td>ツァイス</td><td>43 HE (Cy3/DsRed)</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>ツァイス</td><td>ツァイス ネオフルアー 40x</td><td>&nbsp;0.75 NA</td></tr><tr><td>GBサイズの画像データを</td><td></td><td></td><td></td>処理できるまともなワークステーション</tr><tr><td>FESEM</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td>代替案:FEI、Jeol、Hitachi、TESCAN</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Sectioning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>剃刀刃</td><td>プラノ</td><td>T585-V</td><td></td></tr><tr><td>トリミング用ダイヤモンドナイフ45°;</td><td>トリミング用珪藻</td><td>DTB45</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドナイフ90°;</td><td>Diatome</td><td>DTB90</td><td></td></tr><tr><td>珪</td>素<td>DUJ3530</td><td></td><td>の珪</td></tr><tr><td>素のウエハー(部分)</td><td>Si-Mat</td><td>カスタムメイド</td><td>ドーピングのためのジャンボ ダイヤモンド ナイフ: P/Bor、オリエンテーション: <100>、厚さ:525 &plusmn;25 &マイクロ;m、抵抗率:1-30 &Omega;-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td></tr><tr><td>ITOコーティングカバースリップ</td><td>Balzers</td><td>Type</td><td>Z 22 &times; 22 &times; 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td></tr><tr><td></td><td>Aluminium carrier カスタムメイド</td><td></td><td>76 &times; 26 mm</td></tr><tr><td>ウェーハ鉗子</td><td>Ideal-tek</td><td>34A.SA</td><td></td></tr><tr><td>スタブ鉗子</td><td>デュモン</td><td>0103-2E1 / 2-PO-1</td>デュ<td>モクセル-H 2E 1/2</td></tr><tr><td>ダイヤモンドスクライバー</td><td>プラノ</td><td>T5448</td><td></td></tr><tr><td>まつげ/非常に柔らかい猫の髪</td><td>自作</td><td></td><td>代替品:プラノ</td></tr><tr><td>ブラシ</td><td>自作</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パテックス接触接着剤</td><td>パテックス</td><td>PCL3C</td><td>クラフトクレバークラシック(黄色がかったもの)</td></tr><tr><td>フィクソガム</td><td>基板をキャリアに固定するための</td><td>マラブ</td><td>290110001</td></tr><tr>基板<td>をキャリアに固定するための</td><td>粘着テープ</td><td>3M</td><td>851</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>ベルントクラフト</td><td>07029.4000</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>カールロス</td><td>4436</td>接着剤<td>混合物用のシンナー</td></tr><tr><td>ロチヒストール</td><td>カールロス</td><td>6640</td><td>代替品、リモネンベースのシンナー</td></tr><tr><td><ストロング>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>画像処理</td><td>オープンソース</td><td>フィジー (http://fiji.sc/#download)</td><td></td></tr><tr><td>画像取得</td><td>Zeiss</td><td>Atlas 5 AT (Zeiss SEM用モジュール)</td><td>自動画像取得の代替手段: WaferMapper:</td></tr> <tr><td>https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.htmlName</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>ストック溶液:0.1%アジ化ナトリウムで1.5 mM</td></tr><tr><td>ウラニル酢酸</td><td>科学サービス</td><td>E22400</td><td></td></tr><tr><td>鉛(II) 硝酸塩メル</td><td>ク</td><td>107398</td><td></td></tr><tr><td>三クエン酸ナトリウム二水和物</td><td>メルク</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>NaOHペレット</td><td>メルク</td><td>106469</td><td></td></tr><tr><td>1M NaOH溶液</td><td>ベルントクラフト</td><td>01030.3000</td><td></td></tr><tr><td>ガラスペトリ皿</td><td>デュラン</td><td>23 755 56</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Mount<ingstrongstrong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stubs</td><td>Plano</td><td>G301F</td><td></td></tr><tr><td>カーボンパッドプラ</td><td>ノ</td><td>G3347</td><td></td></tr><tr><td>銅テープ</td><td>プラノ</td><td>G3397</td><td>両面接着剤、導電性</td></tr><tr><td>シルバー ペイント</td><td>プラノ</td><td>G3692</td><td>アチソン エレクトロダグ 1415M</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ソリューション/混合物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コーティングブロック</td><td></td><td></td>用接着剤混合物 <td>パテックス接触接着剤/キシレンをシンナーとして、比率1:3. (キシレンの代替品:Rotihistol)</td></tr><tr><td>レイノルズクエン酸</td><td></td><td></td>鉛<td>50mL: 硝酸鉛(II)1.33gをdH2O. 10mLにクエン酸三ナトリウム二水和物1.76gを溶解します dH2O. ミックス溶液が透明になるまで1 M水酸化ナトリウムを加えます. dH2Oを50mLまで満たします。</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム染色液</td><td></td><td></td><td>dH2O. Vortex のストックから 1:1500 希釈液を調製し、適切に混合します。</td></tr><tr>酢酸<td></td><td></td><td>ウラニル水</td><td>3 % 酢酸ウラニルを dH2O に溶解します (よく混ぜます)。</td></tr></tbody></table>

大ボリューム内の特定の細胞内標的を見つけるため連続切片的階層構造イメージング

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

光と電子顕微鏡の組み合わせを使用して階層的なイメージングによる混合細胞またはティッシュ内の微細構造の解像度で特定のセルをターゲットを実現できます。樹脂に埋め込まれたサンプルは超薄切片の何百ものリボンで構成される配列に分割、シリコンウエハや伝導コーティング coverslips の部分に堆積しました。配列は、fluorophores が付いている分類後広い場蛍光顕微鏡 (蛍光光学顕微鏡 (FLM)) または光学顕微鏡 (LM) 急速な大面積の概要については、スマート フォンのカメラのようなデジタル家電を使用して低解像度で作成されます。重金属で染色後、走査型電子顕微鏡 (SEM) の配列が作成されます。ターゲットの選定は、FLM によって生成された 3 D 再構成や蛍光マーカーが利用できない場合、中間解像度で SEM 画像のスタックから作られた 3 D 再構成から可能です。微細構造の解析に選択したターゲットは最終的にで高分解能 SEM に記録されます (数ナノメートル画像ピクセル)。どんなウルトラミクロトームに後付けすることができますリボン処理ツールが示されています。これのアレイ生産および断面のナイフ ボートから基質除去に役立ちます。SEM で配列の自動イメージングを可能にするソフトウェアプラット フォームを説明しています。シリアル ブロック面 SEM (SBF SEM) または集束イオンビーム (FIB SEM)、SEM などの EM の大きなボリューム データを生成する他の方法と比べてこのアプローチには 2 つの主要な利点: (1) スライスしたアップ バージョンではいえ、樹脂包埋試料は保存されています。それはさまざまな方法で染色し、解像度の異なるイメージを作成できます。(2) セクションが後に汚すことができると、重金属と強くブロック染色サンプルを使用して SEM 画像のコントラストを紹介または導電性組織ブロックをレンダリングする必要はありません。これにより、メソッドがさまざまな材料と生物学的質問に適用されます。特にプレフィックス付きの材料など、銀行生検と病理研究所から直接埋め込みでき 3 D で再構築します。

ワークフローは、レジン ブロックに埋め込まれているサンプル (図 1) 開始を紹介します。サンプル準備の間にいくつかの重金属を組織に導入する必要がありますが、それはむしろ強い金属化用に最適化されたプロトコルを使用する必要はありません。図 1 aは、(クレス) ブロック - 従来で染色 1% OsO4と 1% 酢酸ウラン、図 1 bでのシロイヌナズナ根が弱だけ中にメタライズド 0.5% 酢酸ウラニルを扱う植物の根を示しています。後者のサンプルの種類は、蛍光を抑制する傾向があるいくつかの重金属相関アプローチに最適です。専用基板ホルダー (図 2)、いくつかの百セクションの配列することができます (図 1) を生成します。蛍光標識後そのような配列標準ワイド フィールド FLM (図 1) のイメージを作成し、重金属ソリューションで染色、解像度が異なる (図 1E-G) SEM のイメージします。
再現性の高い世代のアレイのための重要なツール、基板上にミクロトームのナイフの船からいくつかのリボンを配置するときに特に、基板ホルダー (図 2 a、筆者らの研究室ではカスタム設計された) とジャンボ ダイヤモンド顕微鏡スライド (図 2 b) に対応するのに十分な大きさのボートを持つナイフ。フラット メニスカス、リボンの良い観測を許可する必要があるし、基板のプラズマ クリーニングによって達成することができます: 蒸留水の小さな液滴は、図 2 (未処理基板) のように基板上のレンズのような構造を形成してはいけません(図 2 D、プラズマ活性化基板) 薄膜が。Ito coverslip の乾燥部分に接続されているリボンが簡単にこれらの条件の下で (図 2 e) を可視化しを観察、水から基板のリフト アウト時に制御します。
例として、FLM (図 3 a) 標準的な広い視野を持つアレイ propidium ヨウ化植物細胞壁にラベルを付けるとステンド グラスをイメージしました。セクションのみ 100 nm の厚さでも、過剰染色ここで示すように、少しぼかしを紹介します。登録後、再建されたボリュームに完全に囲まれている 2 つのセルが 3 D で高分解能イメージングのための画像のスタック (図 3 b) から選ばれた (また見なさい補足ムービー S1)。次の追加染色ウラニルのアセテートおよび鉛のクエン酸と、配列をイメージしました、SEM の3 C を図60 nm イメージ ピクセルで記録、概要が表示されます画像の中心の暗い正方形は、オート フォーカス機能を実行すると、追加投与量は、わずかな汚染につながった位置を示します。これらの連続切片 (435 スライスの 51 に 248 をスライス、合計で) に、適切な 5 nm 画像ピクセル サイズで記録された FLM スタックで選択した 2 つのターゲット細胞を含む (図 3 D;映画 S2 の補足も参照してください。)。
ここで説明した SEM 内のアレイの自動化された階層的なイメージングは、ソフトウェア/ハードウェア プラットフォーム ソリューション ツァイス アトラス 5 で行われました。まず、アレイ全体の概要と SE 検出器を使用して作成された非常に大きな (1,000 nm) 画像のピクセルと非常に低い滞留時間 (図 4 a)。組織のみをまとめた投資収益率は最初の部分に配置され、配列のすべての他のセクションに反映されます。このセクションの設定は 60 nm イメージ ピクセル (図 4 b) 長い滞留時間を使用して記録されます。最後に、2 つのターゲット細胞プラスワン ステージの不正確さを考慮して細胞を周囲の「層」を含むサイト セットは、次のパラメーターがセットアップされました: ESB (後方散乱エネルギー選択) 検出器、5 nm イメージ ピクセル、非常に長い (40 μ s) に住む (の時図 4)。このような画像をズームイン空胞 (V)、(M) のミトコンドリア、核 (N) 小胞体 (矢印) など細胞レベル下の詳細 (図 4) を示しています。1 つの標的細胞の細胞内の細部に全体の配列の概要からズームインの補足映画 S3も参照してください。
(200 のセクション) を示す配列に加えて、追加生産する約 8 h を取った 250 セクションの 1 つ、FLM で (手動で) 記録する LM、および 1 日のために 1 泊。合計では、個々 のアレイの数に応じて約 1-2 時間を取る後染色します。アトラスの実行を設定する必要が SEM の記録、数時間と自動記録された h 3-4、高分解能 (5 nm ピクセル サイズ) の約 5 日間中間解像度 (60 nm ピクセル サイズ) セクション セット (200 のセクション、450 x 200 μ m2) 投資収益率(200 のセクション、55 x 30 μ m2) の 2 つのターゲット細胞を含みます。ここで示したサンプルの低金属含有量が、ため暗黙的に指定 (現在利用可能な検出器) 40 μ s のドウェル時間高解像度の投資収益率の良好な信号対雑音検出を到達するために非常に遅いスキャン速度が持っていた注意してください。
落とし穴になりやすい全体のワークフローにいくつかの手順があります: 理想的にはリボンがもっとまたはより少なくまっすぐと (図 5 a) 正しい順序で配置をする必要があります。ただし、ベント (図 5 b)、曲線 (図 5)、または壊れたリボンがしばしば生産されます。不適切なトリミング (リーディング エッジとトレーリング エッジない正確に平行)、または非一様に適用接着剤による非対称または不均一浸透したサンプルからも可能性があります。特に面倒なサンプルは、非常にハードとソフトの両方のコンポーネントを含みます。後者のコンポーネント (図 5) を示す植物の根の細胞壁などに侵入することは困難があります。その場合は、ひだ (矢印) はすることができます簡単に可変圧縮と区分の間に弛緩によって引き起こされます。自動イメージング、SEM、Roi はリボンの曲率に合わせて回転できるので曲線リボンは大きな問題ありません。
プロトコルの別の重要なステップを染色: 不十分な洗浄することができますセクション (図 5 e, F) の残基につながるし、最悪の場合 (図 5 階で 2 つのターゲットのセルの 1 つ上の円) の最も興味深い領域をカバーします。また、塵 (図 5、光強散乱粒子)、例えば、ナイフ ボートに汚い基板キャリアで導入は、深刻な問題を引き起こす可能性が: FLM では、ほこりを高輝度にすることができます (cf.補足的な映画のいくつかのスライスS1) いくつか登録アルゴリズムが機能しないそのような程度。ただし、TrakEM17 「整列」機能は、補足ムービー S1に示すようこのようなスタックを処理できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> 図 1: 相関の階層的なイメージングのためのワークフロー 。樹脂ブロック (A、強くメタライズド サンプル) に埋め込まれたサンプルから始まって、サンプルを最初トリミング (B、弱くメタライズド サンプル) して、配列に配置連続切片 (C) のいくつかのリボンで構成され、ここで、Ito coverslip、ウルトラミクロトームを使用して生成されます。蛍光色素で染色後画像のスタックは、広視野 FLM (D) に記録されます。塩さらに重金属のラウンドを染色後スタックが異なる解像度 (イメージ ピクセル サイズ) で SEM (電子-G) で作成されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> 図 2: 配列の準備のためのツール。基板ホルダーは標準ウルトラミクロトーム (A) に接続されている動きの 7 軸マニピュレーターから組み立て: 円で強調表示されます、ネジが上下 (1) と水平方向の動き (2) および (3) 基板のキャリアの傾斜.プラズマ活性化ウェーハ マウント スライド サイズのアルミ キャリア (B) の部分でここ (矢印) の大型基板に対応する大型船とジャンボ ダイヤモンド ナイフ。20 μ L の滴蒸留水は、未処理のシリコン ウエハー基板 (C) または (D) プラズマ活性化基板上に配置されます。4 リボンの下の端、ito coverslip に接続されたナイフ ボートに浮かんでいます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> 図 3: LM データと SEM データの相関します。FLM (A, B) と (A, C) の概要と標的細胞 (B、 D) 記録と SEM (C, D)。ソフトウェア ズームであり、元のデータが真実を示す 5 nm イメージ ピクセル サイズで 60 nm イメージ ピクセル サイズ、および (D) と (C) を記録しながらの 1,388 × 1,040 ピクセル カメラ チップの 40 倍の対物レンズで記録された (B)SEM での解像度の増加<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> 図 4: ツァイス アトラス 5 でを使用して SEM でイメージング階層1,000 nm 画素 SE 検出器 (A) を使用して、配列の概要を記録しました。セクションはすべてのセクションで組織に配置され、60 nm イメージ ピクセル (B) と記録の ROI を設定します。サイトを標的細胞に置かれ、5 nm イメージ ピクセル (C) で記録されたシリアルの ROI を設定します。このような高解像度画像 (D) にズームすると、液胞 (V)、(N) の核、ミトコンドリア (M) 小胞体 (矢印) などの細胞内膜コンパートメントが表示されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> 図 5: 典型的な問題。1. セクショニング プロセスに起因: 断面中に ito coverslips は理想的なストレート (A) ですが、不規則な圧縮にリボンがもひだ (C) または曲線リボン (D)、ベント (B) を引き起こす可能性があります。2. 断面と染色中と水、例えば、リボンの基板の処理によって引き起こされる: 散乱粒子を基板 (D)、セクション ( e円)、または汚れの液滴の縁に不十分なため組織にまみれて(F) を染色後の洗浄。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足ムービー S1: FLM 画像のスタックします。435 画像はフィジー16 TrakEM17を使用して整列し、動画ファイル (.avi) として保存されます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足映画 S2: SEM 画像のスタックします。210 のイメージは、フィジー16 TrakEM17を使用して整列されます。このデータ セットの元のスタック (300 画像) は、15 GB でした。それは x でスケーリングされた (後で配置および 2 つのターゲット細胞のみにトリミング) 3.3 GB からスタックを小型化して 0.2 倍 y フィジーを使用し、その .avi ムービーとして保存します。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足映画 S3: SEM で解像度の異なるレベルを持つズーム映画に作成され、.mp4 形式でアトラス 5 ソフトウェアからエクスポートします。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

このプロトコルは、走査型電子顕微鏡 (SEM) を用いたナノスケールの分解能でイメージングのための組織の特定のセルを対象します。多数の生物学的素材の樹脂包埋切片に SEM で階層的にし、ターゲットを識別するために光学顕微鏡でされる最初

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

このワークフローの全体的な目標は、光学顕微鏡を使用して組織内の超微細構造イメージングの特定のターゲットを特定し、続いて非常に高い解像度でSEMで3Dイメージングを行うことです。ここで紹介するイメージングワークフローは、細胞生物学、発生生物学、神経科学、さらには病理学など、多くの分野における細胞または組織の超微細構造に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、実際にはアレイ断層撮影に基づいており、組織を連続セクションの配列にスライスすることで、最初は元のサンプルボリューム内に埋もれていたターゲット構造を簡単に特定できることです。アレイトモグラフィーはもともと神経科学の文脈で導入されましたが、細菌、植物、動物、さらには病理学の患者サンプルなど、他のさまざまなシステムにも適用できます。この方法に不慣れな個人は、多くのシリアルセクションを収集するのが非常に難しいため、苦労するでしょう。追加のサポートなしで作業すると、セクションが失われたり、リボンが乱れたりする可能性があります。つまようじに固定された数本の毛から形成された小さなブラシを使用して、事前にトリミングされたブロックの前側と後部を接着剤混合物で慎重にコーティングします。この混合物の溶媒は数秒で蒸発するため、この手順を迅速に実行してください。サンプルが乾燥している間に、シリコンウェーハ片をナイフボートに収まるサイズにカットし、ダイヤモンドスクライバーで印を付けます。次に、シリコンウェーハをイソプロパノールと糸くずの出ないティッシュで手動で洗浄します。取り外し可能な接着剤を使用して、基板をキャリアプレートの一端に固定します。固まったら、プラズマは空気によるグロー放電を使用して基板を活性化し、親水性の表面を取得します。取り付けられた基板をナイフエッジに近づけた状態で、キャリアをクランプに挿入しますamp 基板ホルダーの。次に、ナイフホルダーにジャンボダイヤモンドナイフを差し込み、クリアランス角度を0度にします。次に、ナイフボートに蒸留水を入れます。サンプルから1〜2ミリメートル離れるようにナイフに近づきます。次に、基板ホルダーの1〜3本のネジを使用して、基板を水中に下げます。ウォーターラインが基板の上3分の1に位置していることを確認します。シリコンウェーハを使用すると最低地上高が見えにくいため、基板が床に触れると感じるまで基板を下げてください。その後、基板を少し持ち上げます。カット中は、基板もキャリアもナイフボートに触れないようにしてください。次に、シリンジまたはピペットを使用してボート内の水位を調整します。双眼鏡で観察しながら、水面の全領域がウルトラミクロトームの上部光照明の均一な反射を示すまで、水を追加または削除します。セットアップが完了したら、サンプルのセクショニングを開始します。いくつかのセクションがカットされたら、セクショニングプロセスを停止し、まつげまたは非常に柔らかい猫の毛でナイフのエッジを優しくなでて、ナイフの刃からリボンを解放します。リボンを基板に向かって操作し、リボンの最初のセクションをそっと押して、基板の乾燥部分に取り付けます。サンプルの切片化とリボンの基板への取り付けを続けます。基板の片側から始めて、新しいリボンごとに反対側に向かって徐々に移動します。基板がリボンで完全に覆われたら、基板ホルダーのマイクロマニピュレータネジを使用して、ナイフボートから基板をそっと持ち上げます。リボンアレイを乾かしてから、ほこりのない環境に保管してください。乾燥後、接着剤で実装された基板をできるだけ早くキャリアから取り外してください。次に、付属のテキストプロトコルに記載されているように、サンプルを光学顕微鏡用に染色し、イメージングを行います。次に、電子顕微鏡用にサンプルを染色し、粘着性のあるカーボンパッドでアルミニウムスタブにマウントします。次に、これらのアレイを電界放出型走査電子顕微鏡で画像化します。帯電を避けるためには、3kV以下の一次電子エネルギーと50〜800ピコアンペアのビーム電流を使用してください。ITOコーティングされたガラスカバースリップを使用する場合は、導電性表面を銅テープと銀塗料で顕微鏡キャリアに接続してください。階層イメージングカスケードの最初のステップは、個々のセクションを認識できるようにアレイの概要を生成することです。まず、各コーナーの画像を低倍率 (約 100 倍) でグラフ化して配列の 4 つのコーナーを定義し、次に配列全体を囲む ROI を作成します。このROIにイメージングプロトコルを割り当て、以下のパラメータを使用します。二次電子検出器を用いると、0.2マイクロ秒程度の短い滞留時間で高速イメージングができます。大きな画像のピクセル サイズと 2000 x 2000 ピクセルのタイル サイズを選択します。その結果、非常にノイズの多い画像になりますが、ここでも切片内の組織が見えています。次に、関心領域を作成し、最初のセクションの組織だけを概説して、セクションセットを生成します。スタンプツールを使用して、後続のすべてのセクションにクローンを作成します。必要に応じて、曲がったリボンに対応するために、関心領域を回転させます。組織の下部構造を最もよく表示するセクションにプロトコールを割り当てます。ここでは、60ナノメートルの中間ピクセルサイズ、12000×12000ピクセルのタイルサイズ、および3.2マイクロ秒の滞留時間を使用しました。品質が悪いため、選択したいくつかのセルを概説する2番目のセクションセットは、より小さなピクセルサイズとより感度の高い検出器を使用して作成されました。これで、2つの標的細胞を非常によく認識することが可能になりました。ターゲット構造を含むセクションセット内に、より高解像度のSEMイメージング用のサイトセットを作成します。関心領域を、ステージングされた精度を考慮するのに十分な大きさにします。サイトの位置を確認して調整します。オートチューニングは、多くのセクションが画像化されている場合に必要です。中心が構造的な詳細(液胞など)のない空の材料の上に座らないように、関心領域を配置することが重要です。次に、オートフォーカス設定を定義し、イメージングするサイトに近い小さな関心領域でリボンの長さにわたるイメージングパフォーマンスを確認します。次に、高分解能SEM取得のためのイメージングプロトコルを定義します。メンブレンコンパートメントを表示するには、3ナノメートルから5ナノメートルの画像ピクセルサイズを選択します。検出器に応じて滞留時間を選択し、画像のノイズが多すぎないようにします。ステージはこのセクションとこのセクションの録画の間に長い距離を移動する必要があるため、check プロトコル オプションを使用して、各リボンの少なくとも最初のセクションでフォーカス値を定義します。次に、一連の対象領域全体に対して自動SEMイメージングを開始します。終了したら、取得したデータを画像シリーズとして、できればTIF形式でエクスポートします。画像シリーズを仮想スタックとしてフィジーにインポートします。次に、対象の構造にできるだけ近い領域をトリミングして、スタックをトリミングしてさらに処理します。また、明るさとコントラストを調整してスタックを保存します。トリミングして最適化したら、[ファイル]メニューから新しいTrakEMを開きます。画像フィールドを右クリックし、スタックをレイヤーごとに1つのスライスとしてTrakEMにインポートします。右クリックして、[レイヤーの整列]を選択します。モードとして最小二乗法を選択し、範囲を最初から最後まで設定し、参照としてなしを選択します。次に、デフォルト設定の値を選択し、目的の変換として[リジッド]を選択します。登録が完了して問題がなければ、右クリックして[エクスポート]を選択し、整列したデータセットを保存します。フラットな画像を作成し、最初の画像から最後の画像までの範囲を設定し、ソフトウェアに結果のスタックを表示させます。終了したら、スタックをTIF形式で保存します。準備後、セクション配列は、シリアルセクションのいくつかのリボンで構成される配列として表示されます。このセクションでは、ヨウ化プロピジウムで染色されたシロイヌナズナの根の先端の概要を示します。このサンプルのシーケンシャルセクションは、プロトコルで説明されているように位置合わせされ、サンプルが 3D で 1 つのムービーファイルとして表示されるように結合されました。ここでは、後でSEMでナノメートルの分解能で画像化される2つのターゲット細胞を見ることができます。酢酸ウラニルとクエン酸血中による追加染色後、アレイを電子顕微鏡で画像化しました。この静止画像は、最初に20ナノメートルの解像度でイメージングされたサンプルセクションと、2回目のイメージングラウンドで5ナノメートルの解像度でイメージングされたサンプルセクションを示しています。ここでは、電子顕微鏡からの210枚の連続画像を、プロトコルに記載されているように整列させ、トリミングしました。このビデオは2つの細胞のみを対象としており、細胞内の液胞がどのように配置され、場合によっては3Dで接続されているかを示しています。ここに示すSEMのアレイの自動階層イメージングは、アレイ全体の概要から細胞内の詳細まで、さまざまな分解能レベルでシームレスなマッピングを提供できます。最高倍率では、液胞、ミトコンドリア、核、小胞体が認識できます。マスターすると、セクションリボンを一般的な基板に並べて配置することは、適切に実行されれば数時間で行うことができます。これにより、イメージングのために1つの基板上に数百のセクションが提供される場合があります。このような多数の切片のイメージング時間は顕微鏡によって異なり、お気に入りのイメージング機器の自動化レベルが異なる場合はなおさらです。興味深いことに、一般的なワークフローは、標準的なヒスト染色やカンドルミネッセンスなどの他のイメージング技術と簡単に組み合わせることができますし、単に大量の関節構造イメージングのためのスタンドアロンツールとしても使用できる点です。このワークフローのもう一つの側面は、アクセスのしやすさです。初期の研究は、追加のツールや自動化がなくても、つまり大きな投資をしなくても実現可能です。このビデオを見れば、ワークフローと、マルチモーダルイメージングと階層イメージングを使用して、さまざまな解像度レベルの大きな3Dボリューム内の興味深い構造をターゲットにし、イメージングする方法について理解できるはずです。

multimodal-hierarchical-imaging-serial-sections-for-finding-specific

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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走査型電子顕微鏡互換光学イメージング法によるメソスコーピック全細胞脳マッピング

学ぶ連続切片的階層構造イメージング法により、組織内の特定細胞標的を光顕微鏡と走査型電子顕微鏡で高解像度に可視化する手法。この方法は細胞生物学や神経科学など幅広い分野で応用可能です。

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